Les stéroïdes, notamment les stéroïdes dérivés du cholestérol, sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques parmi lesquels on peut citer la régulation des taux de glucides et cholestérol dans la circulation sanguine, le maintien et développement de la masse musculaire, le développement du système nerveux central.

Parmi les inconvénients observés en cas de dérèglement des taux de stéroïdes circulants, on peut citer le déclenchement éventuel de maladies auto- immunes, telles le lupus, de certains cancers, par exemple le cancer du sein, de maladies cardiovasculaires, par exemple l'athérosclérose. Des problèmes de régulation de stéroïdes sont également soupçonnés'dans le cas du déclenchement de certaines maladies neurologiques tels les maladies de Parkinson ou d'Alzheimer.

Les stéroïdes, notamment l'hydrocortisone, peuvent être utilisés en tant qu'agents thérapeutiques en tant que tel ou comme compléments dans d'autres traitements. Ainsi, les dérivés de synthèse des glucocorticoïdes sont utilisés pour leurs actions anti-inflammatoires et, à fortes doses, immunosuppressives.

L'obtention des stéroïdes est actuellement liée à des procédés d'extraction ou de synthèse coûteux. John Warcup Cornforth a été le premier à réaliser la synthèse totale d'un stéroïde, le cholestérol, par une méthode enzymatique.

Toutefois, il est important de disposer d'une méthode permettant d'obtenir les stéroïdes d'intérêt, notamment les dérivés du cholestérol, à un prix abordable.

Un certain nombre de protéines impliquées dans la biosynthèse des stéroïdes ont été exprimées chez la levure. Ainsi, le brevet EP 360 361 démontre l'activité des protéines P450 17a et P450c21 chez la levure Kluyvero7Xxyces lactis. De même, il a été décrit la possibilité de conversion in vivo de 11 deoxycortisol en hydrocortisone dans une levure génétiquement modifiée exprimant la P450cll (Dumas et al., 1996), ainsi que la production de 17a-hydroxyprogestérone à partir de prégnénolone chez la levure (Degryse et al., 1999). De plus Duport et al. (Duport

et al., 1998) ont décrit la synthèse de prégnénolone et de progestérone dans une levure génétiquement modifiée. Il a également été décrit dans la demande de brevet WO 99/40203 que l'inactivation du gène ATF2 dans une souche de levure permet d'éviter l'acétylation des stéroïdes produits par cette souche.

La présente invention permet de réaliser la synthèse de stéroïdes, par la fermentation de souches de levures génétiquement modifiées, en présence d'une source de carbone simple. La méthode proposée par la présente invention permet donc d'obtenir une grande quantité de stéroïdes d'intérêt, à faible coût, puisque le procédé met en oeuvre la fermentation de levures et l'ajout d'une source de carbone simple, facilement disponible dans le commerce.

Définitions : Par source de carbone simple, selon la présente invention, on entend des sources de carbone utilisables par l'homme du métier pour la croissance normale d'une levure. On entend désigner notamment les différents sucres assimilables, tels le glucose, le galactose ou le saccharose, ou les mélasses, ou les sous-produits de ces sucres. Une source de carbone simple tout particulièrement préférée est l'éthanol et le glycérol.

Par dérivé d'un stéroïde, on entend désigner, selon la présente invention, un composé pouvant être obtenu, notamment par une ou deux réactions enzymatiques ou chimiques, à partir dudit stéroïdes. On entend particulièrement désigner les stéroïdes acétylés, hydroxylés, ou portant un substituant tel qu'un dérivé halogéné (fluor, iode), ou un groupe méthyle.

Les problèmes à résoudre pour pouvoir produire des stéroïdes dans un micro-organisme sont de différentes sortes : - il convient d'éliminer les réactions parasites pouvant être observées en raison de la présence d'enzymes endogènes dans le microorganisme choisi, - il convient d'introduire les gènes permettant la modification des intermédiaires de synthèse de telle façon que les niveaux d'expression obtenus soient aussi proches que possible des niveaux observés chez les mammifères. Ainsi, recréer les bons équilibres est une condition importante de la réussite d'un tel projet,

- il convient d'obtenir un niveau d'expression des différents gènes permettant d'orienter préférentiellement la biosynthèse vers le stéroïde choisi.

La synthèse des stéroïdes est une suite de réactions extrêmement complexes, mettant en jeu plusieurs enzymes pour obtenir le cortisol à partir du cholestérol.

Il convient d'abord de produire le 20,22 dihydroxycholestérol, qui est alors transformé en prégnénolone, elle-même hydroxylée en 17-a hydroxy-prégnénolone.

Celle-ci est alors transformée en 17-a hydroxy-progestérone, qui donne le désoxycortisol, menant au cortisol (hydrocortisone).

Une voie alternative consiste en production de prégnénolone, puis de progestérone, transformée en 17-a hydroxy-progestérone.

Il a été montré que l'on peut produire de la prégnénolone dans la levure, à partir d'une source de carbone simple, (Duport et al., 1998, dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande). Pour ce faire, il a été nécessaire de supprimer une voie endogène (par disruption du gène A22-stérol-désaturase (ERGS) de la voie de biosynthèse endogène des ergostérols), afin d'obtenir une accumulation de produits saturés en C-22. En effet, l'ergostérol normalement fabriqué par la levure diffère du cholestérol par une insaturation en C-7 (8) du noyau B, une insaturation en C-22, et un groupe méthyle additionnel en C-24. Ainsi, les produits saturés en C-22, et en C-7 dans le noyau B peuvent être utilisés comme substrats par les enzymes situées dans la chaîne de production du cortisol.

La présente invention permet de réaliser la synthèse de stéroïdes, et notamment les stéroïdes situés plus en aval que la prégnénolone, de façon simple, par la fermentation de souches de levures génétiquement modifiées, en présence d'une source de carbone simple. Dans un cas particulier de l'invention, les stéroïdes synthétisés sont excrétés dans le milieu de culture, ce qui simplifie leur purification.

La méthode proposée par la présente invention permet donc d'obtenir une grande quantité de stéroïdes d'intérêt, à faible coût, puisque le procédé met en oeuvre la fermentation de levures et l'ajout d'une source de carbone simple, facilement disponible dans le commerce.

De façon préférée, les stéroïdes pouvant être produits par la souche de levure. selon l'invention sont des stéroïdes compris dans la voie de synthèse du cortisol, ainsi qu'énoncés ci-dessus. On peut également produire d'autres types de

stéroïdes, à partir de la 17-a hydroxy-prégnénolone, notamment la dihydroépiandrostérone (DHEA), par l'action de l'enzyme 17 a-hydroxylase et lyase, et les stéroïdes dérivés (androstènediones, testostérone...). Ces stéroïdes peuvent être produits par introduction des enzymes appropriées dans la souche de levure, de la même façon que pour la souche exemplifiée dans la présente invention.

Pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention, l'invention concerne également une souche de levure, génétiquement modifiée produisant un stéroïde ou un dérivé de stéroïde, caractérisée en ce qu'elle permet la production de manière autonome à partir d'une source de carbone simple.

Le fait que la production soit effectuée de manière autonome signifie qu'il n'est pas besoin de rajouter de substrats pour obtenir le stéroïde d'intérêt, mais que la levure peut le produire uniquement à partir de la source de carbone simple de départ. Il est aussi clair que la souche peut produire un stéroïde de la voie métabolique, par utilisation d'un substrat situé en amont dans la voie métabolique, dans la mesure où la souche de levure selon la présente invention contient tous les gènes nécessaires à la complétion de la voie métabolique de production des stéroïdes.

De préférence, la souche de levure selon l'invention produit un stéroïde ou dérivé de stéroïde qui est un dérivé du métabolisme du cholestérol, c'est à dire qui fait partie de la chaîne de métabolisme du cholestérol. Le métabolisme du cholestérol est bien connu de l'homme du métier, et est explicité dans les ouvrages de biochimie et d'endocrinologie.

Ainsi, de préférence, ledit stéroïde ou dérivé de stéroïde est compris notamment dans le groupe constitué de la 17a-hydroxy prégnénolone, le cortisol, la cortisone, la cortexolone, la 17a-hydroxy progestérone, et les dérivés de ces stéroïdes.

On peut également produire la prégnénolone et la progestérone avec une souche de levure selon la présente invention.

Ainsi, la présente invention a notamment pour objet une souche de levure génétiquement modifiée produisant, de manière autonome à partir d'une source de carbone simple, un stéroïde ou un dérivé de stéroïde, dérivé du métabolisme du . cholestérol, caractérisée en ce que ledit stéroïde ou dérivé de stéroïde est compris

dans le groupe constitué de la 17a-hydroxy prégnénolone, l'hydrocortisone, la cortexolone, la 17a-hydroxy progestérone, et les dérivés de ces stéroïdes.

Ainsi qu'il sera vu plus loin la souche de levure selon l'invention présente au moins une modification génétique choisie dans un groupe constitué de la disruption ou inactivation d'un gène endogène, la modification du promoteur d'un gène endogène, la duplication d'un gène endogène, l'introduction d'au moins un gène hétérologue, en une ou plusieurs copies, de façon épisomale ou chromosomale.

Il est d'ailleurs avantageux que la souche de levure de l'invention présente une combinaison desdites modifications géniques.

Ainsi qu'explicité plus loin, la souche de levure présente au moins une disruption d'un gène endogène choisi dans le groupe constitué de ERG5, ATF2, GCYI, YPR1, ARE1, ARE2, ATF1, ADE2, dans un premier mode de réalisation.

Dans un mode de réalisation préféré, la souche de levure selon l'invention présente une disruption des gènes endogènes ERG5, ATF2, ACYL, YPR1. Ainsi que décrit plus loin, ces gènes codent pour des protéines induisant des réactions parasites dans la levure.

Le gène ADE2 quant à lui peut également être disrupté de façon optionnelle, notamment pour intégrer un gène hétérologue dans la souche de levure.

Dans un mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention présente au moins un gène hétérologue intégré dans le chromosome, à au moins un locus choisi parmi ADE2, HIS3, TRPI, LEU2, GCY1, ATF2, YPR1, l'intégration étant effectuée de manière intragénique ou intergénique en voisinage immédiat avec l'un des loci.

Dans un mode de réalisation de l'invention, ladite souche de levure présente au moins un gène hétérologue situé sur un plasmide multicopie ou un plasmide à bas nombre de copies, ledit plasmide multicopie étant choisi parmi les plasmides à base d'un réplicon 2 micron de levure se répliquant dans Saccharonayces cerevisiae et ledit plasmide à bas nombre de copies étant choisi parmi les plasmides basés sur une origine de réplication ARS chromosomique avec un centromère de levure.

Pour la mise en oeuvre d'un mode de réalisation de l'invention, et ainsi que développé plus bas, la souche de levure selon l'invention présente au moins un gène ou un ADNc hétérologue choisi dans le groupe constitué du gène de la stérol A7- réductase et des ADNc du cytochrome P450 SCC, de l'adrénodoxine, de

l'adrénodoxine réductase, du cytochrome b5, de la 3p-hydrostéroïde déshydrogénase isomérase, de la cytochrome P450 réductase, du cytochrome P450 Cl7, du cytochrome P450 C21, du cytochrome P450 Cil, et des séquences codant pour ces. protéines : Ces gènes ou ADNc hétérologues sont sous le contrôle d'une séquence promotrice choisie dans le groupe constitué des séquences promotrices endogènes de levure TDH3, TEFI, PGK1, CYCI, GAL10, ATF2, TIRI, ARHI, ADE2, et du promoteur hybride GALIO-CYCI. n est nécessaire d'utiliser une séquence terminatrice pour tout gène ou ADNc hétérologue introduit, de préférence, choisie parmi les séquences terminatrices des gènes endogènes PGK1, CYC1, ATF2, ADE2, NCP1.

On obtient alors des blocs ou cassettes d'expression, qui consistent en un promoteur, le gène hétérologue (ou ADNc, éventuellement codant pour la protéine mature précédée par le codon ATG codant pour la méthionine (Met-mat) ou pour une protéine de fusion possédant éventuellement des signaux d'adressage vers des compartiments cellulaires), et une séquence terminatrice.

Dans un mode de réalisation, la souche de levure selon l'invention présente le bloc d'expression hétérologue stérol A7-réductase intégré dans le chromosome au locus ADE2.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la souche de levure comprend au moins une cassette d'expression des gènes codant pour le P450scc, adrénodoxine cofacteur du P450SCC localisée sur un plasmide à grand nombre de copies, et elle comprend une cassette d'expression de l'adrénodoxine réductase cofacteur du P450soc localisée sur un plasmide mono ou à faible nombre de copies ou intégrée dans le chromosome. De façon préférée, ces cassettes d'expression contiennent la protéine mature précédée d'une méthionine, et la protéine est localisée dans le cytosol.

Dans un mode de réalisation, la souche de levure comprend au moins une cassette d'expression choisie parmi les cassettes d'expression de la 3p- hydrostéroïde déshydrogénase isomérase, du cytochrome P450c17, du cytochrome P450c21 localisée sur un plasmide à haut nombre de copies, à faible nombre de copies ou intégrée dans le chromosome.

Dans un mode de réalisation particulier, la souche de levure selon l'invention comprend au moins une cassette d'expression pour la P45011ß située . sur un plasmide multicopie, la protéine produite présentant un signal d'adressage vers les mitochondries et/ou au moins une cassette d'expression pour l'adrénodoxine cofacteur de la P4501 1 P située sur un plasmide multicopie, avec un promoteur faible (c'est-à-dire dont la force s'apparente à celle du promoteur CYCI), la protéine produite présentant un signal d'adressage vers les mitochondries. De façon préférée, les protéines sont produites sous forme d'un précurseur, avec un signal homologue ou hétérologue d'adressage vers les mitochondries, les protéines prenant leur forme mature dans ce compartiment cellulaire.

Il est donc intéressant de noter que dans un cas particulièrement préféré de mise en oeuvre de l'invention, on introduit dans la souche de levure deux copies du gène codant pour l'adrenodoxine, l'une d'entre elles étant destinée à exprimer la protéine dans le cytosol de la cellule, l'autre étant fabriquée de telle sorte que la protéine mature se trouve dans les mitochondries.

Dans un mode de réalisation particulier, la souche de levure comprend également au moins une cassette d'expression (promoteur d'expression tel que cité ci-dessus avec la partie codante du gène NCP1, ATRI, et/ou ATR2, avec son propre terminateur ou un terminateur tel que défini ci-dessus) située sur un plasmide multicopie, à faible nombre de copies ou intégrée dans le chromosome. Les cassettes d'expression pour NCPI, ABRI, et ATR2 pourront notamment être intégrées au locus NCPI de S. cerevisiae.

Dans un mode de réalisation particulier, la souche de levure selon l'invention exprime également la protéine ARHlp, protéine homologue de l'adrénodoxine réductase des mammifères chez la levure, à un niveau supérieur au niveau d'expression physiologique. La surexpression de cette protéine peut être obtenue par des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple par l'apport d'une nouvelle cassette d'expression (promoteur d'expression, partie codante du gène ARHI avec son propre terminateur ou un terminateur tel que défini ci-dessus) en plus du gène endogène dans la levure. De manière surprenante, il a en effet été montré qu'une expression du gène ARH1 à un niveau supérieur au niveau d'expression physiologique augmente de façon significative la quantité de stéroïdes produits. Cependant cette expression ne doit pas être trop importante pour obtenir

l'effet désiré. Ainsi, si une expression de la protéine ARH1 à un niveau supérieur par rapport à un niveau physiologique est souhaitable, il faut prendre garde à ne pas surexprimer trop fortement cette protéine sous peine de perdre cette augmentation de production en stéroïdes.

La souche de levure selon la présente invention peut posséder un caractère polyploïde, diploïde, haploïde ou aneuploïde, sans que cela ne nuise à la mise en oeuvre de l'invention.

Il s'agit de préférence d'une souche de Saccharomyces cerevisiae, notamment dérivée d'une des souches FY 1679-28c, FY 1679-18b qui sont des spores de la souche FY 1679 déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro 96604.

L'invention possède également pour objet une souche de levure, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche CDR07 Mat-a ou TGY260, déposées à la CNCM le 24 janvier 2001 sous les numéros d'ordre respectifs I-2616 et 1-2615. L'invention concerne aussi une souche obtenue après croisement de CDR07 Mat-a et TGY260, et éventuellement sporulation et transformation avec un plasmide de levure, notamment les souches UCY2 et UCY4 et les souches UCY3 et UCY26 décrites dans la présente invention. L'invention a également pour objet des souches de levures obtenues après croisement de UCY2 et TGY245, et éventuellement sporulation et transformation avec au moins un plasmide de levure, notamment les souches UCY5, UCY6, UCY16, UCY19, UCY, 20, UCY24, UCY25 et UCY26 également décrites dans la présente invention.

Il est utile que la souche de levure selon l'invention possède les éléments nécessaires pour l'excrétion du stéroïde dproduit dans le milieu de culture, afin de simplifier la purification du produit ffinal.

L'invention concerne également un procédé de production d'un stéroïde, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de fermentation d'une souche de levure selon l'invention en présence d'une source de carbone simple, et de récupération du stéroïde produit.

Enfin, l'invention a également pour objet une préparation pharmaceutique comprenant une souche de levure selon l'invention, avec éventuellement un excipient pharmaceutiquement acceptable, un tel excipient étant bien connu de l'homme du métier.

Bien que la souche de levure selon l'invention produise un stéroïde de façon autonome à partir d'une source de carbone simple, on peut également lui fournir du cholestérol ou une structure apparentée, ou un substrat déjà présent en tant que dérivé du cholestérol afin d'obtenir les produits situés en aval. La possibilité de pouvoir entrer à n'importe quelle étape, notamment au niveau prégnénolone ou postérieur de la voie de métabolisme du stéroïde recherché permet donc notamment de pouvoir fournir à la levure des substrats non naturels, qui mènent à la synthèse de stéroïdes non naturels et substitués, notamment fluorés.

Dans un premier mode de réalisation, la souche de levure selon la présente invention permet notamment de produire le stéroïde recherché (notamment le cortisol), en quantité supérieure à 10 mg/1, de préférence supérieure à 50 mg/1, de façon plus préférée 80 mg/1 de façon plus préférée 100 mg/1, de façon la plus préférée 200 mg/1. * Dans un autre mode de réalisation, le stéroïde d'intérêt (de façon préférée l'hydrocortisone) est présent dans une proportion supérieure à 20 %, de préférence 25 %, de façon plus préférée 30 %, de façon plus préférée 35%, de façon plus préférée 40 %, de façon plus préférée 50 %, de la façon la plus préférée 65% du total des stéroïdes produits par la souche selon l'invention (notamment les intermédiaires de synthèse).

Afin que la souche de levure selon la présente invention puisse produire les stéroïdes d'intérêt, il est nécessaire qu'elle présente des modifications génétiques.

Ainsi, la souche de levure selon l'invention présente au moins une modification génétique choisie dans groupe constitué de la disruption ou inactivation d'un gène endogène, la modification du promoteur d'un gène endogène, la duplication d'un gène endogène, l'introduction d'au moins un gène hétérologue (notamment un bloc d'expression avec promoteur et/ou tenninateur homologue et une partie codante hétérologue), en une ou plusieurs copies, de façon épisomale ou chromosomale.

De façon préférée, la souche de levure selon l'invention présente plusieurs (au moins quatre) modifications génétiques telles qu'énoncées ci-dessus.

Ainsi, certains gènes endogènes de la levure sont favorablement inactivés ou disruptés. On peut inactiver ou disrupter les gènes par l'introduction, dans la séquence codante, d'un gène exogène (notamment un bloc d'expression avec promoteur et/ou terminateur homologue et une partie codante hétérologue) tel que

décrit plus bas, et/ou d'un marqueur de sélection. On peut également modifier les promoteurs de ces gènes afin de réduire le niveau d'expression.

Le gène de levure ATF2 (Cauet et al., 1999) code pour une acétyl transférase qui utilise la prégnénolone comme. substrat et sa disruption permet de supprimer cette réaction parasite d'acétylation, dont le produit ne peut alors être utilisé, et d'augmenter ainsi le rendement en stéroïde d'intérêt. Ainsi, les rendements peuvent être multipliés par des valeurs comprises entre 3 et 7 après inactivation du gène ATF2.

Les gènes GCYI et YPRI codent pour des aldo-kéto-réductases. Ces gènes sont avantageusement inactivés ou disruptés. Ces deux gènes font partie d'une famille de 6 gènes plus ou moins homologues et supposés coder tous les six pour des aldo-kéto-réductases. Toutefois, les produits de ces deux gènes sont les plus actifs sur les substrats ici envisagés, notamment ACYL, et leur inactivation est donc extrêmement intéressante pour l'obtention de l'hydrocortisone.

Ainsi que précisé ci-dessus, il est intéressant d'inactiver le gène ERG5, afin d'accumuler un substrat qui présente une structure la plus proche possible de la structure du cholestérol. Toutefois, il a été montré que la levure selon l'invention peut malgré tout produire les stéroïdes d'intérêt malgré l'activité de ce gène.

Toutefois, afin d'optimiser les rendements, il peut être utile de l'inactiver par mutation, délétion et/ou insertion.

On peut aussi, sans que ceci ne soit réellement critique pour la réussite globale de la production de stéroïdes avec la levure selon la présente invention, inactiver d'autres gènes, tels ARE1, ARE2, ADE2 ou SSF1. Ces gènes codent tous pour des protéines dont l'absence peut améliorer le rendement global de synthèse du stéroïde d'intérêt.

Ainsi que décrit dans l'article de Duport et al., précédemment cité (Duport et al., 1998), il est indiqué que la présence d'un bloc d'expression avec promoteur et/ou terminateur homologue et une séquence codant pour la A7-réductase est utile en ce qu'elle permet d'effectuer la désaturation de la double liaison 7-8 de l'ergostérol et de ses dérivés, et d'obtenir ainsi un ou plusieurs précurseurs de structure plus proche de la structure du cholestérol, substrat de départ pour la production de prégnénolone. Ainsi, il est avantageux que la souche de levure selon la présente invention contienne ce bloc d'expression. Dans un cas particulier, ledit

bloc d'expression de la A7-réductase est intégré dans le génome de la levure, de façon préférée au locus du gène ADE2, menant par là même à la disruption du gène ADE2. Le promoteur utilisé pour la transcription est un promoteur inductible tel que GALIO-CYCI, ou un promoteur constitutif, tel le promoteur GALIO-GALIO-CYCI qui est dérégulé dans la souche CA10 décrite dans Duport et al., 1998. La protéine utilisée est préférentiellement issue d'Arabidopsis thaliana (mais peut aussi être issue d'une espèce de mammifère), l'ADNc étant cloné sous la forme native (ADN complémentaire juste après une méthionine d'initiation de traduction), et sous le contrôle d'un terminateur de transcription classique chez la levure tel PGK1.

Il est à noter que l'activité du gène A7-réductase dans la levure a été décrite par Lecain et al., 1996, dont le contenu technique (notamment les séquences du gène A7-réductase et les constructions et méthodes opératoires) est incorporé par référence dans la présente demande.

La première étape, est la production de prégnénolone, obtenue après introduction, dans la levure, des enzymes permettant de transformer normalement le cholestérol en prégnénolone. Dans le présent cas, il s'agit de l'enzyme permettant le clivage de la chaîne latérale (P450SCC pour side chain cleavage), avec deux co- enzymes (adrénodoxine, ADX, et adrénodoxine réductase, ADR). La transformation de la levure avec ces blocs d'expression respectifs est décrite dans Duport et al., 1998, précédemment cité.

On utilise de préférence un ADN complémentaire codant pour les protéines matures, avec une méthionine ajoutée à l'extrémité N-terminale pour permettre la traduction. On utilise des promoteurs tels que le promoteur hybride GAL10-CYCI, ou le promoteur NEF7, pour assurer la transcription des ADNc. On utilise les terminateurs classiques, notamment le terminateur PGK1.

Les différents ADNc codant pour les protéines P450sce, ADR ou ADX peuvent être d'origine d'un vertébré, par exemple humaine ou bovine, mais aussi rat ou poisson. Les gènes codant pour ces protéines sont de préférence placés sur des plasmides, on préfère pour P450scc et ADX un plasmide multicopie à faible ou grand nombre de copies, notamment dérivé d'un plasmide 2 micron de levure, alors qu'on utilise plutôt un plasmide monocopie ou à faible nombre de copies pour l'expression de ADR. Le bloc d'expression pour ADR peut aussi être intégré dans le

chromosome de la levure. Ceci permet de contrôler l'expression de l'ADR, car il semble que trop d'expression nuise à l'activité scc recherchée.

Les protéines sont de préférence exprimées pour pouvoir exercer leur activité dans le cytosol.

L'étape suivante est la conversion de la prégnénolone en 17a-hydroxy progestérone, par l'action conjuguée de la 17a-hydoxylase (P450c17) et de la 3p- OH-stéroïde déshydrogénase (3p-HSD).

Pour l'expression de ces deux protéines, on utilise de préférence des promoteurs forts, tels TEF1, TDH3, GALIO-CYCl. Toutefois, un promoteur plus faible tel CYCI peut également convenir. Les terminateurs utilisés sont classiques, notamment provenant des gènes PGKI ou NCP1. On exprime les ADN complémentaires codants pour les protéines complètes. L'espèce d'origine de ces protéines ne semble pas modifier les résultats obtenus, ainsi on peut utiliser des protéines d'origine humaine (notamment l'un ou l'autre des deux isotypes de la 3p- HSD), bovine, ou d'autres organismes (notamment de poissons). Il s'agit, pour ces deux protéines, d'obtenir la meilleure expression possible, et on peut donc les exprimer sur des plasmides mono ou multicopies à faible ou grand nombre de copies, ou en ayant intégré les blocs d'expression dans au moins un chromosome de la levure.

On recherche ensuite la conversion de la 17a-hydroxy progestérone en désoxycortisol, par l'intermédiaire de la P450c21, qui permet une hydroxylation en 21. Il s'agit d'exprimer la protéine, à partir de son ADNc, de la meilleure façon possible. Pour ce faire, on utilise un promoteur fort (TEF1, TDH3, GALIO- C7C7...), voire le promoteur CYC1, et un terminateur classique (notamment PGKI) pour concevoir l'unité transcriptionnelle. Celle-ci est placée sur un plasmide mono ou multicopies, à faible ou grand nombre de copies, ou bien intégrée dans le génome de la levure. Il est à noter que l'espèce d'origine semble ici importante, et qu'il est préférable d'utiliser la P450c21 d'origine humaine.

Le désoxycortisol est ensuite converti en cortisol, sous l'action du système P450cll, qui contient la P450cll, permettant l'hydroxylation en 11-j3, une adrénodoxine et une adrénodoxine réductase, en tant que cofacteurs.

Les inventeurs de la présente demande ont montré que les résultats obtenus étaient meilleurs lorsque ce dernier système est exprimé dans la membrane interne des mitochondries des levures. Ainsi, il est intéressant de produire des protéines de fusion, qui portent en tant que précurseur la séquence d'adressage mitochondrial du précurseur de la protéine Cox6p de la levure.

On utilise de préférence également l'ADNc codant pour les protéines matures. La protéine P450cl 1 est ainsi la protéine d'origine humaine, bovine ou une protéine hybride humaine-bovine. Cette dernière construction est la forme préférée pour la mise en oeuvre de l'invention. Le gène utilisé dans l'unité transcriptionnelle \. est de préférence sous le contrôle du promoteur CYCI. Il est intéressant de positionner un intron de (3-globine de lapin et un terminateur du gène de l'hormone de croissance humaine en 3'de la séquence codante. L'unité transcriptionnelle est placée de préférence sur un plasmide multicopie.

L'adrénodoxine est utilisée sous sa forme mature, placée avec une séquence d'adressage vers les mitochondries, par exemple choisie parmi celles des précurseurs des protéines Cox6p, Cox4p, fumarase, ARHlp, F9 ATPase, et sous le contrôle d'un promoteur choisi notamment parmi TDH3, TEF1, CYC1. On préfère une protéine d'origine bovine ou humaine. Il convient de placer un terminateur dans l'unité transcriptionnelle, qui peut être PGK1. On exprime le bloc d'expression de préférence à partir d'un plasmide multicopie.

La protéine faisant fonction d'adrénodoxine réductase est la protéine ARHlp, endogène de la levure, qui est normalement exprimée dans les mitochondries de l'hôte. De façon préférée, on transforme toutefois la levure de telle façon que la souche hôte contienne une copie naturelle du gène ARHI et une seconde copie du gène ARHl sous le contrôle du promoteur CECI. L'activité de cette protéine est indispensable pour obtenir l'effet recherché, et il a même été observé que l'inactivation du gène est létale pour la levure (Lacour et al., 1998). Il convient de noter que la surexpression de ce gène semble toxique pour l'organisme, et que le promoteur choisi doit donc permettre un niveau d'expression qui mène à l'activité 11- (3 hydroxylase recherchée sans être délétère pour la levure. De manière surprenante, il a en effet été montré qu'une expression du gène ARH1 à un niveau supérieur au niveau d'expression physiologique augmente de façon significative la quantité de stéroïdes produits. Cependant comme il a été dit ci-dessus, cette

expression ne doit pas être trop importante pour obtenir l'effet désiré. Ainsi, si une expression de la protéine ARH1 à un niveau supérieur par rapport à un niveau physiologique est souhaitable, il faut prendre garde à ne pas surexprimer trop fortement cette protéine sous peine de perdre cette augmentation de production en stéroïdes. A titre d'exemple, une intégration de la cassette d'expression pour ARHI, comportant comme promoteur le promoteur CYC1, au niveau du locus LEU2 de S. cerevisiae donne des niveaux d'expression et des résultats satisfaisants. A l'inverse l'intégration au même locus d'une cassette comportant le promoteur TEFl, reconnu comme beaucoup plus fort que le promoteur CYC1, donne des résultats moins intéressants.

Ainsi, on introduit de préférence deux copies d'une unité transcriptionnelle codant pour la protéine co-enzyme ADX, l'une d'entre elles ayant une activité à l'extérieur des mitochondries et notamment dans le cytosol, l'autre ayant une activité dans les mitochondries de la cellule hôte.

Il est également possible d'introduire d'autres gènes, notamment les gènes codant pour des protéines ayant une activité NADPH P450 réductase, tels NCP1 (réductase de levure aussi appelé CPRI), ATRI ou ATR2 (réductases de plantes), réductase humaine. Ces protéines améliorent les activités P450cl7 et P450c21. On utilise soit le promoteur endogène (NCPI), ou on met les ADN codant pour les protéines sous le contrôle de promoteurs tels GAL10-CYC1, CECI, Tel...

Il est également possible d'introduire le gène UGLI, codant pour une protéine ayant une activité de désestérification, sous le contrôle d'un promoteur fort tel GHL10-CYC1, sur un plasmide multicopie ou monocopie. Ceci permet de réduire l'effet des réactions d'estérification parasites des stérols pouvant subsister même après l'inactivation de ATF2, et notamment celles produites par le produit des gènes ARE1 et ARE2.

On peut aussi ajouter un plasmide exprimant le cytochrome b5 de levure ou une autre espèce, qui est un cofacteur dans plusieurs des réactions définies ci- dessus.

On peut aussi, lorsque l'on désire produire de la DHEA, introduire un plasmide codant pour la desmolase (P450 17a), à faible ou grand nombre de copies, sous le contrôle d'un promoteur tel GAL10-CYC1, CYC1, TEF1, avec un terminateur PGK1.

On peut également introduire un ADNc codant pour le cytochrome P450c17 ayant une activité lyase, par exemple celui d'origine humaine, en présence d'un excès de NADPH P-450 réductase, comme les réductases de mammifère, NCP1, ABRI, ou ATR2. Ces unités transcriptionnelles utilisent de préférence un promoteur fort.

Enfin, il est possible de restaurer l'activité des gènes endogènes ERG6 et ERG2, inhibés par la prégnénolone, en les plaçant sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort.

On peut aussi introduire d'autres gènes hétérologues, codant notamment pour une protéine à activité 24,25 stérol réductase, ou le gène HMG1, présent dans la voie de synthèse du cholestérol chez l'homme. Il est également intéressant d'introduire le gène MDRI humain, qui code pour une pompe non inhibée par l'accumulation des stérols anormaux qui apparaissent en raison de l'inhibition du gène ERG6 par la prégnénolone. Ceci permet d'expulser ces produits dont une trop grande accumulation pourrait s'avérer toxique pour la cellule hôte.

On peut aussi sur-exprimer le gène PDR12 de levure qui aura un effet de détoxification pour les stéroïdes pouvant inhiber la croissance de la levure.

Il est entendu que lorsque l'on parle de gène ci-dessus, on entend non seulement le fragment d'ADN codant pour la protéine présentant l'activité recherchée (et notamment le fragment d'ADNc représentant en particulier les formes matures), mais aussi les promoteurs (notamment TEF1, GALIO-CYCI, CYCI, TDH3) et les terminateurs (en particulier PGKI). Ces unités transcriptionnelles sont introduites préférentiellement sur des plasmides à faible ou grand nombre de copies, ou intégrés dans le chromosome de la levure.

Il est également entendu que, suivant le but recherché, et notamment le stéroïde que l'on désire produire, il est possible de n'introduire que certains des gènes codant pour les différentes protéines à chaque étape, et de fournir un intermédiaire à la levure afin d'obtenir un stéroïde en aval dans la chaîne de métabolisme.

Il est aussi facile de ne pas introduire les gènes permettant d'obtenir les -produits situés très en aval, et de pouvoir donc s'arrêter relativement haut dans la chaîne du métabolisme.

La levure utilisée pour la mise en oeuvre de la présente invention sont de préférence :-la souche FY1679-28c, décrite dans Duport et al., 1998, qui possède le génotype (MATa, rho-, ura3-52, trp1#63, leu2#1, his3#200, GAL2, fenl). Cette souche a également été décrite par Thierry et al., 1990.

- la souche FY1679-18b, possédant le génotype (MATa, rho-, ura3- 52, trp1#63, leu2#1, his3#200, GAL2,fen1).

Ces deux souches possèdent donc un génotype identique, et un signe opposé.

DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Représentation schématique d'une voie de biosynthèse de l'hydrocortisone telle que l'on peut l'obtenir selon l'invention.

Figure 2 : Représentation schématique de construction de souches de levures exemplifiées selon l'invention.

Figure 3 : Carte du plasmide pCV29. PGK term : terminateur PGK. GAL10/CYC1 prom : promoteur GAL10/CYC1. HGH term : terminateur du gène de l'hormone de croissance humaine. Intron ß-globin : intron du gène de la (3-globine de lapin.

CYC1 prom : promoteur CECI. PGK term : terminateur PGK. S. cerevisiae 2 micron : origine de replication 2 micron de S. cerevisiae. Cox6pre : préséquence de la cytochrome oxidase sous unité 6. Bovine/human P450 11ß : ADNc fusionné bovin/humain de la P45011 (3. mat-ADX : forme mature de l'ADX avec une méthionine en NH2 terminal. E. coli replicon : Replicon E. coli Figure 4 : Carte du plasmide pCC12. CYC1 prom : promoteur CECI. PGK term : terminateur PGK. ARS CEN : origine de replication chromosomique de S. cerevisiae. E. coli replicon : Replicon E. coli. TDH3 prom : promoteur TDH3. 3ß- HSDH : ADNc de. la 3ß hydroxy stéroide déhydrogénase. matADR : forme mature de l'ADR précédée d'une méthionine.

Figure 5 : Carte du plasmide pFMIO. CYCIp : promoteur CECI. P45011 (3 : ADNc fusionné bovin/humain de la P45011 (3. ADE2 : gène 1DE2 de la levure. TDH3p : promoteur TDH3. 3ß-HSD : ADNc de la 3 (3 hydroxy stéroide déhydrogénase. RI pied de recombinaison dont la séquence est donnée en SEQ ID N° 39.

GALIO/CYClp : promoteur GAL10/CYC1. matADX : ADNc codant pour la forme mature de l'ADX. URA3 : gène URA3 de la levure. P450scc : ADNc codant pour la forme mature du P450SCC (CYP11A1). Origine 2 micron : origine de replication 2 micron de S. cerevisiae. R2 : pied de recombinaison dont la séquence est donnée en- SEQ 1D N° 40.

EXEMPLES Les exemples ci-dessous décrivent un mode de mise en oeuvre de la présente invention et ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.

On part, pour les constructions des souches de levure FY1679-28c et FY1679-18b décrites ci-dessus.

Exemple 1 : Disruption du gène YPRI La construction de l'interruption du gène YPR1 (YDR368w) par le gène URA3 dans le plasmide pPOLYIII a été obtenu par 4 PCR successives. D'une part trois PCR indépendantes ont été réalisés pour obtenir la partie 5'du gène YPR1 (PCR 5), le gène URA3 fonctionnel bordé par des séquences YPR1 (PCR 6), la partie 3'du gène YPR1 (PCR 7).

L'ADN de la PCR5 a été obtenu par amplification sur une matrice d'ADN génomique avec les oligonucléotides OTG11314 (SEQ ID N° 1) et OTG11315 (SEQ ID N° 2) de même l'ADN de la PCR7 est obtenu par amplification à l'aide des oligonucléotides OTG11316 (SEQ ID N° 3) et OTG11317 (SEQ ID N° 4) sur la même matrice.

Le gène URA3 flanqué de région YPR1 5'et 3'est amplifié à l'aide des oligonucléotides OTG11463 (SEQ ID N° 5) et OTG11464 (SEQ ID N° 6) sur une matrice pTG10054 décrit dans Degryse et al., 1995 incorporé ici par référence en ce qui concerne la description de ce plasmide.

Les produits des PCR5, PCR6 et PCR7 ont été mélangés de façon équimoléculaire puis amplifiés par PCR à l'aide des oligonucléotides OTG11314 (SEQ ID N° 1) et OTG11317 (SEQ ID N° 4) pour obtenir un produit de PCR8.

Ce produit PCR8 a été digéré par l'enzyme Xhol puis sous clone dans le plasmide pPOLYIII (décrit par Lathe et al., 1987 et incorporé ici par référence en ce qui concerne la description de ce plasmide) digéré par XhoI pour donner le plasmide

pTG12011. L'orientation de l'insertion dans le plasmide pPOLYE a été déterminée par digestion par les enzymes NcoI et EcoRI.

Le plasmide pTG12011 qui permet la disruption du gène parasite YPRI par le gène URA3 est digéré par l'enzyme XlaoI. Le produit de la digestion est utilisé pour transformer la souche FY1679-18b en utilisant la méthode au chlorure de lithium bien connue de l'homme du métier. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu dépourvu en uracil. Les transformants sont analysés par amplification par PCR en utilisant les oligonucléotides qui ont servi à la construction du plasmide pTG12011.

Les clones positifs dans ce test sont ensuite criblés par la méthode de bioconversion du 170H progestérone décrite plus bas en présence de glucose comme source de carbone. La capacité de bioconversion est analysée en HPLC comme décrit par Dumas et al., 1996 et Degryse et al., 1999 dont les contenus sont incorporés par référence à la présente demande, notamment les explications des études de bioconversion ou comme décrit dans Kuronen et al., 1999. Un clone TGY195&num 4 est sélectionné pour de nouvelles caractérisations. La souche TGY195#4 est transformée en utilisant à la fois le plasmide YRp7 (Parent et al., 1985, qui est incorporé par référence pour ce qui est de la description de ce plasmide) (lug) et zug de plasmide pTG12045 (décrit plus bas) digéré par NotI. Les souches transformées sont sélectionnées sur un milieu dépourvu en tryptophane. Des colonies (678 colonies) sont repiquées sur un milieu contenant du tryptophane (pour se débarrasser du plasmide YRp7) et sur un milieu contenant du tryptophane et du 5 fluoro orotate (5FO) pour sélectionner les colonies qui ont perdu le gène URA3 interrompant le gène YPR1.

Exemple 2 : Construction de différents plasmides.

Pour la surexpression de la protéine P450c21 dans la levure deux types de promoteur ont été utilisés, TEFI ( « Transcription elongation factor 1 ») et TDH3 ( « glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3). Dans tous les cas, le terminateur de transcription est le terminateur PGK. Dans ces plasmides, le fragment SalI, MluI porte l'ADNc de la P450c21 humaine.

Construction des plasmides pTG10470 et pTG10469 Le plasmide pTG10289 a été obtenu par modification du pMAc21 (Wu et al, 1991) par digestion avec KpnI, MM et introduction de l'oligonucléotide OTG5868 (SEQ ID NI 27).

L'ADNc de ce plasmide provient de l'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland, USA) sous le nom de pc21/3c. C'est le fragment EcoRI-Ba7nHI de 1,6Kb qui a servi de base pour la construction des différents plasmides. Les modifications apportées sont décrites dans l'article ci-dessus et dans l'article de Hu et al, 1990.

Dans cette manoeuvre, la partie non codante de la P450c21 du plasmide pMAc21 qui contient la cassette d'expression de la P450c21 a été éliminée ainsi que le site KpnI qui s'y trouvait.

Le plasmide pTG10292 a été obtenu par transfert de l'ADNc c21 humain (fragment SalI, MluI) du plasmide pTG10289 dans le plasmide pTG10031 (décrit dans Degryse et al. j 1995, qui est incorporé par référence à la demande) à l'aide des sites SalI et MM.

Le plasmide pTG10475 a été obtenu par PCR et recombinaison. En effet à partir du plasmide pTG10292, un fragment de l'ADNc P450c21 humain représentant approximativement 250 nucléotides a été amplifié à l'aide des oligonucléotides OTG7410 (SEQ ID N° 7) et OTG5927 (SEQ ID N° 8). Ce fragment représente la séquence codante, de la P450c21 humaine d'un site SalI et de la séquence AAAA.

Ce fragment a été digéré par SalI puis ligué sur le fragment linéaire de pTG10292 digéré par SalI et ensuite une expérience de recombinaison a été réalisée dans la souche BJ5183 décrite par Degryse et al., 1995.

Le plasmide obtenu pTG10475 porte un ADNc de la P450c21 avec une séquence codante identique à celle de l'ADNc naturel, contrairement au plasmide pMAc21, sur un fragment compatible avec les vecteurs utilisés généralement par les inventeurs, c'est à dire un fragment bordé par les sites de restriction SalI et MM. Ce fragment possède l'environnement suivant autour du codon ATG d'initiation de la traduction GTCGACAAAAATGCTGCTCCTGGGCCTGCTGC (SEQ ID NI 9).

A partir de ce plasmide le fragment SalI, MuI portant l'ADNc de la P450c21 humaine a été transféré dans le plasmide pTG10158 (Degryse et al 1995) par clonage classique pour donner le plasmide pTG10472.

Ce même fragment SalI MM du plasmide pTG10472 a été ensuite transféré par clonage classique dans le plasmide pTG10085 (Degryse et al 1995) pour donner le plasmide pTG10469. Ce plasmide possède donc l'ADNc de la P450c21 humaine sous le contrôle du promoteur TEF1, avec le terminateur PGK1.

Ce même fragment portant l'ADNc P450c21 sur un fragment de restriction SalI et MluI est transféré dans le plasmide pTG10092 par recombinaison dans la souche BJ5183 pour donner le plasmide pTG10470 (Degryse et al., 1996).

Le plasmide pTG10470 porte donc l'ADNc de la P450c21 humaine sous contrôle du promoteur TEF1 et d'un terminateur PGk1 avec un marqueur de sélection URA3-d avec l'environnement du codon initiateur ATG décrit précédemment. b) Construction du plasmide pTG12036.

Le plasmide pTG12036 a été construit en 4 étapes à partir du pTG10802. Le plasmide pTG10801 (qui est à l'origine du plasmide pTG10802) est un plasmide de type pUC dans lequel une suite de sites de restriction a été insérée entre les sites X7çoI etSoI. Cette suite de sites comprend les sites HindIII, SnabI, CM et SpeI.

Entre les sites Hindis et ClaI, la cassette HindHI ClaI du pTG10470 comprenant le promoteur TEFI, l'ADNc P450c21 humain et le terminateur PGKI a été inséré entre les sites HindIJI et ClaI de pTG10801 pour donner pTG10802.

Ce plasmide a été ensuite digéré par XlioI et la cassette introduite est donc délétée pour introduire un fragment de PCR bordé par des sites k hoI. Ce fragment de 2,5Kb provient de l'amplification par la paire d'oligonucléotides OTG11844 (SEQ ID N° 10) et OTG11845 (SEQ ID N° 11) sur le plasmide pTG12010&num 40 (cf. ci dessous) pour obtenir un fragment bordé par des XhoI contenant le gène GCYI interrompu par le gène URA3 bordé en 5'par un site de restriction ClaI.

Ce fragment a été cloné entre les sites X/loI du plasmide pTG10802 pour obtenir le plasmide pTG12035. Dans le but d'introduire le site HindHI manquant, le plasmide pTG12010#36 a été utilisé. Ce plasmide est essentiellement identique au pTG12010&num 40 mais possède un site Hindi en 3'du gène MM. 3 à la limite avec le

gène GCYI mais ne possède pas de site ClaI en 5'du gène URA3 à la jonction avec le gène GCYI (cf. ci-dessous). Par recombinaison in vivo dans E. coli, entre le fragment NcoI BamHI de 2,2Kb qui porte de 5'vers 3'un fragment du gène URA3, le fragment 3'du gène GCYI et enfin une partie du plasmide pTG12035 c'est à dire le grand fragment StuI,AflII de 4,45Kb. On obtient le plasmide pTG12036.

Le plasmide obtenu pTG12036 possède le gène GCYI interrompu par le gène URA3 bordé par des sites CM et HindEI respectivement en 5'et 3'. Ce fragment est ensuite remplacé par la cassette d'expression de la P450c21 porté par le fragment 2,33Kb ClaI, HindIII du plasmide pTG10469 (voir plus haut) pour obtenir le plasmide pTG12086. c) Construction du plasmide pTG12045.

Le site unique SphI du plasmide pPOLYIII est détruit par insertion de la paire d'oligonucléotides complémentaires OTG11975 (SEQ ID N° 12) et OTG11976 (SEQ ID N° 13).

Le site SphI du pPOLYIII est détruit et remplacé par un site ClaI pour donner le plasmide pTG12040. Dans le plasmide pTG12040 entre les sites uniques ClaI et EcoRI, on introduit un fragment d'ADN génomique ClaI EcoRI correspondant à la partie 3'de 0,7Kb du gène YPR1 obtenu par amplification avec les oligonucléotides OTG11981 (SEQ ID N° 14) et OTG11982 (SEQ ID N° 15) pour donner le plasmide pTG12041.

Dans ce plasmide pTG12041 de 2,84Kb, la partie 5'du gène YPR1 (0.66Kb) amplifiée par les oligonucléotides OTG11314 (SEQ ID N° 1) et OTG11980 (SEQ ID N° 16) à partir d'ADN génomique de levure sauvage est clonée sous forme d'un fragment XhoI HiyzdIII entre les sites SalI et Hindus du plasmide pTG12041.

On obtient le plasmide pTG12042 de 3,5Kb. Ce plasmide porte le gène YPRI interrompu par les sites CM et HindIII. Entre ces sites la cassette du cytochrome P450c21 est clonée sous forme d'un fragment ClaI HindIH de 2,33 Kb provenant du plasmide pTG10469. On obtient ainsi le plasmide pTG12045.

d) Construction des plasmides pTG12010#36 et #40 Le plasmide pTG 12010 a été construit sur une base du plasmide pUCl9 (Yanisch-Perron et al., 1985) tandis que le plasmide pTG12011 a été construit sur une base du plasmide pPOLYIII (Lathe et al., 1987).

La construction de la disruption du gène GCYI par le gène URA3 dans le plasmide pUCl9 a été obtenue par quatre amplifications par PCR successives.

D'une part trois PCR indépendantes ont été réalisés pour obtenir la partie 5'du gène GCYI (PCR1), le gène URA3 fonctionnel bordé par des séquences GCY1 (PCR2), la partie 3'du gène GCY1 (PCR3).

Les parties 5'et 3'du gène GCYI à l'aide des couples OTG11285, OTG11286 et OTG11287, OTG11289 (respectivement SEQ ID N° 17 à SEQ ID N° 20) sur une matrice d'ADN génomique de la souche FY1679-28c.

Le gène URA3 flanqué de séquences GCYI (de façon à obtenir une délétion d'une partie de la séquence codante du gène GCYI) est amplifié à l'aide des oligonucléotides OTG11305 (SEQ ID N° 21) et OTG11306 (SEQ ID N° 22) à partir , d'une matrice plasmide pTG10054 linéarisé (Degryse et al., 1995).

Les conditions de tampon et de concentration en matrice et amorces pour l'amplification sont décrites par le producteur ou fabricant de l'enzyme Taq ADN polymerase, et en particulier pour l'enzyme elongase développé par Life Technologies. Les cycles de températures sont les suivants : un premier cycle de 6'30 pour dénaturer amorce et matrice puis 30 cycles de 30s à 93°C, 2 mn à 54°C et 3mn à 68°C, le dernier cycle est de 5 mn à 72°C. Les produits PCR1, PCR2 et PCR3 sont mélangés de façon équimoléculaire et amplifiés de nouveau à l'aide des oligonucléotides OTG 11285 (SEQ ID N° 17) et OTG11289 (SEQ ID N° 20). Le produit final PCR4 d'une taille de 2,9 Kb est ensuite sous cloné entre les sites de restriction KpnI et Ba1nHI du plasmide pUCl 9 pour obtenir le plasmide pTG12010.

La structure du plasmide a été vérifiée par profil de restriction et séquençage nucléotidique des extrémités.

Le clonage du pTG12010 a permis en fait d'obtenir deux versions de ce plasmide, la version pTG12010#40 (pTG12040 clone 40) et pTG12010#36. La volonté initiale était d'obtenir le gène GCYI interrompu par le gène URA3 bordé par les sites de ClaI et Hindi respectivement en 5'et en 3'du gène. En fait deux plasmides différents ont été obtenus, qui différent uniquement par la présence ou

l'absence de sites ClaI et HindIII aux extrémités du gène URA3. Le plasmide pTG12010#40 possède un site de restriction HindUI à l'extrémité 3'du gène UM3 mais pas de site ClaI en 5'. Le plasmide pTG12010 #36 ne possède pas de site HindIII à l'extrémité 3'mais un site ClaI à l'extrémité 5'du gène. Cette propriété est utilisée pour obtenir le plasmide qui possède le gène URA3 bordé par les sites HindHI et CM interrompant la séquence codante de GCY1. e) Construction du plasmide pTG12086 Ce plasmide sert à l'intégration d'une cassette d'expression pour la P450c21 ainsi qu'à la disruption du gène GCY1 dans le même temps. Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pTG12036 et du plasmide pTG10614.

La construction du plasmide pTG10614 a été réalisée comme suit. Ce plasmide a été construit à partir du pTG10212 (Degryse et al., 1995) qui est un plasmide d'expression levure basé sur un promoteur TDH3, un terminateur PGK1 et un marqueur de sélection URA3-d.

Par recombinaison homologue dans E. coli, le marqueur de sélection est remplacé par le marqueur de sélection du plasmide pTG10054 (Degryse et al.

1995), pour ce faire le fragment MluI, FspI du pTG10054 de 2,1Kb contenant le marqueur URA3 flanqué par des séquences de recombinaison est recombiné avec le grand fragment Hindm de pTG10212 pour donner le plasmide pTG10610 qui possède les mêmes caractéristiques que pTG10212 (Degryse et al., 1995) avec un marqueur URA3 dans la même orientation que pTG10054.

Le fragment SalI MM portant l'ADNc du cytochrome P450 c21 humain du plasmide pTG10472 (cf. ci-dessus) est transféré dans le plasmide pTG0610 pour donner le plasmide pTG10614.

Le fragment ClaI HiniE de ce plasmide contenant de 5'vers 3', le promoteur TDH3, l'ADNc de la P450c21 humaine bordé par des sites SalI et MM puis le terminateur PGKI est transféré dans le plasmide pTG12036 pour donner le plasmide pTG12086 qui contient donc la séquence du gène GCYI interrompu par la cassette d'expression TDH3 du cytochrome P450c21 humain.

Construction du plasmide pTG12048.

Le plasmide pTG12048 a été construit à partir des plasmides pFL26CD, pTG10925 et pTG10953.

Le pTG10953 est identique au plasmide décrit dans Lacour et al., 1998-mais le promoteur TEFI qui est porté par un fragment ClaI SalI est remplacé par un promoteur CYCI (Degryse et al., 1995). La cassette d'expression est portée par un fragment d'ADN NôtI-NotI.

Le plasmide pTG10925 a été construit à partir de pFL26CD décrit par Duport et al., 1998. Le plasmide contient un fragment génomique de la levure qui comprend les gènes LEU2 et NFSI orienté de 5'vers 3'et 3'et 5'respectivement.

Une cassette d'expression de l'ADR bordé de sites NotI a été introduit dans la région inter-génique pour donner le plasmide pTG10925. Cette cassette (IEF7-ADR bovine mature-terminateur PGKI) a été remplacée par une nouvelle cassette comprenant le gène ARHI sous contrôle du promoteur CYCI et du terminateur PGKI pour donner le plasmide pTG12048. Sur ce plasmide, le gène LEU2 et la cassette d'expression sont dans la même orientation transcriptionnelle.

Exemple 3. Construction de la souche TGY212#1 Une colonie est sélectionnée dans le crible décrit dans l'exemple 1. Elle est nommée TGY212#1. Cette colonie est soumise à une expérience de bioconversion comme décrit précédemment avec 100pg/ml de substrat 170H progestérone, la souche est mise à croître dans un milieu minimum complémenté avec des acides aminés nécessaires et de l'uracile.

Cette souche est capable de convertir la 170H progestérone en 11- déoxycortisol avec une efficacité de l'ordre 47% en 24 heures avec une faible production de 4 prégnène 17a, 20a diol 3 one dans ces conditions (< 0.5%). Dans certaines conditions (milieu riche défini de type Kappeli avec du galactose comme source de carbone et démarrage de la culture à haute densité : DO 600nm=5), la capacité de réduction de la cétone est augmentée pour atteindre 11 % du substrat de départ avec une capacité de bioconversion réduite à 1,5% du substrat de départ.

Dans ces conditions, la présence probable du gène GCYI constitue une gène pour la bioconversion de la 170H progestérone. Il a donc été décidé de disrupter le gène GCYI pour empêcher son activité.

Exemple 4 : Construction de la souche TGY243 Pour ce faire, la souche TGY212#1 a été transformée par 3tg du plasmide pTG12010&num 36 linéarisé par les enzymes de restriction Sp} I et EcoRI. Vingt sept transformants ont été sélectionnés sur un milieu minimum complémenté pour les auxotrophies de TGY212#1 mais ne contenant pas d'uracil.

Ces colonies ont été soumises à des tests bioconversion dans un milieu minimum complémenté avec du galactose comme source de carbone car c'est un inducteur connu de ACYL. Tous les clones TGY243 présentaient une capacité de convertir la 170H progestérone en 11-deoxycortisol sans pour autant produire des quantités détectables de 4 prégnène 17a, 20α diol 3 one.

Un clone TGY243#1 a été sélectionné pour introduire à la place du gène URA3 une cassette d'expression pour la P450c21 humaine.

Exemple 5 : Construction de la souche TGY245 Cette souche TGY243#1 est transformée par le plasmide YRp7 (lp. g) décrit par Parent et aL, 1985 et par le plasmide pTG12086 linéarisé par l'enzyme Viol . (5g).

Le fragment transformateur de pTG12086 contient la séquence codante de GCYI interrompue par une cassette d'expression pour la P450c21 humaine (7D : : ADNcP450c21 humaine : terminateurPGKl).

Les colonies qui croissent en absence de tryptophane sont sélectionnées. Ces 381 colonies sont ensuite transférées sur un milieu contenant du tryptophane et du 5 fluoro orotate. Une dizaine de colonies sont ensuite testées dans un milieu riche de type YPG complémenté avec du tryptophane, de l'histidine, de la leucine et de l'uracil à une concentration de 50pig/mI.

Les souches sont mises à convertir de la 170H progestérone à une concentration de 100pg/ml à partir d'une D0600nm de 0.1 pendant 16 Heures.

Parmi ces 10 clones, un clone TGY245#2D est choisi suivant deux critères, sa capacité à convertir le 170H progestérone en 11-deoxycortisol et deuxièmement l'absence de la formation de 4 prégnène 17a, 20a diol 3 one indiquant la disruption de GCY1.

Exemple 6 : Construction de la souche TGY260 La souche a été construite par transformation de la TGY245 par le plasmide pTG12048 qui permet la surexpression du gène ARH1 au locus LEU2 La souche TGY260 a été construite à partir de la souche TGY245 qui a été transformée par le plasmide pTG12048 linearisé.

Ce plasmide pTG12048 est un plasmide d'intégration intergènique portant le marqueur de sélection LEU2. Sur ce plasmide, dans la région entre le gène LEU2 et le gène NFSI est intégré une cassette d'expression pour le gène ARHI (Lacour et al., op. cit.).

Cette cassette comprend le promoteur CYCI suivi du gène Api et du terminateur PGK1 bordé par les sites de restriction NotI. Ce plasmide pTG12048 a été linearisé par les enzymes de reskictionZ20I et Sall.

Ce fragment est utilisé pour transformer la souche TGY245 en utilisant une méthode classique de transformation au chlorure de lithium. Les colonies transformantes sont ensuite sélectionnées sur un milieu ne contenant pas de leucine.

Une souche TGY260 a été sélectionnée.

On a déposé la souche TGY260 à la CNCM le 24 janvier 2001 sous le numéro 1-2615.

Exemple 7 : Construction de la souche CDR07matu La souche FY1679-28c a été'transformée par le plasmide pCD62.1, décrit dans Duport et al. 1998, (dont le contenu technique de construction des plasmides et l'obtention des souches sont incorporés par référence à la présente demande), pour donner la souche CDR01. Celle-ci est transformée par le plasmide pCD78, également décrit dans Duport et al., et on obtient la souche CA03.

On disrupt le gène ERG5 de ladite souche CA03 avec une cassette conférant la résistance à l'hygromycine, et on obtient la souche CA10.

Cette souche est croisée avec une souche parente FY1679-18b, puis mise à sporuler. Les spores sont isolées suivant les techniques classiques sur un milieu minimum complémenté pour les auxotrophies c'est à dire uracil, tryptophane, leucine et histidine.

Les spores sont criblées suivant deux critères qui sont la résistance à la nystatine (121lg/ml en milieu minimum) et la résistance à l'hygromycine (100- 150pg/ml en milieu riche). Les spores qui sont résistantes à ces deux produits, sont ensuite analysées en chromatographie en phase gazeuse pour la présence de campestérol comme stérol principal des membranes. La présence de campestérol dans les membranes des souches couplée à l'absence d'ergosta 5-22 dienol indique le bon fonctionnement de la A7 Reductase. Une spore CDR07 MATa est sélectionnée suivant les critères ci-dessus.

La souche CDR07 MATa a été déposée à la CNCM le 24 janvier 2001 sous le numéro I-2616.

Exemple 8 : construction des souches UCY2 et UCY4 On croise les souches TGY260 et CDR07 MATa pour obtenir la souche SB14. Cette souche est alors mise à sporuler et on obtient les souches ségrégantes YCC4 et YCC5 (voir aussi ci-dessous).

Ces souches sont transformées par le plasmide pLIP5 (voir ci-dessous) et donnent respectivement les souches YCC8 et YCC9.

Ces souches sont transformées par le plasmide pTG12093 pour obtenir respectivement les souche UCY2 et UCY3.

Le gène ATF2 est inactivé dans la souche UCY2, par utilisation d'un plasmide et d'une sélection au G418, et on obtient alors la souche UCY4.

Exemple 9 : Construction des plasmides de transformation des souches UCY2, UCY3 et UCY4 a) Construction du plasmide pCV29 Pour la construction du pCV29 (cf. Figure 3), les plasmides pTG10767, pTG10022 et pCD63 ont été utilisés.

1. Construction du plasmide pTG10767 Le plasmide pTG10767 est un plasmide d'expression pour la P450cll d'origine humaine. Il contient en fait deux cassettes d'expression l'une pour la P450cl l d'origine humaine et l'autre pour l'adrenodoxine. Ces deux protéines sont ciblées pour être actives dans les mitochondries de la levure S. cerevisiae, par la présence de séquences d'adressage du précurseur de la cytochrome Cox6p.

Cette cassette d'expression pour la P450cll d'origine humaine est bordée par deux sites de restriction NotI qui permettent de la transporter dans les différents vecteurs décrit par Degryse et al., 1995. De 5'vers 3', elle comprend, le promoteur CYCI comme décrit dans la publication ci-dessus puis l'ADNc de la P450cll humaine modifié comme décrit ci-dessous et enfin une partie non codante d'eucaryote supérieur.

L'ADNc P450cll humaine est celui décrit par Chua et al., 1987, avec les modifications suivantes.

La partie codant pour le peptide signal dans l'ADNc original a été enlevée jusqu'au site de restriction BglII et remplacée. Cela enlève par la même occasion 31 acides aminés de la séquence codante de la forme mature de l'ADNc pour donner la séquence protéique suivante en NH2 terminal (SEQ ID N° 23) : <BR> <BR> <BR> MLSRAIFRNPVINRTLLRARPGAYHATRLTKNTFIQSRKYGTRG. AAAPKAVLPF<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> EAMPRCPGNKWMRMLQIWREQGYEDLHLEVHOTFQELGPIFRYDLGGA<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GMVCVMLPEDVEKLQQVDSLHPHRMSLEPWVAYROH Sur la ligne précédente, la partie en italique correspond à la séquence en acides aminés de la séquence d'adressage du précurseur de la cytochrome oxydase sous unité VI de levure (COX6), la partie en gras correspond à la partie NH2 terminal de la P450cl 1 bovine (Dumas et al., 1996). La partie soulignée correspond au début de la séquence identique à celle publiée de l'ADNc de la P4501101 humaine (Kawamoto et al., 1990).

La cassette NotI qui porte le promoteur CYCI et l'ADNc chimérique de la P4501 101 contient également une partie non codante située en 3'de l'ADNc. Cette partie non codante est composée de 3 éléments une partie non codante provenant de l'ADNc naturel et une partie non codante provenant du plasmide pCMV4 dont la séquence est déposée à Genbank sous le numéro AF239248 (Andersson et al., 1989). En outre, les seules parties non codantes provenant du pCMV4 terminateur du gène de l'hormone de croissance humaine et de l'intron du gène de la P globine de lapin sont conservées dans le vecteur final pCV29.

Au final un fragment d'ADN portant des sites de restriction NotI contient de 5'vers 3'le promoteur CYCI, un ADNc chimérique encadré par des sites SalI et MluI contenant une partie codant pour la préséquence de la cytochrome oxydase fusionnée à un fragment de la P45011p bovine jusqu'à la partie correspondant au site

de restriction puis la fin de l'ADNc correspond à l'ADNc de la P4501 humaine.

La partie non codante est composée de trois d'origine de mammifère.

Cette cassette NotI est transférée dans le plasmide pTG10359 qui est issu du plasmide pTG10350 (Dumas et al., 1996) digéré par les enzymes de restriction CM et PvuII et religué sur lui-même.

Ce plasmide pTG10359 possède en outre un site de restriction unique NotI.

Le plasmide pCV29 est un plasmide 3 cassettes qui contient les cassettes d'expression pour la forme mature de l'ADX et la forme mature de la P450Scc et une forme de la CYP11B1 humaine ciblé à la mitochondrie.

Le plasmide pTG10022 est décrit dans la publication de Degryse et al., 1995, incorporée par référence à la présente demande, et contient une origine de réplication 2 micron pour la levure S.cerevisiae ainsi que les éléments pour le clonage dans E. coli.

Les sites de restriction de ce plasmide ont été modifiés avec les oligonucleotides OLIP 174 et OLIP 175 (respectivement SEQ ID N° 28 et 29) afin d'y intégrer les sites de restriction AscI et PmeI.

Au site de restriction NotI de ce plasmide, on a introduit une double cassette d'expression du plasmide pCD63 décrit par Duport et al., 1998. Cette double cassette d'expression contenue sur un fragment NotI contient une cassette d'expression pour la forme mature de l'ADX bovine et une cassette d'expression pour la forme mature de la P450SCC bovine encadrant un marqueur de sélection URA3. Dans le site unique PmeI à bouts francs de ce plasmide, la cassette d'expression du cytochrome P450110 contenant l'ADNc de la P45011ß humaine sous contrôle des promoteurs CYCI et terminateur PGKI a été introduite après remplissage des extrémités NotI par l'ADN polymérase fragment de Klenow.

L'un des plasmides obtenus pCV29 contient trois cassettes d'expression pour l'ADX, la P450SCC (toutes deux sous forme mature), ainsi qu'une forme de la P45011(3 humaine ciblé à la mitochondrie. En outre ce plasmide porte comme marqueur le gène URA3 encadré par deux cassettes d'expression. b) Construction du plasmide pCC12 Le plasmide pCC12 (cf. Figure 4) est un plasmide réplicatif de levure à base de l'origine de réplication chromosomique comme 1'gS1 et d'un centromère CEN

(il y en a 16 dans la levure) tous les deux de S. cerevisiae. Ce plasmide se réplique sous forme à une ou deux copies dans la levure.

Il a été construit à partir du pFL38C2 qui est dérivé de pFL38 (Bonneaud et al., 1991, dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande, notamment les descriptions des plasmides). Dans ce plasmide, on a introduit au site HindIII un oligonucléotide qui contient la séquence de reconnaissance des sites NotI, PacI et AscI (OLIP FL SEQ ID N° 24). L'orientation du polylinker a été vérifiée par séquençage. Ce plasmide porte un marqueur de sélection URA3 bordé par des sites BglII.

Le gène URA3 a été remplacé par un gène ADE2 de 2,7Kb obtenu par amplication par PCR sur le génome de FY1679-28c én utilisant les oligonucléotides 5'ADE2090 (SEQ ID N° 37, CGATTCGGATCCACTAGTAACGCCGTATC- GTGATTAACG) et 3'ADE2089 (SEQ ID N° 38 (CCTCAAGGATCCTCCTG- ACGTAGCGCTATCCTCGGTTCTG).

Pour ce faire le plasmide pFL38C2 a été digéré par l'enzyme Bgln, le fragment BglU URA3 a été remplacé par le fragment de 2,7 Kb contenant le gène A-DE2. Le plasmide obtenu pAMI sert de base pour la construction du plasmide pCC12.

Construction du plasmide à partir du plasmide pAM 1 : Le plasmide pCC12 contient deux cassettes d'expression l'une pour le 3ß- HSDH d'origine bovine l'autre pour l'adrenodoxine reductase également d'origine bovine.

L'ADNc de la 3p-HSDH bovine a été recloné par PCR à partir d'une banque d'ADNc de surrénales de boeuf. La séquence codante de l'ADNc publié par Zhao et al., 1989, n'a pas été modifiée.

Les deux oligonucléotides rajoutent un site SalI et 4 adénines devant l'ATG pour donner la séquence GTCGACAAAAATG (SEQ ID N° 25). Le site MM est situé au ras du codon de terminaison de l'ADNc de la 3p-HSDH bovine pour donner la séquence : fin de l'ADNc TGACCTGGAGTGACAATGACGCGT (SEQ ID N° 26). La séquence reconnue par l'enzyme MM est ACGCGT.

L'ADNc est transféré sous forme d'un fragment SalI, Mul dans le plasmide pTG10212 pour donner le plasmide pCC4. Ce plasmide possède donc un fragment

NotI contenant l'ADNc de la 3p-HSDH bordé par et un promoteur TDH3 et un terminateur PGK1, respectivement en 5'et en 3'. Cette cassette d'expression est transférée ensuite dans le plasmide pTG12018 ainsi la cassette est maintenant bordée en 5'd'un site NotI et en 3'd'un site AscI. Ce fragment est ensuite cloné dans le plasmide d'expression de la levure pAMl dans les sites NotI et AscI pour donner le plasmide pCC 11.

Dans le site NotI de ce plasmide, on insère le fragment NotI portant le promoteur TEF1, l'ADNc de la forme mature de l'adrenodoxine reductase d'origine bovine, et le terminateur de levure PGKI, respectivement dans cet ordre provenant du plasmide pTG10361.

Ce plasmide porte le même ADNc qui est décrit dans Dumas et al., 1996, (dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande, notamment les descriptions des plasmides) sauf que la séquence d'adressage du précurseur de la cytochrome oxydase a été remplacée par un codon methionine. L'ADNc code donc pour une forme mature de l'ADNc de l'adrenodoxine reductase.

Exemple 10 : Construction de la souche CDR07 La souche CDR07 a été obtenue par croisement entre les souches FY1679- 18b MAT a et la souche CA10 MAT a décrite par Duport et al., 1998.

Ces deux souches ont été tout d'abord isolées sur un milieu riche contenant du glycérol puis sur un milieu dans un milieu contenant de l'acétate de potassium comme décrit dans « Yeast Protocols Methods in Cell and Molecular Biology Edited By Ivor H Evans in 1996. Humana Press Totowa New Jersey ».

Après sporulation, les tétrades ont été digérées par de la zymolyase 100T pendant 30 minutes à 37°C. Plusieurs cycles de sélection ont été appliqués pour obtenir un clone qui produise du campéstérol comme stérol majoritaire en ayant perdu les autres caractères de CA10.' Les spores sont tout d'abord sélectionnées sur un milieu minimum contenant de la nystatine avec des suppléments (adénine, leucine, tryptophane, uracile, histidine). Les clones résistants à la nystatine et auxotrophe pour l'adénine et la leucine sont ensuite repiqués sur milieu riche contenant de l'adénine et d'hygromycine (200tg/ml) pour détecter la délétion du gène ERGS par le gène de résistance à l'hygromycine.

Des clones auxotrophes pour l'adénine, la leucine (et l'uracile et le tryptophane) et également résistants à l'hygromycine et à la nystatine sont analysés pour leur profil stérolique. Deux clones de signes sexuels opposés produisant du campéstérol comme stérol majoritaire sont sélectionnés.

Us sont nommés CDR07 MAT a et CDR07 MAT a.

Exemple 11 : Construction des plasmides d'intégration pTG12093 et pLIP5 respectivement pour les locus HIS3 et TRP1. a) Construction du pLIP5 Le pLIP5 est plasmide qui peut être utilisé pour les intégrations génomiques au locus TRPI ou comme plasmide multicopie dans la levure S. cerevisiae. Le plasmide de. base qui a servi à la construction de ce plasmide est le plasmide pFL45S décrit dans Bonneaud et al. 1991, dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande, notamment les descriptions des plasmides).

Un fragment d'ADN génomique correspondant à la partie 5'en amont du promoteur TRPI a d'abord été cloné en utilisant les oligonucléotides OLIP21 et OLIP22 (respectivement SEQ ID N °30 et 31) pour faire une amplification par PCR.

Le produit de PCR a d'abord été sous cloné dans pCR-Script AmpSK (+) (Stratagène, La Jolla California USA). Les extrémités OLIP21 et OLIP22 possèdent en effet en 5'un site NarI ainsi qu'un site HindIII en 3'. Ce fragment NarI, HindHI a remplacé les sites de clonage multiples du plasmide pFL45S décrit plus haut.

Le plasmide obtenu pLIP3 est de nouveau modifié en utilisant l'oligonucléotide OLIP20 (SEQ ID N° 32) qui sert à remplacer le site unique HindHI par le site unique NotI. Dans ce site NotI, on introduit un fragment contenant de 5'vers 3'le promoteur TEF1, l'ADNc du cytochrome P-450cl7alpha puis le terminateur PGK1 comme décrit dans Degryse et al., 1999 (dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande, notamment les descriptions des plasmides).

Le plasmide final pLIP5 peut servir à la fois de plasmide multicopie à base du marqueur TUPI, lorsque la partie 2 micron est retirée, on peut l'utiliser comme plasmide d'intégration au niveau du locus TRP1. La cassette est ainsi intégrée en 5' du gène TRPI.

M Construction du plasmide pTG12093 Ce plasmide est un plasmide d'intégration intergénique au niveau du locus HIS3. Ce plasmide est construit à partir du plasmide pUC-HIS3 décrit par Duport et al., 1998. Le site unique de restriction XhoI de ce plasmide a été transformé en un site de restriction unique NotI en utilisant un adaptateur approprié tout en détruisant le site X} oI pour donner le plasmide pUCl9-HIS3. Dans le site NotI unique de ce plasmide, un fragment NotI provenant du pTG10792. Ce fragment contient le promoteur TDH3 l'ADNc codant pour l'ADX bovine mature fusionnée à la séquence d'adressage du précurseur de la cytochrome de COX6 (de la sous unité 6 de la cytochrome oxidase de levure comme décrit dans Dumas et al., 1996. Le fragment de restriction SalI MM du plasmide pTG10350 contenant l'ADNc précédemment décrit a été transféré dans le plasmide pTG10211 pour former le plasmide pTG10792.

Ce plasmide possède donc un fragment de 1, 6 kilobases contenant le promoteur TDH3, l'ADNc fusionné entre l'ADX bovine mature et la présequence COX6 de levure, et le terminateur PGK1 de 5'vers 3'. Ce fragment NotI-NotI est inséré dans le plasmide pTG12093. La transcription de HIS3 et de la cassette d'expression sont dans la même orientation.

Exemple 12 : Croisement de CDR07 MATa avec TGY260 MATa La souche SB 14 (CDR07MATa X TGY260 MATa) est mise à sporuler dans un milieu très pauvre contenant de l'acétate de potassium. Les différents ascii sont ensuite mise à pousser dans un milieu minimum contenant les produits suivant uracile, histidine, tryptophane et adénine.

Les spores sont ensuite sélectionnées sur un milieu minimum correctement complémenté contenant de 8 à 121lg/ml de nystatine. Les spores positives sont ensuite sélectionnées sur la présence de l'ADNc de la P450-c21 humaine. Pour ce faire, on réalise un criblage des clones en milieu Kappeli (Arreguin de Lorencez M, Kappeli O J, 1987) avec comme source de carbone 2% d'éthanol (et 0,1% glucose) en présence de 300mg/ml de 170H progestérone.

La bioconversion est incubée jusqu'à 72 heures. La capacité de bioconversion est analysé en HPLC comme décrit par Dumas et al., 1996 et

Dégryse et al., 1999 (dont les contenus sont incorporés par référence à la présente demande, notamment les explications des études de bioconversion).

Ces clones} sont également analysés pour leur profil stérolique en chromatographie en phase gazeuse comme décrit par Duport et al., 1998 (dont le contenu est incorporé par référence à la présente demande, notamment les explications des études de bioconversion) en vue de détecter le campestérol et l'ergosta 5,22 diénol.

Trois spores YCC3, YCC4 et YCC5 sont sélectionnées comme produisant de l'ergosta 5,22 diénol et du campéstérol et convertissant le 170H-progestérone en 11-deoxycortisol avec une efficacité de production de 25,120 et 42 llg/ml en 72 heures, respectivement.

YCC4 et YCC5 sont ensuite sélectionnés pour deux nouvelles transformations successives avec les plasmides pLIP5 et pTG12093 linéarisés respectivement par les enzymes ApaLl et EcoRl. Les plasmides pLIP5 et pTG12093 sont des plasmides d'expression intergénique respectivement pour la P450c17 bovine et l'ADX bovine mitochondriale.

Le pTG12093 est un plasmide d'intégration dans la région intergénique en 3' du locus HIS3 tandis que le pLIP5 est un plasmide d'intégration dans la région intergénique en 5'du locus TRP1. En ouke ces deux plasmides portent un site unique NotI qui permet l'intégration d'une cassette d'expression contenant dans cet ordre ; promoteur 17EF1, ADNc P450c17 bovine, terminateur PGKI pour le pLIP5 dans cette ordre promoteur TDH3, ADNc COXVIpre : : mat ADX bovine, terminateur PGK1 pour le pTG12093.

La souche YCC4 est transformée successivement par les plasmides pLIP5 et pTG12093 linéarisés (par les enzymes de restriction ApaLI et EcoRI).

Lors de la première transformation, les clones transformants sont tout d'abord sélectionnés sur un milieu ne contenant pas de tryptophane. Les clones qui poussent en l'absence de tryptophane sont ensuite sélectionnés par PCR avec les oligonucléotides C17-3 et C17-5 (respectivement SEQ ID N° 33 et SEQ ID N° 34).

Un clone YCC8 est sélectionné pour une nouvelle transformation par le plasmide pTG12093 linéarisé. De la même manière, les clones qui poussent en l'absence d'histidine sont sélectionnés puis la présence de l'ADNc ADX est vérifiée

par PCR à l'aide des oligonucléotides ADX-3 ADX-5 (respectivement SEQ II7 N° 35 et SEQ ID N° 36).

Un clone UCY2 est sélectionné, son signe sexuel est MATa.

Exemple 13 : Construction de la souche UCY4 La souche UCY2 possède un gène ATF2 fonctionnel c'est à dire que la plupart de la pregnenolone produite est transformée en acétate de pregnenolone par la protéine ATF2p qui est une pregnenolone acétyl transférase dont la fonction naturel dans la levure est inconnue (Cauet et al., 1999). De plus cette réaction est irréversible et donc, une fois produite l'acétyl pregnenolone n'est plus transformable en hydrocortisone. Il apparaît donc important détruire cette activité pour permettre une meilleure production d'hydrocortisone.

Le gène ATF2 a donc été disrupté en utilisant un gène de résistance au G418. Pour ce faire un plasmide pAM3kanaC de disruption a été construit permettant l'introduction d'un marqueur de résistance au G418 dans le gène ATF2.

Ce plasmide a été construit à partir du plasmide pAMl (dont la construction a été décrite plus haut), du plasmide pTG12002 qui est un plasmide d'expression pour le gène ATF2.

Le pTG12002 est un plasmide d'expression pour ATF2 basé sur le plasmide pTG10260 (Degryse et al., 1995) dans le quel le site de restriction XbaI de l'origine de réplication 2 micron a été inactivé. Ce plasmide comprend donc une cassette d'expression pour le gène ATF2 (Cauet et al., 1999) comprenant le promoteur CECI, le gène ATF2 (encadré par les sites de restriction SalI et M/ul) et le terminateur PGK1. Cette cassette a été modifiée par PCR pour contenir le gène ATF2 complet comprenant le promoteur du gène ATF2, la séquence codante du gène ATF2, le terminateur du gène ATF2 sur un fragment de restriction KpnI, NotI.

Ce fragment KpnI-NotI est introduit aux sites KpnI-NotI du plasmide pAMl pour donner le plasmide pAM3.

Dans le plasmide pAM3, la cassette d'expression de la résistance au G418 est introduite dans le gène ATF2 entraînant son inactivation.

Pour ce faire le plasmide pAM3 est digéré par l'enzyme de restriction AccI, puis partiellement par l'enzyme de restriction SacI. Une bande d'environ 7500pb est purifiée sur gel. Le plasmide pFA6a kanMX4 (Wach et al Methods in Microbiology

Volume 26 Yeast Gene Analysis Chapitre 5 PCR-based Gene Targeting in Saccharomyces cerevisiae) est digéré par SacI et AccI, la bande à 1500pb est purifiée sur gel. Les deux fragments sont ligués puis transformés. Un plasmide est obtenu pAM3kanaC. Le pAM3kanaC est digéré par PvuII et NotI, la bande à 2215pb est purifiée sur gel, puis transformé dans UCY2 qui est étalée sur des boites de milieu riche contenant 130 ug/ml de G418. Environ 600 clones sont repiqués sur ce milieu contenant du G418, deux clones sont résistant au G418. Un clone ne contenant pas le plasmide pAM3 est conservé.

Cette méthode d'inactivation de gène est bien connue de l'homme du métier.

Le clone unique ainsi obtenu est mis à bioconvertir avec 100pg/ml de pregnénolone dans du milieu Kappeli.

Au bout de 24 heures, l'absence de pregnenolone acétate est vérifié par extraction et chromatographie en phase gazeuse comme décrit dans Cauet et al 1999. Ce phénomène indique que le gène ATF2 responsable de l'acétylation de la pregnenolone a bien été disrupté et n'est plus fonctionnel. La souche est nommée UCY4.

Exemple 14 : Construction des souches UCY3 et UCY26.

Le criblage des spores obtenues par croisement des souches CDR07 et TGY260 a donné plusieurs souches dont les souches YCC4 et YCC5. Comme décrit ci-dessus, la souche YCC4 a été transformée par une série de 2 plasmides : pLIP5 et pTG12093. Une spore UCY2 a alors été sélectionnée (cf. exemple 12). De la même manière, la souche YCC5 a également été transformée par les plasmides pLIP5 et pTG12093 et une nouvelle spore nommée UCY3 a été obtenue. Comme UCY2, UCY3 est caractérisée par la présence et l'expression de la A7 réductase d'A. thaliana mesurée par la résistance à la nystatine et la présence de brassicastérol et de campestérol comme stérol majoritaire de ces levures recombinantes. La présence de l'ADNc ADX est vérifiée par PCR à l'aide des oligonucléotides ADX-3 et ADX-5 (respectivement SEQ ID ? 35 et SEQ ID N° 36), puis par Western blot comme décrit dans Dumas et al., 1996, incorporé par référence ici pour ce qui est de la description de cette technique.

L'activité d'hydroxylation en 17 et en 21 de la progestérone est vérifiée par bioconversion de la progestérone en 170H-progestérone et 11-deoxycortisol. Pour

ce faire, la souche est incubée en présence de 200mg/1 de progestérone comme décrit dans Dumas et al., 1996 et Degryse et al., 1999 UCY3 est capable de produire du 11-deoxycortisol à partir de la progestérone indiquant la présence des activités P450c17 et P450c21. On détecte également la présence de 4 prégnène 17a, 20a diol 3 one indiquant qu'au moins une des deux activités codées par GCY1 ou YPR1 est présente dans la souche. Pour éviter l'accumulation d'acétate de pregnenolone, l'activité d'acétylation de la pregnenolone codée par le gène ATF2 a été éliminée. Dans ce but, le plasmide pAM3kanaC (cf. exemple 13) a été utilisé pour transformer la souche UCY3. Le pAM3kanaC est tout d'abord digéré par PvuII et NotI, la bande à 2215pb est purifiée sur gel, puis transformée dans UCY3 qui est étalée sur des boites de milieu riche contenant 130 llg/ml de G418. Des colonies résistantes à l'antibiotique G418 et qui ne sont plus capables de transformer la pregnenolone en acétate de pregnenolone sont isolées ; une colonie UCY26 est plus particulièrement sélectionnée pour de nouvelles transformations et pour tester sa production d'hydrocortisone.

Exemple 15 : Construction de la souche UCY5.

Dans le but de disposer d'une meilleure variabilité génétique, la souche UYC2 (cf. exemple 12) a été croisée avec la souche TGY245 (cf. exemple 5), une souche diploïde YSA2-2n a ainsi été sélectionnée. Cette souche a été mise en condition de production d'asques et 85 asques ont été disséqués (comme décrit dans « Yeast Protocols in Molecular Biology Volume 53 p59-67,1996 »). Les spores isolées sont criblées sur leur propriété auxotrophe. Ainsi, les clones capables de croître en l'absence de tryptophane et d'histidine et nécessitant de l'adénine sont plus particulièrement sélectionnés. L'expression de la A7 réductase est vérifiée en s'assurant de la résistance de la souche à la nystatine ainsi que de la présence de campestérol et brassicastérol dans la membrane de ces souches. Cette dernière analyse est réalisée par chromatographie en phase gazeuse des stérols totaux de ces souches comme décrit dans Duport et al., 1998. De plus la présence des ADNcs codant pour la P450c17 et l'ADX est vérifiée par PCR à l'aide des oligonucléotides C17-3 et C17-5 (respectivement SEQ ID N° 33 et SEQ ID N° 34) et des oligonucléotides ADX-3 et ADX-5 (respectivement SEQ ID N° 35 et SEQ ID N° 36) respectivement. Finalement, la fonctionnalité des gènes GCY1 et YPR1 dans

ces spores positifs est vérifiée de deux manières : soit par PCR, soit par absence de l'activité 20 alpha réductase sur la 17 OH progestérone.

Par PCR, en utilisant la paire d'oligonucléotides X1TEF1 et X2C21 (respectivement SEQ ID N° 47 et SEQ ID N° 48), on détecte la disruption du gène YPR1 par la cassette d'expression pour la P450c21 humaine dans S. cerevisiae contenant le promoteur TEF1, le cDNA de la P450c21 humaine ainsi que le terminateur PGK. On détecte également par PCR, en utilisant la paires d'oligonucléotides X3TDH3 et X2C21 (respectivement SEQ ID N° 49 et SEQ ID N° 48), la disruption du gène GCY1 par la cassette d'expression pour la P450c21 humaine dans Scerevisiae contenant le promoteur TDH3, le cDNA de la P450c21 humaine ainsi que le terminateur PGK.

La disparition des deux activités GCY1 et YPR1 et la présence de l'activité correspondant à l'activité P450c17 et P450c21 sont finalement vérifiées par bioconversion de la progestérone en 11-deoxycortisol dans les conditions décrites par Dumas et al 1996 modifiées par Degryse et al 1999. Les levures recombinantes sont incubées à 30°C en présence de 200mg/1 de progestérone avec une densité cellulaire de 5 dans un milieu de culture de type Kappëli contenant 2% de galactose ou 2% de glucose comme source de carbone, dans un volume de 10ml. Après une incubation de 48 heures, on extrait le milieu de culture de ces levures comme décrit précédemment et on mesure en particulier la quantité de 170H progestérone et 11- deoxycortisol produite par HPLC. La spore sélectionnée ne produit plus de quantité détectable de 4 prégnène 17a, 20a diol 3 one mais produit de la 170H progestérone et du 11-deoxycortisol en utilisant les deux sources de carbone. Le clone choisi produit la plus grande quantité de 11-deoxycortisol.

Une souche répondant positivement à tous ces critères est plus particulièrement sélectionnée pour de nouvelles transformations, cette souche est nommée UCY5.

Exemple 16 : Construction des plasmides pFM10 et pTG10897. a) Construction du plasmide pFM10 Le plasmide pFM10 est un vecteur permettant l'expression simultanée de 4 protéines chez la levure. Il ne contient pas d'origine de réplication pour E. coli ni de gène de résistance à l'ampicilline, ce plasmide ne peut donc pas se répliquer chez

E. coli. Son obtention est réalisée par recombinaison chez la levure de deux plasmides : pFM7 et pCB12. Contrairement au plasmide pFM10, ces derniers se répliquent tous deux chez E. coli puisqu'ils possèdent le réplicon E. coli. Le plasmide pFM7 se réplique également chez S. cerevisiae, puisqu'il comporte également, l'origine de réplication 2 micron de la levure S.cerevisiae. Ces deux plasmides possèdent en outre les séquences RI et R2 (respectivement SEQ ID N° 39 et SEQ ID N° 40) bordant les cassettes d'expression ainsi que les marqueurs de sélection.

Les séquences RI et R2 proviennent du gène de la photochlorophyllide oxydoréductase d'A thaliana et leur taille est d'environ 300 paires de bases chacune.

Les deux séquences RI et R2 sont clonées en orientation inverse dans les plasmides pFM7 et pCB12. Ainsi, entre les séquences RI et R2, le plasmide pFM7 contient dans l'ordre : l'origine de réplication 2 micron contenu dans le fragment 2 micron (fragment bordé par les sites de restriction EcoRI, tel que décrit par Urban et al., 1994), un fragment bordé par des sites NotI provenant du plasmide pCD63 décrit dans Duport et al., 1998 contenant deux cassettes d'expression pour la forme mature de la P450scc et la forme mature de l'ADX séparée par le gène URA3 de la levure fonctionnel, vient ensuite la séquence R2. De la même façon le plasmide pCB12 contient les séquences RI et R2 mais clonées dans le sens inverse de celle du plasmide pFM7. Ainsi, entre les séquences R2 et RI, on trouve la cassette d'expression pour la P4501lp, le marqueur de sélection ADE2, la cassette d'expression pour la 3ß-HSD d'origine bovine. La cassette d'expression pour la P4501lp provient du plasmide pCV29 et contient le promoteur CYC1, un ADNc hybride codant pour la P4501l. ß et un terminateur PGK. Le gène ADE2 provient du plasmide pAMl, il s'agit du fragment BgIII-BgIII. De même, la cassette d'expression pour la 3ß-HSD bovine c'est à dire le promoteur TDH3, l'ADNc de la 3ß-HSD bovine et le terminateur PGK provient du plasmide pCC12, il s'agit du fragment ClaI-AscI. b) Construction du plasmide pTG10897 A l'aide de deux oligonucléotides 20mers correspondant respectivement à la partie 5'et 3'de la séquence codante du gène ATF2 (et comprenant également les sites de clonage) et en utilisant comme matrice de l'ADN génomique de la souche

FY 1679-28c, on amplifie par PCR la séquence codante du gène ATF2. Ce produit de PCR est ensuite digéré par les enzymes ClaI et HindIII et est cloné entre les sites ClaI et HindIII du plasmide pTG10031 [Degryse, 1995 #102] pour donner le plasmide pTG10885. Ce plasmide sert de base à la construction d'un plasmide de disruption du gène ATF2. La séquence du gène URA3 a été amplifiée à partir d'ADN génomique de la souche TGY156 (décrit dans Cauet et al. 1999 et incorporé ici par référence), cette souche possède en effet un gène ATF2 interrompu par le gène URA3. Les oligonucléotides OTG10842 (SEQ ID N° 41) et OTG10841 (SEQ ID N° 42) ont donc servi à l'amplification sur matrice d'ADN génomique de la souche TGY156 et le produit de l'amplification a servi d'amorce de recombinaison avec le plasmide pTG10885 digéré par les enzymes derestrictionBstXTetStuI.

On obtient ainsi le plasmide pTG10897 contenant la séquence codante du gène ATF2 interrompue par le gène URA3. En effet, le gène URA3 fonctionnel se trouve entre 509 nucléotides de la partie 5'de la séquence codante d'ATF2 et 444 nucléotides de la partie 3'de cette séquence codante.

Exemple 17 : Construction des souches UCY6, UCY16. UCY16-pFM10, UCY19, UCY20, UCY24, UCY25* UCY27.

A partir de la souche UCY5, une série de nouvelles souches a été construite dans le but d'améliorer la production de stéroïde d'intérêt. En effet, la souche UCY5 n'exprime pas d'adrenodoxine réductase qui est un composant essentiel de la réaction de coupure de la chaîne latérale par la P450scc. D'autre part, comme il a été décrit auparavant, le gène ATF2 code pour une acétyl transférase qui utilise la prégnénolone comme substrat et sa disruption permet de supprimer cette réaction parasite d'acétylation et d'augmenter ainsi le rendement en stéroïde d'intérêt. Enfin, la voie de biosynthèse exogène utilise l'activité ARHIp endogène, cette dernière étant essentielle à la survie de la levure. Cependant, cette activité mitochondriale, qui remplace l'adrenodoxine réductase de mammifère, pourrait être limitante dans les souches produisant de l'hydrocortisone. Une souche possédant certaines modifications permettant d'augmenter de manière conséquente le rendement de production en stéroïde d'intérêt a donc été construite à partir de la souche UCY5,.

Ainsi cette souche est dépourvue d'activité ATF2, surproduit la protéine adrenodoxine réductase et surproduit également la protéine ARH1.

Pour permettre une expression de l'ADR dans la souche UCY5, cette dernière a été transformée par le vecteur pTG10925 (cf. exemple 2 f) qui lorsqu'il est transformé dans la levure sous forme linéaire permet l'intégration au locus LEU2 et l'expression de l'ADR sous contrôle du promoteur TEF1. L'expression de l'ADR a été vérifiée par Western blot comme décrit dans Dumas et al., 1996. Un clone exprimant l'ADR et nommé UCY6 a plus particulièrement été utilisé pour les transformations suivantes.

Dans le but d'éliminer la réaction parasite d'acétylation transformant la prégnenolone en acétate de pregnenolone et catalysée par l'enzyme ATF2, le gène ATF2 codant pour cette enzyme a été disrupté. Ce dernier a en effet été interrompu par le marqueur URA3, pour ce faire, le fragment NotI du plasmide pTG10897 qui contient la séquence du gène ATF2 interrompu par le gène fonctionnel de levure URA3 a été utilisé. Ce fragment est utilisé pour transformer la souche UCY6. Les colonies capables de croître en l'absence d'uracile sont sélectionnées, puis on mesure la capacité de ces clones à transformer la pregnenolone en acétate de pregnenolone comme décrit par Cauet et al., 1999. Un clone capable de croître en l'absence d'uracile et incapable de transformer la pregnenolone en acétate de prégnenolone est plus particulièrement isolé. Ce clone est appelé UCY16.

Cette souche ne pouvant pas être transformée par des plasmides portant uniquement le marqueur URA3, deux nouveaux plasmides ont été construits : les plasmide pCB 12 et pFM7. Ces deux plasmides lorsqu'ils sont recombinés ensemble, permettent d'obtenir le plasmide pFM10 basé sur les marqueurs URA3 ou/et ADE2 (cf. ci-dessus et Figure 5). Ainsi pour obtenir le plasmide pFM10, le plasmide pFM7 est linéarisé par l'enzyme de restriction et le fragment d'ADN correspondant est isolé sur gel. Le plasmide pCB12 est quant a lui digéré par Bash1 et la bande de 9300 paires de bases est isolée selon les techniques classiques de biologie moléculaire. Environ 5 ; j. g des fragments de pCB12 et pFM7 sont mélangés et servent à transformer la souche UCY16. Quelques clones UCY16- pFM10, capables de pousser en milieu minimum (sans uracile et d'acides aminés), sont isolés et les souches correspondantes sont testées pour leur niveau de production de stéroïdes selon le protocole décrit ci-dessous.

Alternativement et dans le but de pouvoir utiliser par la suite les plasmides du type pCV29 basés sur un marqueur URA3, la disruption du gène SEE2 dans la

souche UCY6 a également été obtenue en transformant cette souche par le plasmide pAM3kanaC linéarisé (cf. exemple 13). Les colonies résistantes au G418 sont ensuite testées pour l'absence ou la présence de l'activité pregnenolone acétyl transférase comme décrit par Cauet et al. 1999. Une colonie résistante au G418 et. ne possédant plus l'activité pregnenolone acétyl transférase est plus particulièrement sélectionnée. Cette souche est appelée UCY24.

Dans le but d'augmenter l'activité ARH1 dans une souche contenant une voie de production exogène de l'hydrocortisone, la souche UCY5 a été transformée par les plasmides pTG12048 ou pTG12050 linéarisé au préalable par diol et SapI respectivement. Le plasmide pTG12048 qui a été décrit ci-dessus permet la surexpression du gène ARE1 au locus LEU2 sous contrôle du promoteur CECI. Le plasmide pTG12050 diffère du plasmide pTG12048 uniquement par le fait que le promoteur CYCI contrôlant l'expression du gène ARHI a été remplacé par le promoteur TEFI tel que décrit dans Degryse et al., 1995 et Dumas et al. 1996.

UCY5 a été transformée par pTG12048 ou pTG12050 linéarisé. Dans chacun des deux cas, les colonies capables de pousser en l'absence de leucine ont été sélectionnées. De plus la présence des cassettes d'expression pour le gène ARH1 a été vérifiée par PCR. Deux couples d'oligonucleotides permettent en effet de vérifier la présence d'une copie supplémentaire du gène ARHI (sous contrôle du promoteur CYCI ou TEFI). D'une part, le couple arh1D (SEQ ID N° 43) et nfslR (SEQ ID N° 44) permet de vérifier la présence de la jonction entre le gène ASH1 et le gène NFS1. D'autre part, le couple leu2D (SEQ ID N° 45) et arhIR (SEQ ID N° 46) permet la vérification de la jonction entre le gène LEU2 et le gène ARH1.

Outre la présence de la cassettes d'expression pour le gène ARH1 codant pour l'activité ARH1, l'expression de la protéine ARHlp a également été testée dans les clones obtenus. La détection de la surexpression d'ARHlp n'est cependant pas chose aisée. Ce fait est dû à la présence naturelle de la protéine ARHIp à un faible niveau dans les souches de S. cerevisiae. Des expériences de Western Blot réalisées comme décrit dans Dumas et al., 1996 permettent cependant de confirmer l'augmentation de la quantité d'ARHlp. En plus des expériences de Western Blot qui s'avèrent délicates, la présence d'une quantité accrue d'ARHlp peut être vérifiée par des expériences de réduction du cytcochrome c ou de 11 bêta hydroxylation du 11-deoxycortisol reconstituées in vitro avec des mitochondries

purifiées des levures recombinantes comme décrites dans Lacour et al., 1998 et Dumas et al., 1996, respectivement. Deux clones, UCY19 et UCY20, respectivement transformé par pTG12048 et pTG12050 et surexprimant ARHI, sont plus particulièrement sélectionnés. Le gène ATF2 a ensuite été disrupté dans ces souches comme décrit plus haut. Brièvement, le plasmide pAM3kanaC a été linéarisé puis utilisé pour transformer les souches UCY19 et UCY20. Les clones ont ensuite été sélectionnés pour leur propriété de résistance au G418 et l'absence d'activité pregnenolone acétyl transférase comme décrit par Cauet et al. 1999. Deux clones dérivés de UCY19 et UCY20 sont plus particulièrement sélectionnés. Il s'agit respectivement des souches UCY25 et UCY27 (cf. Figure 2).

Exemple 18 : Production de stéroïdes par les souches selon l'invention a) Transformation des UCY2 et UCY4 par pCV29 et pCC12 Les souches UCY2 et UCY4 ont été transformées par les deux plasmides pCV29 et pCC12, décrits plus haut, dont les structures sont rappelées ci-dessous et dans les figures 3 et 4.

Le plasmide pCV29 porte une origine de réplication de type 2 micron pour réplication chez la levure. En outre, ce plasmide porte 3 cassettes d'expression respectivement pour la P45011 (3 humaine/bovine hybride ciblé à la mitochondrie tel que décrit précédemment, les formes matures (avec une méthionine à l'extrémité NH2 terminal) de l'adrenodoxin et de la P450s L'expression de ces trois protéines est sous le contrôle des promoteurs CYCI (P45011ß) et GALIOICYCI (ADX et P450s sous forme mature).

Le plasmide pCC12 est un plasmide à bas nombre de copie qui porte une cassette d'expression pour la forme mature de l'adrenodoxin reductase bovine sous contrôle du promoteur TEFI ainsi qu'une cassette d'expression pour la 3p-HSD bovine sous contrôle du promoteur TDH3.

Ces souches sont mises à pousser dans des conditions classiques de fermentation en milieu Kappeli avec du glucose comme source de carbone. A la fin de la fermentation (180h), les stéroides sont extraits comme décrit précédemment et caractérisés en chromatographie liquide haute pression.

L'identité des produits a été vérifiée par chromatographie en phase gazeuse, par chromatographie haute pression en phase liquide et en phase reverse couplé ou non avec la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire (cf. Table 1).

Table 1. Bilan des stéroïdes obtenus (résultats exprimés en mg/l) Souches Acétate de Proges 4-prégnène-Non-Cortico-Hydro- prégné--térone 17a-20a identifié stérone cortisone nolone diol 3 one UCY2/pCV29 18 7 5 5 12 15 +pCC12 UCY4/pCV29 0 30 44 24 23 80 + pCC12 b) Transformation des souches UCY24, UCY25* UCY26 et UCY27 par pCV29 et pCC12 et transformation de la souche UCY16 par pFM10 Ces souches possèdent de nombreuses modifications et s'avèrent difficiles à transformer. En conséquence, un protocole basé sur la préparation de sphéroplastes a été utilisé pour ces transformations, comme décrit par Burgers et al., 1987.

UCY16 a été transformé suivant ce protocole par les plasmides pFM7 et pCB12, ces derniers donnant le plasmide pMF10 par recombinaison in vivo chez la levure.

Comme décrit ci-dessus, le plasmide pFM10 est un plasmide multicopie de levure, ne contenant pas de séquences bactériennes et permettant l'expression de 4 protéines hétérologues. Ces quatre protéines sont comme vu précédemment : une forme chimérique du cytochrome P450np, la la 30-HSD bovine, l'ADX mature et le cytcochrome P450, mature. Les ADNc correspondants sont placés respectivement sous le contrôle des promoteurs CYCI, TDH3, GAL10/CYC1 et GALIO/CYCI. Les transformants sont sélectionnés sur un milieu minimum sans aucun ajout. La sélection se fait uniquement sur le marqueur ADE2 (croissance en l'absence d'adénine), la présence d'un gène fonctionnel URA3 dans le génome et qui sert à l'inactivation du gène ATF2 ne permet pas la sélection sur le gène URA3. Il est donc nécessaire de cribler plusieurs colonies pour être sûr d'avoir un plasmide pFMIO fonctionnel dans la souche UCY16..

Les souches UCY24, UCY25, UCY26 et UCY27 ont été transformées par les plasmides pCV29 et pCC12 selon le même protocole de préparation de sphéroplastes. Comme décrit ci-dessus, le plasmide pCV29 est un plasmide multicopie navette entre E. coli et S. cerevisiae. Il permet l'expression du cytochrome P450np, l'ADX mature et du cytochrome P450scc respectivement sous le contrôle des promoteur CECI, GAL10/CYC1 et GXL10/CYC1 (cf. Figure 3). Le plasmide pCC12 est un plasmide monocopie de levure permettant l'expression de l'ADR mature bovine et de la 3 (3-HSD bovine sous le contrôle des promoteurs TEF1 et TDH3, respectivement (cf. Figure 4).

Toutes ces souches sont mises à pousser en Erlenmeyer (volume 100 ml et contenant 30 ml de milieu de culture) dans des conditions classiques de fermentation en milieu Kappeli avec comme source de carbone 2% d'éthanol et 0.1% de glucose. Après 168 heures de culture, 5001l1 de milieu de culture (cellules + milieu) sont extrait en deux fois à l'aide de 4ml de dichloroéthane. La phase organique est rassemblée puis séparée en deux pour être séchée sous flux d'azote.

L'extrait sec est resuspendu dans 1001l1 d'un mélange acétonitrile/eau (50/50 volume/volume) ou 100. 1 de dichloroéthane. Les extraits resuspendus dans le mélange acétonitrile/eau sont traités par HPLC, ceci permet une analyse de la composition en différents stéroïdes (hydrocortisone, cortexolone, corticosterone, 170H-progesterone, 4 prégnène 17a, 20a diol 3 one) comme décrit dans Valvo et al., 1994. Les extraits resuspendus dans le dichiloroéthane sont analysés par chromatographie en phase gazeuse comme décrit dans Duport et al., 1998, cette dernière analyse permettant de mesurer la quantité de pregnenolone et de progesterone des échantillons. Pour chacune des souches transformées, on mesure ainsi la productivité en stéroïdes d'une dizaine de clones. Les résultats présentés ci- dessous, donnent les résultats du meilleur des dix clones testés pour chacune des souches UCY24, UCY25, UCY26 et UCY27 transformées par pCV29 et pCC12 et de la souche UCY16 transformée par pFMIO. Table 2. Bilan des stéroïdes obtenus (résultats exprimés en mg/1 sauf la dernière ligne : résultats exprimés en pourcentage de la totalité des stéroïdes) UCY24 UCY25 UCY26 UCY27 UCY16 UCY4 pCV29+ pCV29+ pCV29+ pCV29+ pFM10 pCV29+ pCC12 pCC12 pCC12 pCC12 pCC12 17 OH progesterone 0,6 0,6 1,0 0,6 0,5 0,2 deoxycorticosterone 0,5 0, 0 0,2 0,3 1 0, 0 cortexolone 4,5 2,7 2,1 2,0 7,6 0,7 4 prégnène 17a, 20a 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,5 diol 3 one corticostérone 7,5 10,8 7,5 9,0 8,9 3,4 hydrocortisone 17,7 29,2 22,3 24,7 15, 8 12,3 Stéroïdes Totaux 30,8 43,3 33,1 36,6 33, 8 21, 2 % hydrocortisone 57 67 67 67 47 58 NB : On ne détecte ni prégnenolone ni acétate de prégnenolone dans le milieu de culture de ces souches Les souches UCY16 pFM10, UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 et UCY27 pCV29+pCC12 présentées ci- dessus sont donc capables de produire des quantités d'hydrocortisone supérieures à celles produites par la souche UCY4/pCV29+pCC12. La quantité totale de stéroïdes passe ainsi de 21,2 ug/ml dans la souche UCY4/pCV29+pCC12 à 43,3 llg/ml dans la souche UCY25pCV29+pCC12 tandis que la quantité d'hydrocortisone passe de 12,3 Mg/ml à 29,2 ug/ml, respectivement. De plus, l'hydrocortisone représente dans ces exemples jusqu'environ 70% des stéroïdes totaux. On observe donc une forte augmentation de la quantité et de la qualité de l'hydrocortisone produite car aucune des ces souches ne produisent le contaminant 4 pregnen 17, 20 diol 3one. Cette dernière caractéristique particulièrement avantageuse est dûe à l'absence des protéines codées par les gènes GCYI et/ou YPRI qui sont responsables de la réaction de réduction de la cétone en 20.

Il est également intéressant de noter que de manière inattendue, la surproduction maîtrisée de ARHlp sous le contrôle du promoteur CYCI augmente de façon significative la quantité de stéroïdes totaux produits ainsi que la production d'hydrocortisone (cf UCY24 pCV29+pCC12 versus UCY25 pCV29+pCC12).

Cependant cette expression ne doit pas être trop importante pour obtenir l'effet

désiré. Ainsi, si une expression de la protéine ARH1 à un niveau supérieur par rapport à un niveau physiologique est souhaitable, il faut prendre garde à ne pas surexprimer trop fortement cette protéine sous peine de perdre cette augmentation de production en stéroïdes. Ainsi, le promoteur TEFI qui est reconnu comme beaucoup plus fort que CYCI (Nacken et al., 1996) donne des résultats insatisfaisants (cf. UCY25 pCV29+pCC12 versus UCY27 pCV29+pCC12). En conclusion la souche UCY25/pCV29+pCC12 a un potentiel estimé pour produire 200mg/1 d'hydrocortisone en fermenteur avec un seul contaminant majeur (la corticostérone) c) Exemple de production en grand volume des souches selon l'invention Deux des souches précédentes ont été mises à pousser en fermenteur grand volume en milieu Kappeli selon des techniques bien connues de l'homme du métier (cf. par exemple Risenberg D. et al., 1999). La technique de culture utilisée est un discontinu alimenté en milieu concentré (fed-batch). Le fermenteur de volume total 15 litres contient au départ 6 litres de mileu. L'ajout en continu de 4 litres de milieu concentré supplémentaire au cours de la fermentation ainsi que de liquides correcteurs de pH et l'ajout continu d'éthanol amène le volume final à 11,5 litres environ en fin de culture. Les souches UCY4 pCV29+pCC12 et UCY16 pFM10 ont ainsi été cultivées 180h et une production accrue en hydrocortisone a ainsi pu être obtenue (cf. table 3). A partir de ces résultats, il a été extrapolé les résultats envisageables pour les souches UCY24 pCV29+pCC12, UCY25 pCV29+pCC12, UCY26 pCV29+pCC12 et UCY27 pCV29+pCC12 (cf. table 3).

Table 3 Production d'hydrocortisone de différents clones obtenus selon l'invention (résultats en mg/1) Souches Hydrocortisone en mg/1 UCY4 pCV29+pCC12 80 UCY16 pFM10 110 UCY24 pCV29+pCC12 123* UCY25 pCV29+pCC12 203* UCY26 pCV29+pCC12 155* UCY27 pCV29+pCC12 172* * Ces résultats ont été obtenus par extrapolation des résultats obtenus en fermenteur grand volume avec les souches UCY4 pCV29+pCC12 et UCY16 pFM10.

Dépôt de matériel biologique Les organismes suivants ont été déposés le 24 janvier 2001 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, selon les dispositions du Traité de Budapest.

- Souche CDR07 MATa Numéro d'ordre I-2616 - Souche TGY260 Numéro d'ordre 1-2615 Liste des souches décrites dans la présente demande Fyl679-18b = (n) MATa ura3-52 trp1-#63 leu2-#1 his3-#200 fen1 GAL fenS ura- tip-leu his- Fy1679-28c = (n) MATα ura3-52 trpl-363 leu2-Dl} is3-X200 fenl GAL fens ura- trp-leu-his- TGY195 #4 = Fyl679-18b yprl : : URA3 TGY212-1 = Fy1679-18b ypr1 : : TEF1p : : P450c21 [5x ?] ura-trp-leu-his- TGY243-1 = TGY212-1 gcyl : : URA3 trp'leu his- TGY245-2D = TGY243-1 gcyl : : TDH3p : : P450c21 ura-trp-leu-his- TGY260-A = TGY245-2D LEU2 : : CYCLE ::ARH1 ura-trp-his- CDR01 = Fyl679-18b MATa LEU2 : :'b-mat ADR' ura-trp-his- CDR07 MATa= MATa ade2 : : GAL10/CYC1p : : A7 ura- trp- leu- his- ade- (spore de CA10 x FY1679-28c)

CDR07MATa= MATa ade2 : : GAL10/CYC1p : : A7 ura- trp- leu- his- ade- (spore de CA10xFyl679-28c) CA03 = CDR01 ade2 : : GAL10/CYC1p : : A7 ura- trp- ade- his-, resistant à la nystatine (Duport et al., 1998) CA10 = CA03 erg5::PGK1p::hygroR ura- trp- ade- his-, resistant à la nystatine et l'hygromycine (Duport et al., 1998) SB14 (2n) = TGY260-A x CDR07 Mata YCC4 = (n) MATa ade2 : : GAL10/CYC1p : : A7, LEU2 : : CYClp : : ARH1, yprl : : TEF1p : : P450c21, ERG5, fenl (?), ura- trp- ade- his-,, resistant à la nystatine, (spore de SB 14) YCC8 = YCC4 transformée avec pLIP5 (TRPI : : TEFIp : : P450c17 : : PGKlt), ura- ade- his-, resistant à la nystatine UCY2 = YCC8 transformée avec pTG12093 (HIS3::TDH3p::CoxVIpre:: matADX : : PGKl t) : HIS3 : : TDH3p : : CoxVIpre : : matADX : : PGKlt, ERG5, fen1 ( ?), ura adé, resistant à la nystatine UCY4 = UCY2 atf2-#: : G418R ura- ade-, résistante à la nystatine et au G418.

YCC5 = (n) MATa ade2 : : GAL10/CYC1p : : A7Reductase, LEU2 : : CYCLE : : ARH1, gcyl : : TDH3p : : P450c21, ERG5, fenl (?), ura- trp- ade- his-, (resistante à la nystatine, spore de SB 14).

YCC9 = YCC5 transformée avec pLIP5 (TRP1 : : TEF1p : : P450c17 : : PGKIt), ura- ade- his-, resistant à la nystatine.

UCY3 = YCC9 transformée avec pTG12093 (HIS3::TDH3p::CoxVIpre:: matADX : : PGKl t) : HIS3 : : TDH3p : : CoxVIpre : : matADX : : PGKlt, ERG5, fenl ( ?), ura- ade-, (resistante à la nystatine).

UCY26 = UCY3 atf2-# : : G418R ura- ade-, (résistante à la nystatine et au G418).

YSA2 (2n) = TGY245-2D x UCY2.

UCY5 = (n) MATα ade2 : : GAL10/CYC12p : : A7Reductase, LEU2 : : CYCIP : : ARH1, yprl : : TEF1p : : P450c21, ERG5, gcyd1 : : TDH3p : : P450c21 fen1 (?), ura-trp-his-, resistant à la nystatine, (spore de YSA2).

UCY6 =UCY5LEU2 : : TEF1::matADR::PGK1t,.

UCY16 =UCY6, af : : URA3 : : atf2.

UCY19 = UCY5, LEU2 : : CYCI : : ARHl.

UCY20 = UCY5, LEU2::TEF12::ARH1.

UCY25 = UCY19, atf2-# : : G418R (résistante à la nystatine et au G418).

UCY27 = UCY20, atf2-# : : G418R (résistante à la nystatine et au G418).

UCY24 = UCY6, atf2-#: : G418R (résistante à la nystatine et au G418).

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102, route de Noisy 93235 Romainville cedex L NOM ET ADRESSE DU DEPOSANT RECEPISSE EN CAS DE DEPOT INITIAL délivré en vertu de La règle 7.@ par 1'AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE identifiée au bas de cette page I. IDENTIFICATION DU MICRO-ORGANISME donnée par le Numéro d'ordre attribué par DEPOSANT : 1'AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE TGY260 1-2615 II. DESGRIPTION SCIENTIFIQUE ETjoU DESIGNATION TAXONOMIQUE PROPOSE _ ____ Le micro-organisme identifié sous chiffre 1 était accompagne : d'une description scientifique ir d'une désignation taxonomique proposée ii (Cocher ce qui convient) III. RECEPTION ET ACCEPTATION La présente autorité de dépôt internationale accepte le micro-organisme identifié sous chifire I, qu'elle a reçu le 24janvier2001 (date du dépôt initial) 1 IV. RECEPTION D''t ! NE REqUETE EN CONVERSION 'Ea-présente autorité de dépôt internationale a recu le micro-organisme identifié sous chiffre 1 le..' : -.' (date du dépôt initial) et a reçu une requête en. onversion du d6p6t initial en dépôt conformé au Traité de -'Buda. pest le (date de réception de la requête en conversion) V. AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE Nom : CNC Signature (s) de la (des) personne (s) M compétente (s) pour représenter l'autcrité Collection Nationale de dépôt internationale ou l' (des) deCulturesdeMieroorganismes employé (s) autorisê (s) : forfsWAGENER INSTITUT PASTEUR 28, Rue du Docteur Roux F-75724 PARIS CEDEX 15 Date-Paris, le 09 février1 1 En cas d'application de la règle 6. 4. d), cette date est La date à laquelle le statut d'autorité de dépôt internationale a évé acquis. | TRAITE DE BUDAPEST SUR LA RECONNAISSANCE INTERNATIONALE DU DEPOT DES MICRO-ORGANISMES AUX FINS DE LA PROCEDURE EN MATIERE DE BREVETS FORMULE INTERNATIONALE , DESTINATAIRE : Aventis Pharma S. A.

102, route de Noisy 93235 Romainville cedex NOM ET ADRESSE) DU DEPOSANT RECEPISSE EN CAS DE DEPOT INITIAL, délivre en vertu de la règle 7.1 ap@ l'AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE identifiée au bas de cette page 1. IDENTIFICATION DU MICRO-ORGANISME Référence d'identification donnée par le Numéro d'ordre attribué<par DEPOSANT : l'AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE : CDR07 Mat [alphal 1-2616 II. DESCRIPTION SCIENTIFIQUE ET/DU DESIGNATION TAXONOMIQUE PROPOSEE Le micro-organisme identifié sous chiffre 1 était accompagné : d'une description scientifique jt d'une désignation taxonomique proposée LJ (Cocher ce qui convient) III. RECEPTION ET ACCEPTATION Là présente autorité de dépôt internationale accepte le micro-organisme identifié sous chiffre I, qu'elle a recu le 24 janvier2001 (date du dépôt initial) IV. RECEPTION D'UNE REQUETE EN CONVERSION La présente autorité de dépôt internationale a reçu le micro-organisme identifié sous chiffre 1 le (date du dépôt initial) et a reçu une requête en conversion du dépôt initial en dépôt conforme au Traité de Budapest le (date de réception de la requête en conversion) V. AUTORITE DE DEPOT INTERNATIONALE Nom : Signature (s) de la (des) personne (s) compétence (s) pour représenter l'autorité Collection Nationale de dépôt internationale ou de 1' (des) de Cuttures de Microorganismes ployë (s) autorisé (s) ees WAGENER Adresse : INSTITUT PASTEUR 28, Rue du Docteur Roux t/ F-75724 PARIS CEDEX 15 Date : Paris, le 09février 1 -I u 1 En cas d'application de la règle 6. 4. d), cette date est la date à laquelle le statut d'autorité de dépôt interuationale a été acquis.