Levadura v plasmido para la exposition de proteinas en superficie

La presente invention se refiere a una levadura recombinante, un plasmido, y el empleo de ambos en la metodologia de exposition de proteinas en superficie de levaduras o Yeast Surface Display (YSD). Por Io tanto, la presente invention se encuadra en el sector de la biotecnologia, concretamente, en el campo de la ingenieria genetica y en la elaboration de librerias de proteinas de interes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La tecnica de exposition en superficie de levadura o Yeast Surface Display (YSD) se ha convertido en una herramienta versatil para aplicaciones industriales y de investigation. En 1997, K. Dane Wittrup y sus colegas describieron la primera construction y procesos de selection de bibliotecas YSD (Boder ET, Wittrup KD. 1997. Nat Biotechnol. 15(6): 553-7), y desde entonces, el campo ha experimentado un crecimiento explosivo. En la actualidad se utiliza ampliamente para la selection de anticuerpos, la ingenieria de proteinas, en el estudio de interacciones proteina-ligando, incluso en biocatalisis (Cherf GM, Cochran JR, 2015. Methods Mol Biol; 1319:155-75). El sistema de Wittrup se basa en la expresion regulada de una proteina abundante localizada en la pared celular, fusionada a una proteina concreta o libreria. El resultado es el recubrimiento de la pared celular de levadura con la proteina a deseada, de forma que a cada levadura contiene el material genetico que la produce. A partir del diseho original de Wittrup se han desarrollado gran cantidad de plasmidos con distintas propiedades, que en la mayoria de los casos han complicado su utilization y restringido su empleo a experimentos concretos (Yi L. et al. 2013. Proc Natl Acad Sci USA. 110(8): 7229-34).

El sistema mas utilizado es el que implica a las proteinas aglutininas de pared celular AGA1 y AGA2, como el descrito, por ejemplo, en la solicitud WO2010069913 A1. La solicitud US2010184136 A1 describe un metodo para mejorar la eficacia de la secretion de una proteina heterologa en un sistema de expresion de levadura. El metodo comprende (i) transformar una levadura defectiva en el gen que codifica Gal2 con una construction genica recombinante que comprende un promotor inducible por galactosa, una secuencia sehal de secretion y un gen que codifica una proteina heterologa, y (ii) cultivar la levadura transformada en condiciones que permitan el control del promotor inducible por galactosa. Yang, X. et al. 2019 (Microb Cell Fact 18:85. https://doi.org/10.1186/s12934-019-1133-x) describen una plataforma para la expresion de proteinas heteroIogas en la superficie de S. cerevisiae con mayor eficacia que el sistema clasico de aglutinina Aga1p-Aga2p. La eficacia de esta plataforma se basa en emplear una unica proteina de anclaje a la superficie (Agalp) en lugar de dos, de forma que se evitan la fragilidad de los puentes disulfuro a las condiciones redox.

Sin embargo, ninguno de estos sistemas consigue una expresion de la proteina de interes en la superficie celulas optima y en una cantidad suficiente para poder ser aplicado en un contexto industrial. Una mayor exposition es esencial para obtener resultados optimos, y ademas estos deben de estar controlados para conseguir una mejor reproducibilidad de los resultados.

Por Io tanto, existe en el estado de la tecnica la necesidad de optimizar, simplificar y flexibilizar un sistema para exposition de proteinas en la superficie celular, con el proposito de ofrecer un sistema controlado, escalable y que permita la automatization de cara a ser aplicado de forma industrial.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Los inventores han observado que mediante el reemplazo genico del promotor nativo que regula la expresion de AGA1 en levaduras por un promotor inducible por metabolito, como por ejemplo el promotor inducible por galactosa, la expresion de las proteinas recombinantes en la superficie de la levadura se incrementa con respecto a aquellas levaduras que presentan el promotor nativo (ver Ejemplos). Asi, los inventores han desarrollado una levadura que, empleada en la tecnica de exposition de proteinas en superficie de levadura o YSD (de sus siglas en ingles Yeast Surface Display), permite la optimization de la exposition en la superficie de la proteina de interes, superando asi los inconvenientes de otros metodos existentes en el estado de la tecnica.

Ademas, los inventores tambien han desarrollado un conjunto de plasmidos que permiten la co-expresion de dos proteinas de interes simultaneamente, la recuperation de dichas proteinas por tratamiento con proteasas y su purification posterior mediante cromatografia de afinidad. Los plasmidos desarrollados permiten la co-transformacion de los mismos en una unica levadura gracias a que contienen distintos marcadores de selection. Esta posibilidad de co-transformacion aumenta las aplicaciones del sistema YDS. Por un lado, en aplicaciones de biocatalisis, puesto que permite introducir mas de una proteina en superficie. Otros sistemas parecidos se basan en introducir sitios de anclaje en AGA2 y la production externa de proteinas que reconocen estos sitios, pero esto complica mucho la eficiencia y reproducibilidad de las reacciones. En experimentos de cribado de librerfas ademas es una ventaja porque se puede duplicar la representatividad de la librerfa, de forma que cada levadura contendria la information para dos proteinas expuestas en superficie.

En base a Io anterior, los inventores han desarrollado nuevos elementos, tales como las levaduras y los plasmidos arriba mencionados, que permiten la optimization del sistema YSD, y que seran descritos a continuation en detalle junto con todas sus realizaciones particulares.

Levadura de la invention, sus usos v metodo de obtencion

Tai como se ha explicado anteriormente, las levaduras desarrolladas permiten la optimization de la exposition en la superficie de la proteina de interes, superando asi los inconvenientes de otros metodos existentes en el estado de la tecnica.

Por Io tanto, en un primer aspecto, la presente invention se relaciona con una levadura recombinante, de aqui en adelante “levadura de la invention”, caracterizada porque su genoma comprende un promotor inducible por metabolito en lugar del promotor nativo del gen AGA 1. Esto es, los inventores han reemplazado el promotor nativo que regula el gen AGA 1 por un promotor inducible por metabolito. De este modo, la expresion de la proteina AGA1 en la superficie de la levadura solo se produce en presencia del metabolito inductor. Sin induction la superficie de la levadura carece del complejo natural AGA1-AGA2, puesto que AGA1 no se esta expresando, y aunque si que exista AGA2 natural, no se formara el complejo en la superficie. Con esta estrategia se evita la formation de complejos naturales AGA1-AGA2 que competirian con los complejos de YSD que se han disehado en la presente invention, y por Io tanto se aumenta la eficiencia del recubrimiento con las construcciones aqui descritas. Esto se comprobo por citometria de flujo con las tres cepas de levadura empleadas en los ejemplos (yK110, yK401 y yK501) demostrandose un incremento de exposition alrededor de 300% en yK401, y entre 150- 250% en yK110 y yK501 (ver Ejemplos y Fig. 4).

.La levadura de la invention puede ser, por ejemplo, cualquier levadura del genero Saccharomyces ssp., como por ejemplo, sin limitar a, Saccharomyces cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. bulderi S. cariocanus. S. cariocus, S. cerevisiae, S. cerevisiae var. boulardii, S. chevalieri, S. dairenensis, S. ellipsoideus, S. eubayanus. S. exiguus, S. florentinus, S. fragilis, S. kudriavzevii, S. martiniae, S. mikatae, S. monacensis, S. norbensis, S. paradoxus, S. pastorianus, S. spencerorum, S. turicensis, S. unisporus, S. uvarum, y S. zonatus. No obstante, en otra realization particular, la levadura de la invention es Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de levaduras de la especie S. cerevisiae incluyen, sin limitar a, BY4741, W303, Fm17, M2n, MEL2, HR4 WL3, YI30, KA31 y AH22.

La levadura de la invention se caracteriza porque en su genoma el promotor nativo del gen AGA1 ha sido reemplazado por un promotor inducible por metabolito. Las tecnicas de ingenieria genetica que permiten la manipulation del genoma y el reemplazo de una parte del genoma por otra, son ampliamente conocidas en el estado de la tecnica y cualquiera de ellas puede emplearse en el contexto de la presente invention. Asi, ejemplos de dichas tecnicas, incluyen, sin limitar a, recombination homologa, recombination especifica mediada por integrasas, y nucleasas como el sistema CRISP/Cas o “la nucleasa de actividad similar a activador de transcription” o TALEN (de sus siglas en ingles Transcription activator-like effector nuclease).

El gen AGA1 (Nombre descriptive: a-agglutinin ; Nombre sistematico: YNR044W; SGD ID: SG-S000005327; Saccharomyces Genomic Database), codifica para la proteina Agapl, siendo esta proteina Agapl la subunidad de anclaje de la a-aglutinina de las celulas; es una proteina altamente O-glicosilada con una serial de secretion en el extreme N-terminal y con una serial para la adicion de el anclaje de GPI a la pared celular en el extreme C-terminal, unido a la subunidad Aga2p de adhesion a traves de dos puentes disulfuro. El gen AGA 1 comprende la secuencia de nucleotides SEQ ID NO: 20 (AGA1 YNR044W SGDID:S000005327, chrXIV:703699..705876).

SEQ ID NO: 20.

En la levadura de la invention, el promotor nativo del gen AGA1 esta reemplazado por un promotor inducible por metabolite. En la presente invention el termino “promotor” o “secuencia promotora” hace referencia a una secuencia de nucleotidos localizada en directon 5’ del initio transcriptional de un gen, implicada en el reconocimiento y la union de la ARN polimerasa y otras proteinas encargadas de la transcription de un gen en direction 3’. Asimismo, en la presente invention un “promotor inducible” es aquel que ha iniciado o aumentado el initio de la transcription del gen regulado en respuesta a un estimulo quimico, ambiental o fisico. Ejemplos de promotores inducibles incluyen, sin limitar a, el promotor inducible por galactosa (PGAL1); promotor inducible por cobre (PCLIP1), sistema de regulation por tetraciclina (Tet-on y Tet-off), promotor inducible con cianamida (PDDI2). Todos estos promotores son conocidos por el experto en la materia y estan disponibles comercialmente. En una realization particular de la levadura de la invention, el promotor inducible por metabolito es el promotor inducible por galactosa. En otra realization mas particular de la levadura de la invention, la secuencia de nucleotidos del promotor inducible por galactosa comprende, o consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1.

La tecnica de YSD comprende la exposition de una proteina de interes en la superficie de la levadura. Para ello, es necesario expresar dentro de la levadura la proteina de interes. Asi, para expresar la proteina de interes dentro de la levadura de la invention, se han disehado un conjunto de plasmidos con una serie de caracteristicas que permiten no solo expresar la proteina de interes, sino que ademas, posibilitan la co- transformacion con otros plasmidos pudiendo expresar dos proteina de interes simultaneamente, la recuperation de la proteina expuesta en la superficie de la levadura, y la purification de la proteina recuperada.

Por Io tanto, en otra realization particular, la levadura de la invention se caracteriza porque ademas comprende, uno o mas plasmidos, en donde cada plasmido comprende:

(i) un promotor inducible por metabolito operativamente unido a la secuencia nucleotidica codificante para una proteina de fusion, donde dicha proteina de fusion comprende en direction N-terminal - C-terminal: (a) la region amino-terminal de la proteina Aga2, (b) una primera etiqueta de detection inmunologica, (c) una proteina de interes, (d) una segunda etiqueta de detection inmunologica, y (e) una etiqueta de purification de la proteina de interes;

(ii) un promotor de amplio espectro operativamente unido a un marcador de selection, y

(iii) un origen de replication centromerico CEN/ARS.

En otra realization todavia mas particular, el plasmido comprendido dentro de la levadura de la invention comprende, entre los componentes (b) y (c), una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En otra realization preferida, la region amino-terminal de la proteina Aga2 es la secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 31 :

MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFE YYKS VTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVF

En otra realization particular de la levadura de la invention, la primera etiqueta de detection inmunologica es un epitopo HA.

En otra realization mas particular de la levadura de invention, el plasmido ademas comprende un sitio de reconocimiento de proteasas preferiblemente reconocido por la proteasa TEV o la proteasa THR.

En otra realization particular de la levadura de la invention, la proteina de interes se selecciona de la lista que consiste en:

- Anticuerpos en todas sus versiones, o fragmentos de los mimos, incluyendo anticuerpos humanos (Wei Sun et al. Acta Pharm Sin B. 2019;9(5):960-972.), o versiones reducidas de estos, como scFv (Chao G et al. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68).

- Enzimas con actividad degradativa, como por ejemplo las celulasas y hemicelulasas empleadas en la degradation de biomasa lignocelulosica y production de etanol (Tabanag I.D.F et al. Catalysts. 2018;8(3):94).

-Proteinas absobentes de toxinas o contaminaciones alimentarias, como por ejemplo Silicateinas (Hongying Wang et al. ACS Omega. 2020; 5(13): 7555-7566).

-Enzimas con capacidad de aceptacion o donation electronica para procesos quimicos de biocatalisis o biosensores (Pham ML. Polakovic M. Int J Biol Macromol. 2020; 15(165) 835-841).

En otra realization particular de la levadura de la invention, la segunda etiqueta de detection inmunologica es un epitopo c-Myc.

En otra realization particular de la levadura de la invention, el marcador es un marcador de auxotrofia. En otra realization mas particular, el marcador de auxotrofia es TRP, HIS o LEU.

En otra realization particular de la levadura de la invention, la etiqueta de purification de la proteina de interes es una cola de histidinas.

En otra realization particular de la levadura de la invention, el plasmido comprende la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 13 (PW33), SEQ ID NO: 14 (PW34), SEQ ID NO: 15 (PW35), SEQ ID BO: 16 (PW36), SEQ ID NO: 17 (PW37), SEQ ID NO: 18 (PW38) o SEQ ID NO: 19 (pCTcon2).

En otra realization particular de la levadura de la invention, la levadura esta caracterizada porque comprende dos plasmidos seleccionados de la lista que consiste en SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 13 (PW33), SEQ ID NO: 14 (PW34), SEQ ID NO: 15 (PW35), SEQ ID BO: 16 (PW36), SEQ ID NO: 17 (PW37), SEQ ID NO: 18 (PW38) o SEQ ID NO: 19 (pCTcon2).

En otra realization particular de la levadura de la invention, uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 19 (pCTcon2), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 13 (PW33) y SEQ ID NO:

16 (PW36); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

En otra realization particular de la levadura de la invention uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 14 (PW34) y SEQ ID NO:

17 (PW37); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

En la presente invention, todas las realizaciones particulares descritas para la levadura de la invention se contemplan en solitario o en combination con todas las anteriores. Asimismo, las realizaciones particulares referidas al plasmido comprendido dentro de la levadura de la invention seran descritas en detalle mas adelante, en el que el plasmido es considerado otro aspecto inventivo de la presente invention, refiriendonos a el como “el plasmido de la invention”.

Como entiende el experto en la materia, la levadura de la invention puede estar formando parte de una composition. Asi, en otro aspecto, la presente invention se relaciona con una composition que comprende la levadura de la invention.

La composition aqui descrita puede ser una composition liquida o solida, y debe comprender todos aquellos compuestos o nutrientes que permitan el crecimiento, mantenimiento y/o el desarrollo de la levadura de la invention. En el contexto de la presente invention, el medio de cultivo en el que crece y se desarrolla la levadura se considera composition. Composiciones o medios de cultivos utiles en el mantenimiento, crecimiento y desarrollo de levaduras son ampliamente conocidos por el experto en la materia y estan disponibles comercialmente. Los medios generales para crecer levaduras contienen una fuente de energia, como hidratos de carbono, y agar. Las levaduras crecen a temperatura ambiente, una presion de oxigeno de 1 atmosfera y a un pH ligeramente acido, Io cual puede ayudar a que no crezcan bacterias en este medio tan rico. Para mantener el material extracromosomico en forma de plasmido, a veces se anaden antibioticos a los medios de levaduras, muchas veces gentamicina, kanamicina, o cloranfenicol que inhiben el crecimiento de las levaduras sin plasmido. Tambien puede hacerse selection positiva de plasmidos por complementation de rutas de biosintesis de aminoacidos. El plasmido contiene la information necesaria para completar una ruta de sintesis de aminoacidos (como leucina, triptofano, histidina etc...) que esta interrumpida en la cepa receptora. En este caso el medio de cultivo es preferiblemente un medio minimo cumplimentado con todos los aminoacidos a exception de aquel que se utiliza para la selection. En el sentido de la presente invention, se entiende por un “medio minimo” un medio de cultivo acuoso que contiene todos los sustratos (p. ej., fuente de carbono, sales minerales, oligoelementos, vitaminas) necesarios para el crecimiento de las celulas de levadura en forma disuelta, pero que al mismo tiempo no presenta sustancias constitutivas complejas o bien biomoleculas complejas (p. ej., extracto de levadura, peptona, triptona, etc.). El experto conoce del estado de la tecnica un gran numero de medios minimos para cultivar celulas de levadura. Algunos medios comunes y generalistas para crecer levaduras tienen un pH acido como los medios Agar Sabouraud o Agar patata dextrosa. El medio mas complete con el que se pueden crecer levaduras y el que se suele usar para crecer S. cerevisiae en el laboratorio es YEPD o YPD. En el se incluye extracto de levadura, normalmente un 1% en proportion masa/volumen con el agua, 2% de peptona, 2% de glucosa o dextrosa como fuente de energia y agua doble destilada hasta el volumen deseado. Si quiere hacerse un medio solido se le anade agar, en la concentration deseada, siendo Io mas comun poner el agar al 1 o 1 ,5%.

En otro aspecto, la presente invention de relaciona con una libreria de levaduras, de aqui en adelante “libreria de levaduras de la invention” que comprende una o mas levaduras de la invention. Las I ibrerias de levadura podrian ser librerias de anticuerpos sinteticos, tanto si se han generado a partir de material animal como si no. En el caso de proteinas con actividad enzimatica, las librerias pueden contener varias versiones de una misma enzima, obtenidas a partir de secuencias descritas o bien a traves de metodos de evolution dirigida. Las librerias se generan o bien a partir de DNA sintetico, o a partir de librerias naturales en fagos, plasmidos, cosmidos, etc. obtenidos a partir del material genomico o de cDNAs. Segun se ha descrito anteriormente, cada una de estas levaduras podria expresar hasta dos proteinas de interes.

La presente invention tambien contempla el empleo de la levadura de la invention en la tecnica de exposition en superficie de levadura o YSD. Esta tecnica es ampliamente conocida en el estado de la tecnica, pudiendo consultarse en libros de texto y manuales de laboratorio, siento su puesta en practica rutina de laboratorio para el experto en la materia. Asi, en otro aspecto, la invention se relaciona con el uso de la levadura de la invention en la tecnica YSD.

El metodo de obtencion de la levadura de la invention constituye otro aspecto de la presente invention. Por Io tanto, la invention tambien se refiere a un metodo para obtener la levadura de la invention, de aqui en adelante “primer metodo de la invention”, que comprende una etapa (a) que comprende el reemplazamiento genetico mediante recombination homologa del promotor natural del gen AGA 1 en una levadura por un promotor inducido por metabolito.

El gen AGA1 asi como el promotor que Io regula han sido descritos en parrafos anteriores, y tanto su explication como sus realizaciones particulares son aplicables al presente aspecto inventivo. De igual modo, promotores inducibles por metabolito tambien han sido descritos en el aspecto inventivo anterior y tanto su definition como sus realizaciones particulares son aplicables a este aspecto inventivo. Asi, en otra realization particular del primer metodo de la invention, el promotor inducible por metabolito es el promotor inducible por galactosa, donde, en otra realization mas particular, la secuencia de nucleotidos del promotor inducible por galactosa comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.

La levadura de la invention puede ser cualquier levadura del genero Saccharomyces ssp., como por ejemplo, sin limitar a, Saccharomyces cerevisiae, S. arboricolus, S. bayanus, S. bulderi S. cariocanus. S. cariocus, S. cerevisiae, S. cerevisiae var. boulardii, S. chevalieri, S. dairenensis, S. ellipsoideus, S. eubayanus. S. exiguus, S. florentinus, S. fragilis, S. kudriavzevii, S. martiniae, S. mikatae, S. monacensis, S. norbensis, S. paradoxus, S. pastorianus, S. spencerorum, S. turicensis, S. unisporus, S. uvarum, y S. zonatus. No obstante, en otra realization particular, la levadura de la invention es Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de levaduras de la especie S. cerevisiae incluyen, sin limitar a, BY4741 , W303, Fm17, M2n, MEL2, HR4 WL3, YI30, KA31 y AH22.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, el metodo comprende, ademas, una etapa (b) que comprende la transformation de la levadura obtenida en la etapa (a) con uno o mas plasmidos, en donde cada plasmido comprende (i) un promotor inducible por metabolito operativamente unido a la secuencia nucleotidica codificante para una proteina de fusion, donde dicha proteina de fusion comprende en direction N- terminal - C-terminal: (a) la region amino-terminal de la proteina Aga2, (b) una primera etiqueta de detection inmunologica, (c) una proteina de interes, (d) una segunda etiqueta de detection inmunologica, y (e) una etiqueta de purification de la proteina de interes; (ii) un promotor de amplio espectro operativamente unido a un marcador de selection, y (iii) un origen de replication centromerico CEN/ARS.

En otra realization todavia mas particular del primer metodo de la invention, el plasmido al que se refiere el parrafo anterior comprende, entre los componentes (b) y (c), una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En otra realization preferida, la region amino-terminal de la proteina Aga2 es la secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 31.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, la primera etiqueta de detection inmunologica es un epitopo HA.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, el plasmido ademas comprende un sitio de reconocimiento de proteasas preferiblemente reconocido por la proteasa TEV o la proteasa THR.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, la proteina de interes se selecciona de la lista que consiste en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, enzimas con actividad degradativa, proteinas absorbentes de toxinas o contaminaciones alimentarias, enzimas con capacidad de aceptacion o donation electronica para procesos quimicos de biocatalisis.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, la segunda etiqueta de detecton inmunologica es un epitopo c-Myc.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, el marcador es un marcador de auxotrofia donde, en otra realization mas particular, el marcador de auxotrofia es TRP, HIS o LEU.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, la etiqueta de purification de la proteina de interes es una cola de histidinas.

En otra realization particular del primer metodo de la invention, el plasmido/los plasmidos de la etapa (b) es/son seleccionado/s de la lista que consiste en SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 13 (PW33), SEQ ID NO: 14 (PW34), SEQ ID NO: 15 (PW35), SEQ ID BO: 16 (PW36), SEQ ID NO: 17 (PW37), SEQ ID NO: 18 (PW38) o SEQ ID NO: 19 (pCTcon2).

En otra realization mas particular del primer metodo de la invention, y en el caso de que la levadura sea transformada con dos plasmidos, uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 19 (pCTcon2), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 13 (PW33) y SEQ ID NO: 16 (PW36); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

Alternativamente a la realization particular anterior, en otra realization particular del primer metodo de la invention, y en el caso de que la levadura sea transformada con dos plasmidos, uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 14 (PW34) y SEQ ID NO: 17 (PW37); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

En la presente invention, todas las realizaciones particulares descritas para el primer metodo de la invention se contemplan en solitario o en combination con todas las anteriores. Asimismo, las realizaciones particulares referidas al plasmido empleado en el primer metodo de la invention seran descritas en detalle a continuation, pues dicho plasmido es considerado otro aspecto inventivo de la presente invention, refiriendonos a el como “el plasmido de la invention”.

Plasmido de la invention y sus usos

Tai como se ha descrito al comienzo de la presente description, los inventores han desarrollado un conjunto de plasmidos que permiten la co-expresion de dos proteinas de interes simultaneamente, la recuperation de dichas proteinas por tratamiento con proteasas y su purification posterior mediante cromatografia de afinidad. Los plasmidos asi desarrollados permiten la co-transformacion de los mismos en una unica levadura gracias a que contienen distintos marcadores de selection. Esta posibilidad de co- transformacion aumenta las aplicaciones del sistema YDS. Por un lado, en aplicaciones de biocatalisis, puesto que permite introducir mas de una proteina en superficie. Otros sistemas parecidos se basan en introducir sitios de anclaje en AGA2 y la production externa de proteinas que reconocen estos sitios, pero esto complica mucho la eficiencia y reproducibilidad de las reacciones. En experimentos de cribado de librerias ademas es una ventaja porque se puede duplicar la representatividad de la libreria, de forma que cada levadura contendria la information para dos proteinas expuestas en superficie. Los plasmidos desarrollados por los inventores en la presente invention seran descritos en detalle a continuation junto con todas sus realizaciones particulares.

Asi, en otro aspecto, la presente invention se relaciona con un plasmido, de aqui en adelante “plasmido de la invention”, que comprende:

(i) un promotor inducible por metabolito operativamente unido a la secuencia nucleotidica codificante para una proteina de fusion, donde dicha proteina de fusion comprende en direction N-terminal - C-terminal: (a) la region amino-terminal de la proteina Aga2, (b) una primera etiqueta de detection inmunologica, (c) una proteina de interes, (d) una segunda etiqueta de detection inmunologica, y (e) una etiqueta de purification de la proteina de interes;

(ii) un promotor de amplio espectro operativamente unido a un marcador de selection, y

(iii) un origen de replication centromerico CEN/ARS. En la presente invention se entiende por “plasmido” una molecula de ADN extracromosomico circular o lineal que se replica y transcribe independiente del ADN cromosomico. Tai como se usa en la presente invention, los terminos “plasmido” y “vector” (con capacidad de autoreplicacion) son considerados equivalentes y pueden emplearse indistintamente.

En la presente invention el plasmido de la invention se emplea para introducir y expresar un gen especifico en una celula de interes, en particular, en una levadura. Por Io tanto, el plasmido de la invention se considera un vector de expresion. Los vectores de expresion permiten la production de grandes cantidades de ARN mensajero (ARNm) estable. Las proteinas codificadas por el plasmido de la invention son producidas mediante la maquinaria de transcription y traduction de la celula una vez el vector esta dentro de la misma. En una realization particular, el plasmido es un plasmido de amplio espectro de huesped, es decir, un plasmido que comprende los elementos geneticos necesarios para ser funcional en multiples celulas huesped.

En otra realization todavia mas particular, el plasmido de la invention comprende, entre los componentes (b) y (c), una secuencia de reconocimiento de endopeptidasas.

En otra realization preferida, la region amino-terminal de la proteina Aga2 es la secuencia que comprende o consiste en la SEQ ID NO: 31

El plasmido de la invention comprende una primera etiqueta de detection inmunologica. En la presente invention se entiende por “etiqueta de detection inmunologica” a aquella molecula, o epitopo, que es reconocida de forma especifica por un anticuerpo, de manera que la proteina recombinante producida y que comprende dicho epitopo puede detectarse mediante tecnicas inmunologicas. Dichas etiquetas, o “Tags” en ingles, son ampliamente conocidas en el estado de la tecnica y estan disponibles comercialmente. Ejemplos de Tags o etiquetas incluyen, sin limitar a c-Myc (originado a partir del protooncogen c-myc), DYKDDDDK tag (tambien llamado Sigma's FLAG® tag, SEQ ID NO: 32), GFP (proteina verde fluorescente, de sus siglas en ingles Green fluorescent protein), Glu-Glu (etiqueta con la secuencia CEEEEYMPME, SEQ ID NO: 33, originalmente aislada del antigeno T mediano del virus del polioma), GST (de sus siglas en ingles glutathione S-transferase), HA (hemaglutinina), 6xHIS (polihistidina o etiqueta Hexa-histidina), mCherry (proteina fluorescente), S-Tag (epitopo derivado de los primeros 15 aminoacidos del extreme amino terminal de la ribonucleasa A pancreatica), Strep-Tag (epitopo de 8 aminoacidos de secuencia WRHPQFGG, SEQ ID NO: 34), T7 (peptido de 11 aminoacidos de longitud codificado a partir de la secuencia lider del gen 10 del bacteriofago T7), thioredoxina, V5 (epitopo derivado de la subunidad alfa de la ARN polimerasa del virus de parainfluenza de simio tipo 5), y VSV-G (epitopo derivado del virus de la estomatitis vesicular, SEQ ID NO: 35). En una realizaton particular del plasmido de la invention, la primera etiqueta de detection inmunologica es un epitopo HA.

Por otro lado, el plasmido de la invention tambien comprende un sitio de reconocimiento de proteasas. Este sitio permite que la proteina de interes producida pueda ser escindida o separada del resto de componentes de la proteina recombinante y ser recuperada mediante el tratamiento con proteasas para realizar posteriormente ensayos in vitro. Ejemplos de proteasas empleadas con esta finalidad incluyen, sin limitar a, proteasa TEV (la secuencia de escision es ENLYFQG, SEQ ID NO: 36), proteasa HRV3C (secuencia de escision LFQGP, SEQ ID NO: 37), proteasa Trombina (secuencia de escision LVPRGS, SEQ ID NO: 38), proteasa FactorXA (secuencia de escision l(E/D)GR, SEQ ID NO: 39) y proteasa enteroquinasa (secuencia de escision DDDDK, SEQ ID NO: 40). En una realization particular del plasmido de la invention, el sitio de reconocimiento de proteasas es reconocido por la proteasa TEV o la proteasa THROMBIN (THR).

El plasmido de la invention tambien comprende una proteina de interes. Ejemplos de proteinas de interes incluyen, sin limitar a, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (SdAb, scFv, etc...), enzimas con actividad degradativa, proteinas absorbentes de toxinas o contaminaciones alimentarias, enzimas con capacidad de aceptacion o donation electronica para procesos quimicos de biocatalisis.

Otro de los elementos del plasmido de la invention es una segunda etiqueta de detection inmunologica. El termino “etiqueta de detection inmunologica” ha sido definido previamente, asi como ejemplos de la misma. Gracias a la segunda etiqueta de detection inmunologica se puede comprobar la integridad de la proteina expuesta en superficie. En otra realization particular del plasmido de la invention, la segunda etiqueta de detection inmunologica es un epitopo c-Myc. En otra realizaton particular, el plasmido de la invention tambien comprende en su extreme c-terminal una secuencia de nucleotidos que codifica una cola de histidinas y que permite la purification de la proteina de interes una vez escindida. Como entiende en el experto en la materia, cualquier secuencia que nucleotidos que codifique una etiqueta de purification puede emplearse en el contexto de la presente invention. Ejemplos de etiquetas de purification incluyen, sin limitar a, His-tag (polihistidinas), GST Tag (Glutation S-transferasa), MBP Tag (proteina de union de maltosa), CBP Tag (peptido de union a calmodulina), y tag basados en estreptavidine/Biotina [BCCP(peptido serial de biotinilacionj+biotina].

El plasmido de la invention tambien comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un marcador de selection. Este marcador de selection permite identificar a la celula que comprende el plasmido de la invention frente a otras que no Io han incorporado. En la presente invention, un "marcador de selection", "gen marcador de selection" o "gen indicador" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo a una celula en el que se expresa para facilitar la identification y/o selection de las celulas que se transfectan con una secuencia de nucleotidos o plasmido como la descrita en el presente documento. Los marcadores adecuados pueden seleccionarse de marcadores que confieren resistencia antibiotica, que introducen un nuevo rasgo metabolico o que permiten selection visual. Como ejemplos de genes marcadores de selection se incluyen genes que confieren resistencia a antibioticos (tales como nptll que fosforila neomicina y canamicina, o hpt, que higromicina fosforilante, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina), o genes que proporcionan un rasgo metabolico. La expresion de genes marcadores visuales da como resultado la formation de color (por ejemplo 13-glucuronidasa, GUS o 13-galactosidasa con sus sustratos de color, por ejemplo X-Gal), luminiscencia (tai como el sistema luciferina/lucefarasa) o fluorescencia (Proteina Fluorescente Verde, GFP, y derivados de los mismos). Esta lista solo representa una pequena cantidad de marcadores posibles. El experto esta familiarizado con dichos marcadores. Dependiendo del organismo y del procedimiento de selection se prefieren diferentes marcadores. Si se desea, los marcadores geneticos pueden ser eliminados de la celula huesped en una etapa posterior. En una realization particular, el marcador de selection es un marcador de auxotrofia. Cualquier marcador de auxotrofia puede emplearse en el contexto de la presente invention. Dichos marcadores son ampliamente conocidos por el experto en la materia y estan disponibles comercialmente. Ejemplos de marcadores de auxotrofia incluyen, sin limitar a, ADE1 , ADE2, CAN1 , HIS3, LEU2, LYS2, TRP1, TRP5, URA3, LIRA4, MET15. No obstante, en una realization mas particular del plasmido de la invention, el marcador de auxotrofia es TRP, HIS o LEU, mas preferiblemente TRP1 , HIS3 o LEU2.

En otra realization particular del plasmido de la invention, este comprende la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 13 (PW33), SEQ ID NO: 14 (PW34), SEQ ID NO: 15 (PW35), SEQ ID BO: 16 (PW36), SEQ ID NO: 17 (PW37), SEQ ID NO: 18 (PW38) o SEQ ID NO: 19 (pCTcon2).

Tai como se ha explicado al initio de esta invention, el plasmido de la invention esta disenado para que pueda ser co-transformado con otros plasmidos, de forma que la celula, en particular una levadura, mas en particular la levadura de la invention, pueda expresar dos proteinas de interes simultaneamente. Asi, en otro aspecto, la presente invention se relaciona con una pareja de plasmidos, de que aqui en adelante “pareja de plasmidos de la invention”, en donde la pareja de plasmidos se selecciona del listado de plasmidos que consiste en las secuencias SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 13 (PW33), SEQ ID NO: 14 (PW34), SEQ ID NO: 15 (PW35), SEQ ID BO: 16 (PW36), SEQ ID NO: 17 (PW37), SEQ ID NO: 18 (PW38) o SEQ ID NO: 19 (pCTcon2).

En una realization particular de la pareja de plasmidos de la invention, uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 19 (pCTcon2), SEQ ID NO: 4 (PW24), SEQ ID NO: 7 (PW27), SEQ ID NO: 10 (PW30), SEQ ID NO: 13 (PW33) y SEQ ID NO: 16 (PW36); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

En otra realization particular de la pareja de plasmidos de la invention, uno de los plasmidos se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 2 (PW22), SEQ ID NO: 5 (PW25), SEQ ID NO: 8 (PW28), SEQ ID NO: 11 (PW31), SEQ ID NO: 14 (PW34) y SEQ ID NO: 17 (PW37); y el otro plasmido se selecciona de la lista que consiste en SEQ ID NO: 3 (PW23), SEQ ID NO: 6 (PW26), SEQ ID NO: 9 (PW29), SEQ ID NO: 12 (PW32), SEQ ID NO: 15 (PW35) y SEQ ID NO: 18 (PW38).

Tanto el plasmido como la pareja de plasmidos de la invention pueden ser introducidos dentro de una celula. Asi, en otro aspecto, la invention se relaciona con una celula huesped, de aqui en adelante “celula huesped de la invention”, que comprende el plasmido de la invention, o la pareja de plasmidos de la invention. Ejemplos de celulas huesped adecuadas para albergar el plasmido o la pareja de plasmidos de la invention incluyen, sin limitar a, celulas de mamiferos, plantas, insectos, de levaduras/hongos, de hongos y de bacterias. Celulas bacterianas incluyen, sin limitar a, celulas de bacterias Gram positivas tales como especies del genero Bacillus, Streptomyces y Staphylococcus y celulas de bacterias Gram negativas tales como celulas del genero Escherichia y Pseudomonas. Celulas de insectos incluyen, sin limitar a, celulas de Drosophila y celulas Sf9. Celulas de plantas incluyen, entre otros, celulas de plantas de cultivos tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales o de bulbos. Celulas de mamiferos adecuadas para la presente invention incluyen lineas celulares epiteliales (porcinas, etc.), lineas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), lineas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), celulas gliales (murinas, etc.), lineas celulares hepaticas (de mono, etc.), y celulas CHO (Chinese Hamster Ovary). En una realization particular de la celula huesped de la invention, la celula huesped es una celula de levadura. Celulas de levadura incluyen, sin limitar a levaduras del genero Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Candida y Yarrowia, y cualquiera de ellas puede emplearse como celulas huesped de la invention. En una realization mas particular, la celula huesped es Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Candida lipolytica, Torulopsis glabrata, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula graminis, Saccharomyces pastorianus, Candida tropicalis, Zygosaccharomyces rouxii, Candida glabrata, Torulaspora delbrueckii, Debaryomyces hansenii, Scheffersomyces stipites, Meyerozyma guilliermondii, Lodderomyces elongisporus, Candida albicans, Candida orthopsilosis, Candida metapsi losis, Candida dubliniensis, Clavispora lusitaniae, o Candida auris. No obstante, en otra realization todavia mas particular, la celula huesped de la invention es Saccharomyces cerevisiae. Ejemplos de levaduras de la especie S. cerevisiae incluyen, sin limitar a, BY4741 , W303, Fm17, M2n, MEL2, HR4 WL3, YI30, KA31 y AH22.

Preferiblemente, esta celula huesped de la invention es deficiente en proteasas, caracteristica que mejora la estabilidad de la proteina de fusion expresada.

En otro aspecto, la presente invention se relaciona con una composition que comprende la celula huesped de la invention.

En otro aspecto, la presente invention se relaciona con el uso del plasmido de la invention, o de la pareja de plasmidos de la invention, para transformar o co-transformar una celula huesped, preferiblemente una levadura, en particular, la levadura de la invention.

Metodos para introducir construcciones genicas, vectores o plasmidos dentro de una celula son ampliamente conocidos por el experto en la materia y su empleo es practica habitual en el laboratorio. El termino “introducir” en el contexto de la presente invention hace referencia a la incorporation de una secuencia de nucleotidos en una celula mediante “transfection” o “transformation” o “transduction”, donde la secuencia de nucleotidos puede incorporarse en el genoma de la celula (por ejemplo, cromosoma, plasmido, ADN mitocondrial), o ser un replicon autonomo, o expresarse de forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). Como se usa en el presente documento, los terminos “transformada”, “transformada de modo estable” o “transgenica”, con referencia a una celula, significan que la celula tiene una secuencia de nucleotidos no nativa (heterologa) integrada en su genoma, o en un plasmido episomal que se mantiene a traves de multiples generaciones.

Ejemplos de metodos para introducir construcciones genicas, vectores o plasmidos en celulas huesped incluyen, sin limitar a, electroporation; microinyeccion nuclear o microinyeccion directa en celulas simples; fusion de protoplastos bacterianos con celulas intactas; uso de policationes, por ejemplo, polibreno o poliornitina; fusion de membrana con liposomas, transfection mediada por lipofectamina, o lipofeccion; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; incubation con precipitation del ADN-fosfato de calcio; transfection mediada con DEAE-dextrano; infection con acidos nucleicos virales modificados; transferencia de ADN mediada por Agrobacterium y similares.

Metodo de YSD de la invention

En otro aspecto, la presente invention se relaciona con un metodo para exponer una proteina de interes en la superficie de una levadura, de aqui en adelante, “segundo metodo de la invention”, que comprende:

(i) Transformar la levadura de la invention con uno o mas plasmidos de la invention, o con una pareja de plasmidos de la invention, y

(ii) cultivar la levadura transformada en la etapa (i) en las condiciones adecuadas para la expresion de la/s proteina/s de interes en la superficie de la levadura.

Tanto la levadura, como el plasmido o la pareja de plasmidos de la invention han sido descritos en aspectos inventivos anteriores y tanto sus definiciones como sus realizaciones particulares son aplicables presente aspecto inventivo.

En una primera etapa [etapa (i)], el segundo metodo de la invention incluye transformar la levadura de la invention con uno o mas plasmidos de la invention, o con una pareja de plasmidos de la invention. En el presente aspecto inventivo se entiende por “transformar”, el procedimiento que comprende introducir una secuencia de nucleotidos dentro de la levadura de la invention. Ejemplos de metodos para introducir plasmidos, en levaduras incluyen, sin limitar a, transformation quimica con LiAc y PEG, electroporation, microinyeccion nuclear o microinyeccion directa en celulas simples; fusion de protoplastos bacterianos con celulas intactas; uso de policationes, por ejemplo, polibreno o poliornitina; fusion de membrana con liposomas, transfection mediada por lipofectamina, o lipofeccion; bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN; incubation con precipitation del ADN-fosfato de calcio; transfection mediada con DEAE-dextrano; infection con acidos nucleicos virales modificados; y similares. En una realization particular del segundo metodo de la invention, la transformation de la levadura en la etapa (i) se lleva a cabo mediante transformation quimica con LiAc y PEG.

En una segunda etapa [etapa (ii)], el segundo metodo de la invention comprende cultivar la levadura transformada en la etapa (i) en las condiciones adecuadas para la expresion de la/s proteina/s de interes en la superficie de la levadura. Condiciones y medios de cultivo para cultivar levaduras han sido explicados en un aspecto inventive anterior, concretamente, para la levadura de la invention, y dichos medios y condiciones son aplicables al segundo metodo de la invention.

Tras la etapa (ii) del segundo metodo de la invention, se obtiene una levadura que comprende en su superficie la proteina de interes introducida con el plasmido de la invention. Ejemplos de proteinas de interes han sido citados previamente. Asi, en una realization particular del segundo metodo de la invention, la proteina de interes se selecciona de la lista que consiste en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (SdAb, scFv, etc...), enzimas con actividad degradativa, proteinas absorbentes de toxinas o contaminaciones alimentarias, enzimas con capacidad de aceptacion o donation electronica para procesos quimicos de biocatalisis.

Kit de la invention y sus usos

La puesta en practica de los usos y los metodos de la invention comprende el empleo de la levadura, el plasmido, la celula de la invention, etc., los cuales pueden estar formando parte de un kit.

Por Io tanto, en otro aspecto, la presente invention se relaciona con un kit, de ahora adelante el “kit de la invention”, que comprende: la levadura de la invention, y/o la composition de la invention, y/o la libreria de levaduras de la invention, y/o el plasmido de la invention, y/o la pareja de plasmidos de la invention, y/o la celula huesped de la invention.

Todos los componentes del kit han sido definidos y explicados en parrafos anteriores de la presente description, asi como sus realizaciones particulares, todo Io cual es aplicable al kit de la invention.

Ademas de uno o mas de los elementos arriba mencionados, el kit puede comprender otros componentes utiles en la puesta en practica de la presente invention, tales como, buffers, vehiculos de entrega, soportes del material, componentes de controles positives y/o negatives, etc. Asimismo, los kits podran incluir tambien instrucciones para practicar el objeto de la invention. Estas instrucciones pueden ser presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o mas de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como information impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja u hojas de papel en las que se imprime la information, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio seria un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la information. Otro medio que puede estar presente es una direction de sitio web que puede utilizarse a traves de Internet para acceder a la information en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Por otro lado, la presente invention tambien se relaciona con el uso del kit de la invention en un metodo para exponer una proteina de interes en la superficie de una levadura, o en un metodo para transformar una celula, preferiblemente, una levadura, o en la tecnica de exposition en superficie de levadura, o en un metodo segun el primer metodo de la invention aqui descrito.

En una realization particular del kit de la invention, la levadura es la levadura de la invention.

Los detalles de estos usos ya han sido descritos en parrafos anteriores de la presente description.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Metodo de reemplazamiento de promotores utilizado para generar las cepas yK110, yK401, e yK501. Se genero mediante PCR un fragmento con el marcador de selection por complementation de auxotrofia con URA3 y flanqueado con secuencias homoIogas para la recombination con el promotor natural de AGA1.

Figura 2. Esquema de las construcciones de los plasmidos de la serie PW. A- Construccion con un sitio de reconocimiento de proteasas TEV o THR. B-Construccion con una etiqueta de poli-histidinas en zona N-terminal para purification por columna de afinidad. Figura 3. Mapa representativo de los plasmidos pWgenerados en la presente invention.

Figura 4. Porcentaje de aumento de celulas comprendiendo los plasmidos de la invention que expresan proteinas en superficie de levadura con exito respecto a la cepa control EBY100.

EJEMPLOS

A continuation, se ilustrara la invention mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la utilidad de la levadura, el plasmido y los metodos descritos en la invention.

I - MATERIAL y METODOS

Cepas de levadura y condiciones de cultivo.

Las cepas de Saccharomyces cerevisiae utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 1. Las cepas de levadura se cultivaron a 28 °C en medio de crecimiento complete (YPD) que contenia 1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona bacteriologica y 2 % de dextrosa. Las cepas transformadas con plasmidos se crecieron en un medio de crecimiento sintetico (SD) que contenia un 0,67 % de base nitrogenada de levadura, 50 mm de acido succinico, pH 3 y un 2 % de dextrosa. Segun las auxotrofias de cada cepa se anadio, adenina (0,025 g/litro), histidina (0,1 g/litro), leucina (0,1 g/litro), metionina (0,1 g/litro), triptofano (0,05 g/litro) o uracilo (0,025 g/litro). En el caso de la induction de promotores controlados por GAL1 , se sustituyo en la misma concentration la dextrosa por galactosa.

Tabla 1. Cepas empleadas en la invention.

Construction de cepas de exposition aumentada

Las cepas se han generado por reemplazamiento genico del promotor del gen natural de AGA1 , de forma que en todos los casos su expresion pasa a estar controlada por un promotor inducible por galactosa (Figura 1). Se emplearon los cebadores GAL1-AGA1 FW y GAL1-AGA1 RV (Tabla 2).

Tabla 2. Diseno de cebadores empleados para el reemplazo del promotor natural de AGA 1 por un promotor inducible por Galactosa.

Mediante reaction de PCR, se amplified, con los oligonucleotides de la tabla 2, la region situada entre el promotor de LIRA3 y el promotor de GAL1 utilizando como molde el plasmido pAG306GAL-ccdB (Alberti S. et al. Yeast. 2007;24(10):913-919). Los cebadores contienen extremes homologos a los colindantes del gen natural, por Io que mediante reemplazamiento genico se ha sustituido el promotor natural por el regulable (Figura 1). El reemplazamiento se realize en tres tipos de cepas defectivas en sistemas de proteasas; BJ5465, BY4741 pep4::KAN y BY4741 prb1 ::KAN. La transformation se realize por el metodo quimico de LiAC/PEG (Gietz RD. et al. Nat Protoc. 2007;2(1):31- 4). Los cultivos se crecieron durante toda la noche en agitation a 28°C hasta crecimiento exponential en YPD, y se emplearon 10 ⁸ celulas para la transformation quimica, se selecciono a los transformantes en placas de medio sintetico sin uracilo.

Construction de plasmidos.

Los plasmidos con distintas auxotrofias se generaron por recombination homologa del plasmido pCTcon2 (ADDGENE https://www.addgene.org) con productos de PCR obtenidos de los plasmidos p415-GPD y p413-GPD (Mumberg D. et al. Gene. 1995 Apr 14; 156(1): 119-22). La insertion de los sitios de reconocimiento de proteasas especificas se obtuvo mediante hibridacion de oligonucleotides, digestion y donation sobre los plasmidos pCTcon2, PW22 y PW23, originando los plasmidos PW22-29. La adicion de las 6 Histidinas para purification se realize por hibridacion de oligonucleotides y recombination homologa con el plasmido pCTcon2 y PW22-29, y origino el plasmido PW30-38. Todos los plasmidos obtenidos se comprobaron por secuenciacion. En la tabla 3 se muestran los oligonucleotides empleados en la construction de los plasmidos de la invention.

Tabla 3 - Oligonucleotidos empleados para la construction de los plasmidos de la serie PW.

Citometria de Flujo

Los plasmidos PW obtenidos y comprobados, se transformaron mediante metodo quimico en las cepas de levadura de la invention y se seleccionaron mediante crecimiento en medio sintetico con los aminoacidos correspondientes. Se indujo la exposition de proteina de superficie con crecimiento con galactosa durante 24 horas a 28°C. Se realizaron ensayos de citometria de flujo de aproximadamente 150.000 celulas de levadura empleando un citometro de flujo MACSQuant de Milteny, y empleando como anticuerpos para la detection anti-HA de raton como anticuerpo 1° (Fisher, Ref 11558113.), y anti-raton FITC de conejo como anticuerpo 2° (Abeam, Ref.ab8517).

II- RESULTADOS

Obtencion del set de Plasmidos PW

En la mayoria de los trabajos descritos se obtienen construcciones por modificaciones del plasmido pCTcon2 (con gen TRP1), que se emplea en la cepa EBY100 (MATa AGA1 ::GAL1-AGA1 ::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL) (Boder ET, Wittrup KD. Nat Biotechnol. 1997; 15(6): 553-7).

Tabla 5-Combinaciones de plasmidos posibles para co-transformacion en las cepas de S.c. generadas en la invention.

Ademas, para tener la posibilidad de recuperation de la proteina expuesta se han introducido sitios de reconocimiento por proteasa TEV y THR. Esta modification es muy importante porque permite la recuperation de las proteinas mediante tratamiento con proteasas, para realizar posteriormente ensayos in vitro. El sistema de recuperation dependiente de proteasas TEV y THR puede combinarse con plasmidos distintos que contengan marcadores de selection diferentes, y asi posteriormente tener la posibilidad de realizar una extraction selectiva de solo una proteina o de las dos.

Tambien se han introducido 6 residues HIS en la zona C-terminal de la proteina que permiten su purification. Existen otras versiones que introducen estos residues en la parte N-Terminal, pero ya D Wittrup sehala la necesidad de controlar la completa expresion de las proteinas mediante epitopos Myc en la zona C-terminal. Las construcciones que contienen etiquetado en su zona N-terminal, no diferencian una proteina fragmentada de una completa. Con la construction de la presente invention, solo se podrian purificar proteinas que se han procesado correctamente y estan completas. En la Figura 2 se muestra un esquema de las construcciones de los plasmidos de la serie PW.

Con todo esto se han generado un total de 17 plasmidos para exposition de proteinas en superficie de levadura que permiten la co-expresion de dos proteinas simultaneamente, la recuperation por tratamiento con proteasas y su purification posterior mediante cromatografia de afinidad. Todas las construcciones se han comprobado por secuenciacion y transformado en cepas de levadura de la invention. En la figura 3 puede verse un mapa representative de los plasmidos generados en la presente invention. La tabla 6 muestra un resumen de las caracteristicas diferenciales de los plasmidos.

Tabla 6. Conjunto de p asmidos obtenidos mediante ingenieria genetica con la information detallada de su marcador de selection, sitio de reconocimiento de proteasa anadido, y etiqueta para purification.

Obtencion de cepas de expresion mejorada en superficie de levadura

La caracteristica a destacar de estas cepas es que se ha sustituido el promotor natural por un promotor regulado por Galactosa que presenta la secuencia SEQ I D NO: 1. Existe una cepa similar a yK110 generada en el laboratorio de Dane Wittrup, EBY100 (con genotipo MATa AGA1 ::GAL1-AGA1 ::URA3 ura3-52 trp1 leu2-delta200 his3-delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL), pero en este caso se inserto una construction de AGA1 regulado por Galactosa en la region genica correspondiente al gen URA3. La diferencia es importante, puesto que sin induction la superficie ya se encuentra cubierta del complejo natural AGA1-AGA2, Io que reduce la posibilidad de exposition de proteinas despues de la induction. Esto se comprobo por citometria de flujo con las tres cepas demostrandose un incremento de exposition alrededor de 300% en yK401 , y entre 150- 250% en yK110 y yK501 . La eficiencia de exposition de proteina en superficie es un factor limitante en la aplicacion de la tecnica que hemos optimizado notablemente.

Los resultados del citometro obtenido en experimentos independientes se muestran en la Figura 4. La cepa ya descrita en los trabajos de Wittrup consigue un porcentaje de celulas con YSD del 14.3% a las 24 horas de induction, mientras que la cepa YK110 con un plasmido representative del kit PW36 alcanza el 37.88%. En un experimento independiente se evaluaron los porcentajes de celulas YSD de las cepas YK401 e YK501 , con plasmidos representatives de la coleccion generada, obteniendo los siguientes valores; EBY100+pCTcon2 7.65%, YK401+PW37 24.17%, YK401+PW38 18.76%, YK501+PW3720.88%. Teniendo en cuenta los valores obtenidos se calculo el % de aumento de celulas que expresan proteinas en superficie de levadura con exito

(Fig. 4).

Ill - CONCLUSION La presente invention ofrece un set de plasmidos y cepas que mejora y flexibiliza los experimentos de exposition en superficie de levadura. La optimization del sistema es importante para la reproducibilidad de los procesos, ya que el objetivo final es el escalado y la robotizacion de los experimentos. Los reactivos que se necesitan para llevar a cabo la exposition en superficie, extraction y purification, son muy comunes en los laboratorios, se pueden adquirir en distintas companias distribuidoras de productos de laboratorio, y por Io tanto son economicos y accesibles. El sistema aqui desarrollado es sencillo y robusto, a la vez que la combination de sus elementos permite la adaptation simple a los objetivos experimentales.