ШТАММ БАКТЕРИИ RHODOCOCCUS QINGSHENGII - ДЕСТРУКТОР ИМАЗЕТАПИРА И СТИМУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ

Область техники

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии, экологии и биотехнологии, предназначено для восстановления почвы от за- грязнения гербицидами класса имидазолинонов, стимуляции роста высажен- ных растений и представляет собой штамм бактерий Rhodococcus qingshengu, депонированный под номером ВКПМ Ас-2143.

Развитие современного сельскохозяйственного земледелия невозможно без применения удобрений и химических средств защиты растений - пести- цидов, среди которых максимальная доля приходится на гербицидные препа- раты. В процессе использования гербициды попадают в почву, где время их полураспада зависит от большого количества факторов: химической специ- фикации вещества, типа и физико-химических свойств почвы, климатических и географических особенностей сельскохозяйственных территорий. Многие гербициды (как например, имидазолиноны) крайне медленно разрушаются в почве, и микробная деградация подобных стойких соединений может быть единственным способом восстановления почвенного здоровья и обеспечения урожайности новых посевов.

Предшествующий уровень техники

Из современного уровня развития науки и техники известен биопрепа- рат, обладающий свойством деструкции пестицидов на примере симазина и стимулирующий почвенное плодородие. Основу биопрепарата- био деструктора составляет консорциум молочнокислых бактерий Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis, Lactobacillus salivarius var. salicinicus, Lactobacillus salivarius var. salivarius , Lactobacillus acidophilus (ВКПМ-5972), растительные полисахариды, микроэлементы в виде комплек- сонатов, ненасыщенные жирные кислоты - предшественники простогланди- нов (Пат. РФ N° 2203870; Пат. РФ N° 2203879).

Однако указанная микробная композиция не способна к разложению гербицидов классов имидазолинонов и не способна стимулировать рост рас- тений.

Описан биопрепарат для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксус- ных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлор- феноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-а-пропионовой кисло- ты, 2-метил-4-хлорфенокси-а-пропионов� �й кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси- а-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-а-масляной кислоты, метил-[1- (бутиламино)карбонил]-1Н-бензимид азол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола (Пат. РФ N° 2484131). Биопрепарат представляет собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В- 10997, Bacillus subtilis ВКПМ В- 10999 и Rhodococcus erythropolis ВКПМ - Ас-1882 в массовом соотношении (1-2):(1- 2):1. Биопрепарат содержит дополнительно сорбент, органические, мине- ральные и стимулирующие добавки и обладает стимулирующей рост расте- ний активностью и фунгицидными свойствами.

Указанный биопрепарат обладает стимулирующим рост растений дей- ствием, но не способен подвергать деградации гербициды класса имидазоли- нонов.

Известен штамм бактерий Bacillus megaterium 501, который может ис- пользоваться для деструкции остаточных количеств фосфорорганических пе- стицидов в природных средах (А. с. СССР N° 1735359). Однако указанный микроорганизм не проявляет стимулирующей рост растений активности.

Известен штамм бактерий Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D, для очистки почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифе- нилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом) (Пат. РФ N° 2562156).

Недостатком этого изобретения является отсутствие способности у штамма Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D подвергать деградации гербициды группы имидазолинонов.

Известен штамм бактерий Achromobacter sp. ВКМ В-2534 Д, используе- мый для очистки почв и жидких сред, например, грунтовых и поверхностных вод, загрязненных органофосфонатами (Пат. РФ N° 2401298). Штамм бакте- рий Achromobacter sp. Kg 16 был выделен методом накопительных культур из почвы, загрязненной глифосатом, депонирован во Всероссийской коллек- ции микроорганизмов под номером ВКМ В-2534 Д. Штамм утилизирует ор- ганофосфонаты: глифосат, метилфосфонат, аминометилфосфонат, фосфоно- ацетат, 2-аминоэтилфосфонат, Ы-(фосфонометил)иминодиацетат. Показана устойчивость штамма к высоким концентрациям гербицида глифосата, что расширяет диапазон его применения, в том числе в аварийных ситуациях.

Указанный штамм Achromobacter sp. ВКМ В-2534 подвергает деграда- ции гербициды класса органофосфонатов, но не имидазолиноны и не спосо- бен стимулировать рост растений.

Наиболее близким к предлагаемому микроорганизму по способности к биодеградации имазетапира является штамм бактерий Pseudomonas sp. IM-4 (Huang et al., 2009). Данный штамм утилизирует более 73% имазетапира, присутствующего в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 50 мг/л в жидкой минеральной среде, а также способен разру- шать этот гербицид в почве на 67,6% за 25 дней при исходной концентрации имазетапира в почве 10 мг/кг. Однако сведения о наличии у этого штамма признаков, позволяющих стимулировать рост растений (например, синтез фитогормонов, сидерофоров и других фитоактивных веществ), а также дан- ные о стимуляции роста таких злаковых культур как пшеница или рожь, от- сутствуют.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое реше- ние, является получение микробного штамма, подвергающего деградации имазетапир - гербицид класса имидазолинонов - и обладающего свойствами стимулятора роста растений.

Технический результат, который может быть получен при использова- нии заявляемого изобретения, заключается в повышении биодеградации гер- бицида имазетапира и стимуляции роста растений на почве, содержащей его остаточные концентрации.

Штамм IMZT-32 был исследован на наличие свойств, прямо или косвен- но способствующих росту растений: синтез фитогормона индолил-3- усускной кислоты (ИУК), фиксация атмосферного азота, растворение фосфа- тов, синтез фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазы, синтез сидерофоров, стимуляция всхожести и развития проростков растений. Установлено, что IMZT-32 способен продуцировать сидерофоры, АЦК- деаминазу и фитогормон ИУК, стимулировать рост побегов и корней птттени- цы мягкой ( Triticum aestivum L.) и ржи озимой {Secede cereale L.) в лабора- торных вегетационных опытах с 4-сут. проростками.

Штамм IMZT-32 был депонирован с регистрационным номером IBPPM 646 в Коллекции ризосферных микроорганизмов Института биохимии и фи- зиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, а затем в связи с расширением направлений фундаментальных и прикладных исследо- ваний этого штамма идентифицирован как вид Rhodococcus qingshengii , пе- реименован в Rhodococcus qingshengii OPI-01 и депонирован во Всероссий- ской коллекции промышленных микроорганизмов под номером Ас-2143.

Заявляемый штамм характеризуется следующими культурально- морфологическими, физиолого-биохимическими и биотехнологическими признаками.

Морфологические признаки : В мазках суточной культуры присутствуют короткие палочки неправильной формы, V-образной формы, с зачатками слабого ветвления. По Граму окрашиваются положительно. Спор не образу- ют. Неподвижные.

Культуральные признаки : Аэроб. Температурный оптимум 30°С. После инкубации на мясо-пептонном агаре через 2 сут. образует округлые, выпук- лые колонии диаметром около 2 мм с блестящей поверхностью, непрозрач- ные, однородной структуры и густой маслянистой консистенции. Со време- нем колонии приобретают розоватый оттенок. Рост на скошенном мясо- пептонном агаре отчетливый по штриху на 2 сут.

Физиолого-биохимические признаки. Продуцирует каталазу, уреазу, но не оксидазу, лецитиназу, липазу, фенилаланилдезаминазу. Не гидролизует желатин и крахмал. При росте на мясо-пептоном бульоне образует сероводо- род, но не индол и аммиак. Флюоресцирующие и другие пигменты не обра- зует. Осуществляет редукцию нитратов. Способен расти на среде в присут- ствии 2,5% NaCl. Утилизирует цитрат на среде Симмонса. В 0/F -тесте окис- ляет ксилозу, мальтозу, но не лактозу и маннит.

Генетические характеристики: филогенетический анализ, основанный на сравнении нуклеотидных последовательностей гена 16SpPHK, показал, что штамм OPI-01 является представителем вида Rhodococcus qingshengii.

Биотехнологические признаки :

- способность стимулировать рост растений, за счет продукции фито- гормона ПУК, фермента АЦК-деаминазы и сидерофоров. Синтезирует ПУК в концентрации 8-12 мкг/мл за 7 сут. культивирования в среде, содержащей предшественник фитогормона аминокислоту триптофан. Продукция ПУК штаммом определяется с использованием ВЭЖХ по появлению и накопле- нию фитогормона. Стимулирует рост побегов и корней пшеницы мягкой ( Triticum aestivum L.) и ржи озимой ( Secale cereale L.) в лабораторных веге- тационных опытах с 4-сут. проростками.

- способность подвергать деградации гербицид имазетапир. Разрушает гербицид имазетапир в концентрации 50 мг/л за 7 сут. на 23% при культиви- ровании в жидкой минеральной среде MSM. Активность, связанная с дегра- дацией гербицида, определяется по убыли субстрата из среды культивирова- ния. Остаточное содержание имазетапира определяется с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В лабораторных условиях (не в коллекции) культуру хранят при 4°С на столбиках агаризованной (0,6 %) среды LB (г): агар - 6; бактотриптон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 5; дистиллированная вода - 1 л; pH 7.0-7.2.

Штамм Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 авирулентен (Протокол экспериментального исследования по определению среднелетальной дозы (LD50) на белых мышах, проведенного 16.04.2019 г. - 29.04.2019 г. в лабора- тории диагностических технологий отдела микробиологии отдела диагности- ки инфекционных болезней ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфе- ре защиты прав потребителей и благополучия (ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора) и может быть использован для восстановления почвы от остаточного загрязнения гербицидными препаратами на основе имазетапира и для стимуляции роста растений на такой почве.

Вариант осуществление изобретения

Штамм бактерий Rhodococcus qingshengii, депонированный под номером ВКПМ Ас-2143, которому первоначально был присвоен лабораторный шифр IMZT-32, был выделен из накопительной культуры на основе микрофлоры ризосферы сои ( Glycine max L.), выращенной на почве, обработанной герби- цидным препаратом «Фабиан», действующим веществом которого является имазетапир. Для постановки накопительной культуры образцы корней расте- ний с оставшейся закрепленной на них почвой (не более 2 мм) помещали в колбу с минеральной средой MSM (Huang X., Pan J.J., Liang В., Sun J.Q., Zhao Y.Y., Li S.P. Isolation, characterization of a strain capable of degrading ima- zethapyr and its use in degradation of the herbicide in soil // Curr. Microbiol. - 2009. - Vol. 59. - P. 363-367.) следующего состава (г/л): NH4NO3 -1,0; К ₂ НР0 ₄ - 1,5; КН ₂ Р0 ₄ - 0,5; MgSO ₄ x7H ₂ O-0.2; NaCl- 0,5. В качестве един- ственного источника углерода и энергии в среду добавляли имазетапир до конечной концентрации 50 мг/л. Колбы с накопительными культурами инку- бировали на шейкере при 140 об/мин и 30°С в течение восьми недель, ежене- дельно заменяя среду в колбах на свежую. По окончании культивирования из накопительных культур были приготовлены десятикратные разведения, ко- торые высевали на поверхность агаризованной среды MSM, содержащей 100 мг/л имазетапира в качестве единственного источника углерода и энергии. Посевы инкубировали в термостате при 30°С в течение 7 сут, после чего учи- тывали появившиеся колонии, отсевая их для получения чистых культур. В дальнейшем все полученные таким образом изоляты проверяли на способ- ность к деградации имазетапира, при культивировании их в жидкой среде MSM, содержащей гербицид в концентрации 50 или 100 мг/л в качестве единственного источника углерода и энергии. Штамм IMZT-32 отличался способностью подвергать деградации гербицид имазетапир на 23% за 7 сут. культивирования.

Промышленная применимость

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Биодеградация имазетапира и близких по структуре метабо- литов штаммом Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 при культивирова- нии в жидкой минеральной среде. Способность штамма Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ac-2143 дегради- ровать гербицид имазетапир и его возможные метаболиты исследовали, культивируя микроорганизм в жидкой минеральной среде MSM, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии имазетапир в кон- центрации 50 мг/л или один из метаболитов (2,3-пиридиндикарбоновую кис- лоту - ПДК или 2-гидроксиникотиновую кислоту - ГНК) в концентрации 200 мг/л.; pH среды 6,8 - 7,0. Посев микроорганизма в среду проводили до полу- чения начальной плотности микробной суспензии 0,05 или 0,1 ед. опт. пл., измеренной при 600 нм. В качестве контроля использовали среду с имазета- пиром или метаболитами без бактерий. Все варианты опыта имели трехкрат- ную повторность. Культивирование проводили 7 дней в условиях аэрации на качалке при 150 об./мин., 30°С. В конце эксперимента в среде после культи- вирования определяли остаточное содержание имазетапира, ПДК и ГНК ме- тодом ВЭЖХ (таблица 1).

Таблица 1 - Биодеградация имазетапира и близких метаболитов - гид- роксиникотиновой и пиридиндикарбоновой кислот - в качестве единствен- ных источников углерода и энергии в среде MSM штаммом Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143

Анализ остаточного содержания гербицида и близких по химической структуре метаболитов в среде после культивирования в течение 7 сут. и в контрольном варианте без микроорганизма показал, что имазетапир разру- шался штаммом Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 на 22,7%, ПДК - на 18,3%, а ГНК - на 6,9%.

Полученные данные свидетельствовали о способности штамма Rhodo- coccus qingshengii ВКПМ Ас-2143 подвергать деградации имазетапир и близ- кие к нему по химической структуре метаболиты, используя их в качестве единственного источника углерода и энергии.

Пример 2. Влияние штамма Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 на рост и развитие растений пшеницы мягкой в почве, искусственно загрязнен- ной имазетапиром.

Почву в эксперименте искусственно загрязняли гербицидным препара- том «Виадук ВК» (ДВ: имазетапир, 100 г/л), внося препарат с водой для по- лива в дозировке, согласно инструкции, до конечной концентрации по имазе- тапиру 10 мг/кг почвы. Почву увлажняли до 50% от полной влагоемкости. Семена пшеницы мягкой ( Triticum aestivum L.) сорта «Фаворит» по 20 шт. высевали в 1-л вегетационные сосуды, содержащие 1 кг почвы. Для стимуля- ции роста растений после появления всходов почву дважды - на 5 и 21 дни культивирования - обрабатывали бактериями, внося микробную суспензию с водой для полива до конечной концентрации микроорганизма-инокулянта в почве - 10 ⁷ кл./г. Для приготовления суспензии 3-суточную LB-агаровую культуру штамма отмывали в фосфатном (pH 7.2) буфере и ресуспендирова- ли в воде для полива растений. Эксперимент проводили в контролируемых условиях: при температуре 24/20 °С, световом режиме 14/10 ч (освещенность - 8000 люкс) соответственно день/ночь, поддерживая влажность почвы на уровне 50% от полной влагоемкости поливом отстоянной водопроводной во- дой, необходимость которого определяли взвешиванием сосудов. Продолжи- тельность эксперимента составляла 47 сут. По окончании эксперимента рас- тения извлекали из сосудов, корни отмывали от почвы проточной водой. Вы- сушивали фильтровальной бумагой, измеряли длину корней и побегов, отде- ляли их и высушивали до постоянного веса при 65 °С. Образцы почвы (5 г) отбирали и высушивали до воздушно-сухого состояния перед анализом на гербицид. Содержание имазетапира в почве определяли как описано ранее (Assalin M.R., Queiroz S.C.N., Ferracini V.L., Oliveira T., Vilhena E., Mattos M.L.T. A method for determination of imazapic and imazethapyr residues in soil using an ultrasonic assisted extraction and LC-MS/MS // Bull. Environ. Contam. Toxicol. - 2014. - Vol. 93. - P. 360-364) с использованием ВЭЖХ.

В свежезагрязненной имазетапиром почве наблюдалось сильное угнете- ние роста растений пшеницы: за 25 сут. вегетации практически все растения в варианте без бактеризации так и остались на стадии проростков. Из необра- ботанной и обработанной микроорганизмом почвы отобрали растения и сравнили их по морфометрическим показателям (рисунки 1 и 2). У бактери- зованных растений длина побегов и корней была на 61 и 38%, а прирост био- массы - на 17 и 9% больше по сравнению с небактеризованными соответ- ственно. Таким образом, и в этом варианте опыта штамм Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 проявил способность к стимуляции роста расте- ний.

Анализ содержания имазетапира в почве проводили перед посевом рас- тений (исходная точка) и в конце опыта. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Изменение содержания имазетапира в почве в лаборатор- ном эксперименте

Примечание. ОДК в почве для имазетапира 0,1 мг/кг

Таким образом, предложенный штамм бактерий обладает свойствами деградировать гербицид имазетапир и стимулировать рост растений, выра- щиваемых в загрязненной им почве. Сочетание указанных свойств может обеспечить как биодеградацию загрязнителя в грунте, так и приживаемость и стимуляцию роста высаженных в загрязненную почву растений.

Пример 3. Влияние штамма Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 на рост и развитие растений мягкой яровой пшеницы ( Triticum aestivum L.) cop- та «Симбирцит» в песке, искусственно загрязненном имазетапиром.

В качестве модельного гербицида использовали препарат «Пивот, ВК» (ДВ: имазетапир, 100 г/л). Растворы препарата вносили в следующих количе- ствах (на г сухого кварцевого песка): 114x10 ^-7 мл, 28,5><10 ⁷ мл. Расчет кон- центраций гербицида на единицу массы субстрата проводили, исходя из насыпной плотности кварцевого песка 1750 кг/м ³ и предполагаемой глубины проникновения пестицидов 20 см. Обработку песка клетками Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 проводили после внесения в грунт гербицида, из расчета 10 ⁷ клеток/г песка. Суспензию клеток микроорганизма готовили в стерильном растворе Кнопа с микроэлементами и глицерином в качестве ис- точника углерода и энергии в концентрации 3 г/л.

Перед закладкой опытов песок стерилизовали автоклавированием при давлении 1 атм. в течение 1 часа. Бактеризацию грунта проводили в двух ва- риантах: А - через 1 сут. после обработки грунта пестицидом, посев растений - через 14 сут., Б - через 5 сут. после добавления пестицида в песок, посев растений - через 21 сут. До высадки растений песок увлажняли стерильным раствором Кнопа с глицерином в концентрации 0,5 г/л, но без микроэлемен- тов; после посева семян пшеницы - стерильным раствором Кнопа без глице- рина и микроэлементов.

Перед посадкой семена растений стерилизовали с помощью 3 % переки- си водорода с последующей десятикратной отмывкой стерильной дистилли- рованной водой. Оценку роста растений проводили спустя 4 недели после их посадки. Об интенсивности роста судили на основании морфологических параметров (длины корней и побегов), а также проводили определение содержания белка в корнях и побегах растений по методу Лоури и определение содержания хлорофилла в листьях спектрофотометрическим методом.

При анализе влияния бактеризации на рост пшеницы сорта «Симбир- цит» установлено, что внесение в песок культуры Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 оказывает благоприятный эффект на рост и развитие расте- ний в загрязнённом грунте (таблица 3, рисунки 3 и 4).

Таблица 3 - Морфометрические и биохимические показатели растений пшеницы сорта Симбирцит при воздействии гербицида Пивот и бактериза- ции Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143.

Высев пшеницы в песок, предварительно обработанный штаммом Rho- dococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143, через 14 сут. после бактеризации при- водил к формированию более развитых корней и побегов у растений птттени- цы. Так, при концентрации препарата Пивот 28,5 ^c 10 ^-7 мл/г песка добавление микроорганизмов в песок приводило к удлинению корней в 1,5 раза (на 45 %), при концентрации данного препарата 114x10 ⁷ мл/г песка наблюдалось удлинение корней в 1,2 раза (на 19 %). При этом в обоих случаях длина побе- гов увеличивалась более чем в 2 раза по сравнению с не бактеризованными вариантами. В то же время посев пшеницы через 21 день после бактеризации песка приводил к более выраженному эффекту микроорганизмов на прорас- тание растений. В данном случае при концентрациях пестицида 28,5x10 ⁷ мл/г песка и 114x10 ^-7 мл/г песка отмечено увеличение длины корней в 1,8 раз (на 84 %) и в 1,5 раз (на 49 %), соответственно. Также в песке, обработанном микроорганизмами, отмечено увеличение длины формируемых побегов пше- ницы более чем в 3 раза по сравнению с растениями, высеянными в загряз- нённый грунт без добавления Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143.

Таким образом, показано, что штамм Rhodococcus qingshengii ВКПМ Ас-2143 оказывает положительное воздействие на морфологические и био- химические характеристики растений мягкой яровой пшеницы.