Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von l-Hydroxymethyl-1.4- androstadien-3.17-dion der Formel I

welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man l-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion der Formel II

mit einer lebenden Kultur eines Mikroorganismus der Gattung Absidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus oder Streptomyces fermentiert.

l-Hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion ist bekanntlich eine pharmakologisch wirksame Verbindung (EP-B 0,129,500) und ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Wirksubstanzen (DE-A 4.330,237.8). Nach dem bisher gekannten Stand der Technik wird diese Substanz in einer vielstufigen, sehr aufwendigen chemischen Synthese letztlich aus 1.4-Androstadien-3.17-dion hergestellt, wie aus der bereits erwähnten Europäischen Patentschrift EP-B 0,129,500 ersichtlich ist.

Es wurde nun gefunden, daß man diese Verbindung in relativ einfacher Weise auf fermentativem Wege aus l-MethyI-1.4-androstadien-3.17-dion herstellen kann, welches selbst wiederum in einer einstufigen Reaktion aus 1.4-Androstadien-3.17-dion synthetisiert werden kann (WO 94/04553).

Geeignete Mikroorganismen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sinbd wie bereits erwähnt solche der Gattung Asidia, Aspergillus, Botrydiplodia, Glomerella, Haplosporeila, Rhizopus oder Streptomyces. Als besonders geeignet haben sich solche der Spezies Absidia coerulea (ATCC 6647), Aspergillus oniki (CBS 11832), Botryodiplodia malorum (CBS 13450), Glomerella cingulata (ATCC 12097 und IFO 5257), Haplosporeila acaciae (CBS 46969), Rhizopus arrhizus (ATCC 11145) und Streptomyces platensis (NRRL 2364) erwiesen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter den Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Umwandlungen von anderen Substraten mit diesen Mikroorganismen-Kulturen anwendet.

Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur eine Lösung (beispielsweise in Methanol, Ethanol, Glykolmonomethylether, Dimethylforma id oder Dimethylsulfoxid) oder eine wässrige Suspension des l-Methyl-1.4-androsten-3.17-dion zu und fermentiert bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Die wässrige Suspension des l-Methyl-1.4-androsten-3.17-dions läßt sich in einfacher Weise herstellen, indem man beispielsweise dieser Substanz mit der zweifachen bei fünffachen Menge Wasser unter Zusatz eines nichtionischen Tensids in einer Kugelmühle mahlt, bis sie eine Korngröße von ca. 1 bis 5 μ besitzt. Geeignete Tenside sind beispielsweise die handelsüblichen Netzmittel wie Tegin ®, Tween ® oder Span ® genannt.

Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur in üblicher Weise aufbereitet, beispielsweise indem man sie mit einem in Wasser schwer löslichen Alkohol, Keton oder Ester extrahiert, den Extrakt einengt und den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie und/oder Kristallisation aufreinigt.

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur nächeren Erläuterung des erfindungs¬ gemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Zwei 2-1 Erlenmeyerkolben, die je 1000 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 1% Com steep liquor und 1,25 % Sojabohnenmehl (pH 6.2) enthalten, werden mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus ochraceus (NRRL 405) beimpft und 2 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt.

Mit je 1500 ml dieser Anzucht wird ein 301-Fermenter beimpft, der mit 23,5 1 sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung wie für die Vorkultur beschrieben beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0,7 bar Überdruck unter Belüftung (15 1/min) und Rühren (220 Umdrehungen pro Minute) wird eine sterilfiltrierte Lösung von 5 g l-Methyl-1.4-androstadien-3.17-dion in 75 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silikon SH kontrolliert. Nach 36 Stunden Kontaktzeit wird die Kulturbrühe einem mit 12,51 und zweimal mit 8 1 Methylisobutylketon extrahiert.

Die vereinigten Extrakte aus 12 Fermentern mit einem Substanzeinsatz von 69 g werden am Rotationsverdampfer bis auf ca. 1 1 eingeengt, wobei das gewünschte Produkt auskristalisiert. Man erhält 59,43 g l-Hydroxymethyl-l,4-androstadien-3,17-dion als leicht verunreinigtes Rohprodukt (Schmelzpunkt 195/197-198°C). Die Chromatographie der Mutterlaugen an Kieselgel mit einem Gradienten aus Dichlormethan und Aceton und Kristallisation aus Aceton liefert weitere 7,95 g 1- HydroxymethyI-l,4-androstadien-3,17-dion (Schmelzpunkt 206-208° .

Beispiel 2

Ein 2-1 Erlenmeyerkolben, der mit 1000 ml einer 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisierten Nährlösung aus 3% Glucose, 1.0% Com Steep liquor, 0.2% NaNθ3, 0.1% KH ₂ PO , 0.2% K ₂ HPO ₄ , 0.05% MgSO ₄ ^• 7H ₂ 0, 0.002% FeSO ₄ • 7H ₂ O und 0.05% KCI (pH 5.7) enthält, wird mit einer Schrägröhrchen-Kultur des Stammes Aspergillus onϋά (CBS 118329) beimpft und 2.5 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschüttler geschüttelt. Mit 1 1 dieser Anzucht wird ein 201-Fermenter beimpft, der mit 19 1 sterilen Mediums der gleichen Zusammensetzung wie für die Vorkultur beschrieben beschickt ist. Nach einer Anwachsphase von 12 Stunden bei 0.7 bar Überdruck (29°C) unter Belüftung (201/min) und Rühren (220 Upm) wird eine steri. filtrierte Lösung von 4 g l-Methyl-1,4- androstadien-3,17-dion (ZK 95639) 1 in 75 ml Dimethylformamid hinzugegeben und weiter gerührt und belüftet. Schaumbildung wird durch Zugabe von Silikon SH kontrolliert. Nach 35 Stunden Kontakt wird die Kulturbrühe einmal mit 101 und einmal mit 81 Methylisobutylketon extrahiert.

Die Chromatographie an Kieselgel mit einem Gradienten aus Hexan und Aceton und Kristallisation aus Aceton/Isoether liefert 1.96 g 2.