TECHNISCHES GEBIET

[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft Mittel und Verfah- ren zur Hydroxylierung von Steroiden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0002] 3,7,12-Trihydroxylierte Gallensäuren, wie z.B. Chol- säure (3α,7α,12α-Trihydroxy-5ß-cholansäure) oder Ur- socholsäure (3α,7ß,12α-Trihydroxy-5ß-cholansäure) sind industriell bedeutsame Chemikalien, unter anderem als Ausgangsstoffe zur Herstellung von Ursodesoxycholsäure (UDCA). Ursodesoxycholsäure wird als Medikament u.a. ein- gesetzt zur Auflösung kleinerer Röntgen-negativer Gallen- steine sowie zur Behandlung der Lebererkrankungen primär ziliare Zirrhose und primär sklerosierende Cholangitis.

[0003] Die industriell wichtigste Quelle für 3,7,12-trihyd- roxylierte Gallensäuren ist Gallenflüssigkeit aus Gallen- blasen, die als Schlachtabfälle in der Fleischproduktion anfallen. Neben anderen Tierarten wird häufig die Galle von Rindern verwendet. Es existiert keine industriell re- levante Totalsynthese für 3,7,12-trihydroxylierte Gallen- säuren. Da die Produktion von Gallensäuren an ein anderes Produkt (Fleisch) gekoppelt ist, kann nur sehr begrenzt auf eine gesteigerte Nachfrage reagiert werden. Aus die- sem Grund ist eine möglichst effiziente Nutzung des Roh- stoffs Galle von großem Interesse.

[0004] Da Galle eine wässrige Mischung aus Gallensäuren, Li- piden, Cholesterin und anderen Substanzen ist, kommt der Trennung der Bestandteile bei der Gewinnung von Gallen- säuren eine besondere Bedeutung zu. Auch die Gallensäuren stellen wiederum ein Gemisch dar, dessen Bestandteile sich durch Anzahl und Position der Hydroxylgruppen unter- scheiden. In Rindergalle ist neben Cholsäure auch ein signifikanter Anteil von Desoxycholsäure enthalten, wel- che sich von Cholsäure durch das Fehlen der OH-Gruppe an Position 7 unterscheidet (3a,12α-Dihydroxy-5ß-cholan- säure). Desoxycholsäure hat einen wesentlich geringeren kommerziellen Wert als 3,7,12-trihydroxylierte Gallensäu- ren. Es besteht daher ein industrielles Interesse an der Überführung von Desoxycholsäure in eine 3,7,12-trihydro- xylierte Gallensäure durch gezielte Einführung einer Hyd- roxylgruppe an Position 7.

[0005] Bei Hydroxylierungen wird formal in einer Oxidations- reaktion ein Sauerstoff-Atom in eine (nicht aktivierte) C-H-Bindung eingefügt. In der organischen Chemie sind dies sehr schwierig durchzuführende Reaktionen. Häufig werden OH-Gruppen durch Umwege eingefügt, z.B. durch die Addition von Wasser an einer C=C-Doppelbindung. Die se- lektive Hydroxylierung an einer bestimmten Position eines komplexen Moleküls (wie z.B. einer Gallensäure) ist prob- lematisch, da mehrere chemisch (nahezu) gleichwertige C- H-Bindungen vorliegen.

[0006] Ein Verfahren zur enzymatischen Umsetzung von Lit- hocholsäure zu Ursodesoxycholsäure unter Verwendung einer 7β-Hydroxylase ist in der WO 2018/227940 Al offenbart.

[0007] Schmitz et al. (Microbial Cell Factories 13 (1): 1-13 (2014)) beschreiben die Herstellung von 7-Hydroxyl-Deri- vaten von Dehydroepiandrosteron (DHEA) oder Pregnenolon (PREG) durch Umsetzung mit einer Cytochrom P450 Mo- nooxygenase.

[0008] Die CN 102002 518 B offenbart die Umsetzung von 3-ß- Cholesterolacetat zu 7-ß-Hydroxyl-3-ß-Cholesterolacetat mit einer Hydroxylase.

[0009] In der WO 2020/109776 A2 wird ein Verfahren zur Hyd- roxylierung oder Dealkylierung von verschiedenen organi- schen Verbindungen, unter anderem von dem Steroid Preg- nenolon, mit einem Cytochrom P450 offenbart.

[0010] Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel und Verfahren bereitzustellen, Steroide, wie Gallensäuren und Derivate davon, welche an Position 7 ein Wasserstoff und keine Hydroxylgruppe aufweisen, spezifisch an dieser Stelle zu hydroxylieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG [0011] Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung eines Steroids mit der allgemeinen Formel (I)

(I), wobei

Xi und X2 unabhängig voneinander H, CI, F, Br, I, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, OH, ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest, CN, N0 ₂ , N(R ₆₎ 2, eine Epoxygruppe, CHO oder ein C0 ₂ R. ₆ -Rest sind, wobei

R ₆ -C(O)H, -C(O)CH ₃ , -C(O)CH ₂ CH ₃ , -C (O)(CH _{2 ) 2} CH _3, - C(O)CH (CH ₃₎ 2, -C(O)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(O)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C(O)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(O)C(CH ₃₎₃ , -C(O)Ph, - C(O)CH ₂ Ph ist,

Ri und R ₂ unabhängig voneinander H, OH, OR7 oder 0 sind, wobei

R ₇ -C(O)H, -C(O)CH ₃ , -C(O)CH ₂ CH ₃ , -C (O)(CH _{2 ) 2} CH _3, - C(O)CH (CH ₃₎ 2, -C(O)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(O)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C(O)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(O)C(CH ₃₎₃ , -C(O)Ph, - C(O)CH ₂ Ph ist,

R ₃ H, OH, OR ₈ , ein Ci bis C10 Alkylrest, ein Ci bis C10 Alkenylrest, -CHO, -C(O)(CH ₃₎ , -C(O)(CH ₂ 0H), - CH (CH ₃₎ C(O)CH ₃ , -CH (CH _{3) ( (} CH ₂₎ 2CO2R9) oder - CH (CH _{3) ( (} CH ₂₎ 2CONHR9) ist, wobei

R ₈ -C (O)H, -C(O)CH ₃ , -C(O)CH ₂ CH ₃ , -C (O)(CH _{2 ) 2} CH _3, - C(O)CH (CH ₃₎ 2, -C(O)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(O)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C(O)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(O)C(CH ₃₎₃ , -C(O)Ph, oder - C(O)CH ₂ Ph ist, und R _g -CH ₃ , -CH ₂ COOH, -CH ₂ CH ₃ , -CH ( CH ₃ ) ₂ , - ( CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - ( CH ₂ ) ₂ SO ₃ H, C ( CH ₃ ) ₃ , - ( CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -CH ( CH ₃ ) CH ₂ CH ₃ , - CH2CH2 ( CH ₃ ) 2 , eine Arylgruppe oder eine Alkylaryl- gruppe ist,

R4 H, OH, oder -OR10 ist, wobei

Rio -C(O)H, -C(O)CH ₃ , -C(O)CH ₂ CH ₃ , -C(O)(CH _{2) 2} CH _3, - C (O)CH (CH ₃₎ 2, -C(O)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(O)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C (O)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(O)C(CH ₃₎₃ , -C(O)Ph, oder - C(O)CH ₂ Ph ist und

R ₅ H, CF ₃ , ein Ci bis C ₆ Alkylrest, ein Ci bis C ₆ Alkenyl- rest, OH, 0, oder ein Ci bis C ₆ Alkoxyrest ist, wobei die gestrichelte Linie eine optionale Doppelbindung be- deutet, mit der Maßgabe, dass der B-Ring keine Doppelbin- dung aufweist, wenn der A-Ring eine C4-C5-Doppelbindung und der C-Ring keine Doppelbindung aufweist, wenn Xi und X2 eine Epoxygruppe ausbilden, umfassend den Schritt des Umsetzens eines 7-Desoxystero- ids mit der allgemeinen Formel (II) mit einer Cytochrom P450- Hydroxylase oder einer funktio- neilen Variante davon in Anwesenheit mindestens eines Re- doxpartnersystems und eines Systems zur Regenerierung des Redoxpartnersystems , wobei das Cytochrom P450-Enzym eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90%, insbeson- dere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2, gelöst. [0012] Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass Cy- tochrom P450 und funktionelle Fragmente davon in der Lage sind, Steroide, wie Cholsäure bzw. Derivate davon mit der Formel (I) an Position 7 zu hydroxylieren. Durch die Kopplung dieser Reaktion mit mindestens eines Redoxpart- nersystems und eines Systems zur Regenerierung des Redox- partnersystems kann das Gleichgewicht der Reaktion auf die Seite des Endprodukts verschoben und somit dessen Ausbeute signifikant gesteigert werden. Die Regeneration des Redoxpartnersystems kann dabei in Anwesenheit eines zweiten Systems (eines Regenerationssystems) erfolgen, welches vorzugsweise mindestens eine Oxidoreduktase und mindestens ein Substrat der mindestens einen Oxidoreduk- tase umfasst.

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN

[0013] Cytochrom P450 und funktionelle Varianten davon, die die Oxidation von Reduktionsäquivalenten NAD(P)H erfor- dern, sind überraschender Weise in der Lage, 7-Desoxyste- roide, wie z.B. 7-Desoxycholsäure, und Derivate davon se- lektiv an Position 7 zu hydroxylieren.

[0014] Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Cy- tochrom P450-Enzym eine Aminosäuresequenz, die mindestens 90%, insbesondere 100%, ident ist mit der Aminosäurese- quenz SEQ ID Nr. 1 oder 2.

[0015] Cytochrome P450 katalysieren Monooxygenase-Reaktionen einer Vielzahl von endogenen sowie von exogenen Substra- ten. Sie sind u.a. am Stoffwechsel von Steroiden, Eicosanoiden, Fettsäuren und Gallensäuren sowie von exo- genen Substraten, wie Arzneistoffen, Insektiziden und chemischen Karzinogenen beteiligt.

[0016] Cytochrome P450 gemäß vorliegender Erfindung können beispielweise aus Bakterien, wie z.B. Actinobakterien, insbesondere z.B. der Gattung Streptomyces verwendet wer- den. Dabei können die Sequenzen mit Hilfe bekannter Tech- niken zum Beispiel aus genomischer DNA oder einer cDNA- Bibliothek isoliert werden. [0017] Die Cytochrome P450 gemäß vorliegender Erfindung bzw. deren funktionelle Varianten können wahlweise in ihrem Ursprungsorganismus vorhanden oder aus diesem isoliert sein, oder sie sind rekombinant exprimiert oder synthe- tisch hergestellt. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß rekombinant exprimierte Polypeptide verwendet.

[0018] Zur rekombinanten Expression von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene etablierte Mikroorganismen verwendet werden, wie z.B. Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevi- siae oder Pichia pastoris. Entsprechende Protokolle sind dazu sind in der einschlägigen Fachliteratur ausführlich beschrieben oder einer fachkundigen Person bekannt.

[0019] Enzyme/Polypeptide werden gemäß vorliegender Erfin- dung bevorzugt als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet, wobei bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate entweder ohne weitere Bearbeitung/Aufreini- gung oder nach relativ einfachen Bearbeitungsschritten (z.B. Zentrifugation, Fällung, Konzentration oder Ge- friertrocknung) eingesetzt werden. Alternativ können auch E. coli Zellen nach rekombinanter Überexpression der ver- wendeten Enzyme ohne Zellaufschluss direkt oder zum Bei- spiel nach einem Zyklus Einfrieren/Auftauen in der Reak- tion eingesetzt werden. Geeignete Expressionsplasmide sind einer fachkundigen Person bekannt und können viel- fach kommerziell erworben werden.

[0020] „Funktionelle Varianten" von Cytochrom P450 können Fragmente oder Mutationsvarianten von Cytochrom P450 sein, wobei Fragmente von Cytochrom P450 auch als „funk- tioneile Fragmente" bezeichnet werden können. „Funktio- neile Varianten" von Cytochrom P450 sind in der Lage die- selbe Reaktion zu katalysieren, wie das Protein, von dem diese abgeleitet wurden. Ob eine Variante funktionell ist, d.h. ob diese dieselbe Reaktion katalysiert wie das Protein, von dem diese abgeleitet wird, kann dadurch be- stimmt werden, in dem festgestellt wird, dass die Vari- ante dieselbe Reaktion katalysiert. Hierfür gibt es etab- lierte Methoden im Stand der Technik bzw. jene, die hie- rin beschrieben sind. Die Umsetzungsraten von Substraten durch die erfindungsgemäßen funktionellen Varianten kön- nen von den Umsetzungsraten des Cytochroms P450, von dem diese abgeleitet wurden, abweichen.

[0021] „Derivate von 7-Desoxysteroiden" umfassen von 7-Des- oxysteroiden abgeleitete Verbindungen mit unterschied- lichsten Modifikationen wie oben definiert.

[0022] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung sind Xi, X2, R ₄ und R ₅ H und Ri und R2 unabhängig voneinander H, OH, OR ₈ oder 0, wobei R ₈ -C (O)H, -C(O)CH ₃ , -C(O)CH ₂ CH ₃ , -C (O)(CH _{2 )} CH _3, - C(O)CH (CH ₃₎ 2, -C(O)(CH _{2) 3} CH ₃ , -C(O)CH (CH ₃₎ CH ₂ CH ₃ , - C(O)CH2CH2(CH ₃₎ 2, -C(O)C(CH ₃₎₃ , -C(O)Ph, -C(O)CH ₂ Ph ist,

R ₃ ein Ci bis C ₁₀ Alkylrest, ein Ci bis C ₁₀ Alkylenrest, - CH (CH ₃ )((CH ₂ )2CO2R9) oder -CH (CH ₃ )((CH ₂ )2CONHR9), wobei R _g -CH ₃ , -CH ₂ COOH, -CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , -(CH ₂ ) ₂ CH ₃ , - (CH ₂ ) ₂ SO ₃ H, C(CH ₃ ) ₃ , -(CH ₂ ) ₃ CH ₃ , -CH (CH ₃ )CH ₂ CH ₃ ,- CH2CH2(CH ₃ )2, eine Arylgruppe oder eine Alkyla- rylgruppe ist.

[0023] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Arylgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Phenylrest, einem mit F,

C ₁ , Br, NO ₂ oder CH ₃ substituierten Phenylrest und einem Heteroaryl .

[0024] Gemäß einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Alkylarylgruppe ausge- wählt aus der Gruppe bestehend aus einer Benzylgruppe, einer halogenierten Benzylgruppe, wobei das Halogen F, Ci oder Br ist, und einer mit NO ₂ substituierten Benzylgruppe .

[0025] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung ist Ri OH, R ₂ O oder OH, R ₃ CH(CH _{3) ( (} CH _{2) 2} CO2R5), R4 H, und R ₅ H.

[0026] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das 7-Desoxysteroid mit der allgemeinen Formel (II) ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus 3a,12α-Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3a,12ß- Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3ß,12α-Dihydroxy-5ß-cholan- 24-Säure, 3ß,12ß-Dihydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3ß-Hyd- roxy-12-Keto-5ß-cholan-24-Säure, 3-Keto,12ß-hydroxy-5ß- cholan-24-Säure, 3-Keto,12α-hydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3α-Hydroxy-5ß-cholan-24-Säure, 3-Keto-5ß-cholan-24-Säure, 3ß-Hydroxy-5ß-cholan-24-Säure und Ester der jeweiligen Säure .

[0027] Das Cytochrom P450-Enzym, das erfindungsgemäß zur Hydroxylierung von 7-Desoxysteroiden und Derivaten davon mit der allgemeinen Formel (II) zu einem Steroid oder ei- nem Derivat davon mit der allgemeinen Formel (I) einge- setzt wird, umfasst eine Aminosäuresequenz, die mindes- tens 90%, noch mehr bevorzugt mindestens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevorzugt mindestens 97%, noch mehr bevorzugt mindestens 98%, noch mehr bevor- zugt mindestens 99%, insbesondere 100%, ident ist mit der Amiinosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2 ist.

SEQ ID Nr. 1:

SEQ ID Nr. 2: [0028] Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 1 und 2 werden vor- zugsweise durch Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 3 und 4 kodiert, wobei Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 5 und 6 für die Expression in E.coli optimiert sind.

SEQ ID Nr. 3:

SEQ ID Nr. 4:

SEQ ID Nr. 5:

SEQ ID Nr. 6:

[0029] „Ident", wie hier verwendet, bedeutet, dass zwei oder mehr Aminosäuresequenzen, wenn diese übereinander gela- gert werden, eine bestimmte „Identität" (übereinstimmende Aminosäurereste an identen Positionen) zueinander aufwei- sen können. „Identität" wird in dieser Erfindung defi- niert als die Prozentzahl der Aminosäuren der in Frage kommenden Aminosäuresequenzen, die identisch mit den Ami- nosäuren der Ausgangssequenz sind, und zwar nach Abgleich der beiden Sequenzen und der Einführung von Lücken, falls notwendig, um die maximale prozentuale Sequenzidentität zu erzielen wie sie durch das Programm „Protein BLAST" (blastp; Altschul et al., J. Mol. Biol. (1997) 215:403- 410; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi; hier im Allgemeinen als "BLAST" bezeichnet) erzeugt werden, wobei alle variablen Parameter auf Default-Werte gesetzt sind. Hierin wird der Algorithmus "blastp (Protein-Protein- BLAST) " mit folgenden Parametern verwendet: „expect threshold": 0.05; „word size": 6; Matrix: BLOSUM62; „Gap costs": „Existence" 11, „Extension" 1; bedingte komposi- tioneile Score-Matrixanpassung; kein Filter und keine Maske. Ein prozentualer (%) Wert für die Aminosäurese- quenzidentität wird durch die Zahl der übereinstimmenden identischen Nukleotide dividiert durch die Sequenzlänge, für welche die prozentuale Identität festgehalten wird, bestimmt .

[0030] Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können 7- Desoxysteroide bzw. Derivate davon mit der allgemeinen Formel (II) mit Cytochrom P450 oder einer funktionellen Variante davon zu Steroiden bzw. Derivaten davon mit der allgemeinen Formel (I) umgesetzt werden, wobei das Cy- tochrom P450-Enzym eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 90%, insbesondere 100%, ident ist mit der Ami- nosäuresequenz SEQ ID Nr. 1 oder 2. Diese Umsetzung er- folgt in Anwesenheit von Redoxpartnern oder eines Redox- partnersystems, welches in der Lage ist Elektronen für die Hydroxylierungsreaktion zur Verfügung zu stellen.

[0031] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung umfasst das mindestens eine Redoxpart- nersystem

(i) Ferredoxin, Ferredoxin-Reduktase und NAD(P)H;

(ii) Cytochrom P450 Reduktase und NAD(P)H; oder

(iii) NAD(P)H.

[0032] Das erfindungsgemäß verwendete Redoxpartnersystem kann Ferredoxin, Ferredoxin-Reduktase und NAD(P)H; Cy- tochrom P450 Reduktase und NAD(P)H; oder NAD(P)H, al- leine, umfassen, wobei ein Redoxpartnersystem umfassend Ferredoxin, Ferredoxin-Reduktase und NAD(P)H besonders bevorzugt ist.

[0033] Um die Redoxreaktion von erfindungsgemäßem Cytochrom P450 bzw. deren funktionellen Varianten davon durchzufüh- ren, ist es somit von Vorteil, im erfindungsgemäßen Ver- fahren zumindest die Redoxcofaktoren NAD+/NADH und/oder NADP+/NADPH einzusetzen. Dabei bezeichnet NAD+ die oxi- dierte Form und NADH die reduzierte Form von Nicotinamid- adenindinucleotid, während NADP+ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleo- tidphosphat bezeichnet. [0034] Die Konzentration der Redoxcofaktoren NAD(P)+ und/o- der NAD(P)H in einer Reaktionsmischung beträgt vorzugs- weise zwischen 0,001 mM und 10 mM, noch mehr bevorzugt zwischen 0,05 mM und 1 mM.

[0035] Besonders bevorzugt werden Ferredoxine als Redox- partner eingesetzt, welche in Anwesenheit von NAD(P)+ und mindestens einer Ferredoxin-Reduktase regeneriert werden können. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vor- liegenden Erfindung ist das mindestens eine Ferredoxin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adrenodoxine, Putidaredoxine und Flavodoxine, wobei gegebenenfalls auch Kombinationen davon eingesetzt werden können.

[0036] Ein mögliches Paar von Redoxpartnern umfasst vorzugs- weise Putidaredoxin und Putidaredoxin-Reduktase aus Pseu- domonas putida. Eine fachkundige Person ist darüber hin- aus in der Lage, weitere Ferredoxin-Proteine und Ferredo- xin-Reduktasen zu identifizieren, welche potentielle Re- doxpartner für das erfindungsgemäße Cytochrom P450 sind. Die Eignung als Redoxpartner lässt sich in einem funktio- neilen Assay überprüfen, wie beispielsweise in den Bei- spielen 3 bis 5 beschrieben wird. Das in diesen Beispie- len verwendete Putidaredoxin und/oder die darin verwen- dete Putidaredoxin-Reduktase kann durch mögliche alterna- tive Proteine bzw. Enzyme ersetzt werden. Wird eine aus- reichende Bildung des gewünschten Produkts (z.B. Ur- socholsäure) beobachtet, so können die getesteten Redox- partner als funktionelle Alternativen zu Putidaredoxin und/oder Putidaredoxin-Reduktase betrachtet werden.

[0037] Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ferredoxin eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevorzugt min- destens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevorzugt mindestens 97%, noch mehr bevorzugt min- destens 98%, noch mehr bevorzugt mindestens 99%, insbe- sondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7, wobei X ein Methionin-Rest oder keine Aminosäure ist .

SEQ ID Nr. 7:

[0038] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung ist die mindestens eine Ferredoxin-Re- duktase ausgewählt aus der Gruppe der Flavodoxin-Reduktα- sen und Putidaredoxin-Reduktase.

[0039] Das im Zuge der erfindungsgemäßen Hydroxylierungsre- aktion oxidierte Ferredoxin kann mit Hilfe einer Ferredo- xin-Reduktase und NAD(P)H reduziert werden. Dadurch wird reduziertes Ferredoxin unter Verbrauch von NAD(P)H für eine weitere Hydroxylierungsreaktion des erfindungsgemä- ßen Substrats wieder bereitgestellt bzw. regeneriert. Die Ferredxon-Reduktase kann eine Flavodoxin-Reduktase und/o- der eine Putidaredoxin-Reduktase sein.

[0040] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Ferredoxin-Reduktase eine Aminosäu- resequenz, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, noch mehr bevorzugt mindestens 90%, noch mehr bevor- zugt mindestens 95%, noch mehr bevorzugt mindestens 96%, noch mehr bevorzugt mindestens 97%, noch mehr bevorzugt mindestens 98%, noch mehr bevorzugt mindestens 99%, ins- besondere 100%, ident ist mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 8.

SEQ ID Nr. 8:

[0041] Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 7 und 8 werden vor- zugsweise durch Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 9 bzw.

10 kodiert, wobei Nukleinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 11 bzw. 12 für die Expression in E.coli optimiert sind.

SEQ ID Nr. 9:

(ATG) ₀ o _{der 1}

SEQ ID Nr. 10:

SEQ ID Nr. 11:

( ATG ) 0 oder 1

SEQ ID Nr. 12:

[0042] Die Expression des erfindungsgemäßen Cytochroms P450 und etwaigen Ferredoxinen und Ferredoxin-Reduktasen in Bakterien, insbesondere in E. coli, ist besonders vor- teilhaft unter Verwendung von Nukleinsäuren mit den Nuk- leinsäuresequenzen SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 11 und/oder SEQ ID Nr. 12. Daher betreffen weitere As- pekte der vorliegenden Erfindung eine Nukleinsäure (DNA und/oder RNA) mit einer Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 und Vektoren und/oder Zellen, insbesondere E. coli Zellen, umfassend mindestens eine dieser Sequenzen.

[0043] Es hat sich gezeigt, dass es vorteilhaft ist, wenn die oben genannten Ferredoxine und Ferredoxin-Reduktasen gemeinsam mit Cytochrom P450 in einem Produktionsstamm (z.B. E. coli Stamm) gemeinsam exprimiert (co-exprimiert) werden. Die Ferredoxine, Ferredoxin-Reduktasen und das Cytochrom P450 können auch getrennt voneinander expri- miert werden. Es ist auch vorteilhaft, Ferredoxin und Cy- tochrom P450 oder Ferredoxin-Reduktase und Cytochrom P450 gemeinsam zu exprimieren. Durch die Co-Expression der drei Proteine bzw. Enzyme, idealerweise unter demselben Promoter, kann ein ideales Gleichgewicht zwischen den En- zymen hergestellt werden, welches sich besonders vorteil- haft auf die enzymatische Umsetzung eines Substrats aus- wirkt .

[0044] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung ist die mindestens eine Oxidoreduktase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxidoreduktase (EC: 1.1.1), Aldehyd Dehydrogenase (EC: 1.2.1), Aminosäu- ren Dehydrogenase (EC: 1.4.1), Flavin Reduktase (EC:1.5.1), Transhydrogenase (EC: 1.6.1), Nitrit Reduk- tase (EC: 1.7.1) und Phosphonat Dehydrogenase (EC: 1.20.1) ist, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe be- stehend aus Alkohol-Dehydrogenase, Hydroxysteroid-Dehyd- rogenase, Phosphit-Dehydrogenase und Zucker-Dehydrogenase

[0045] Um den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Redoxpartnersystems , insbesondere den dabei eingesetzten Kofaktor (NADH/NAD ⁺ und/oder NADPH/NADP ⁺ ), während der Um- setzung des Steroids mit der allgemeinen Formel (I) in ein 7-Desoxysteroid mit der allgemeinen Formel (II) zu regenerieren, so dass die Umsetzungsreaktion in Richtung Produkt gedrängt wird, ist es von Vorteil ein System zur Regenerierung des Redoxpartnersystems, vorteilhafterweise Oxidoreduktasen, dem Reaktionsgemisch zuzusetzen. Oxido- reduktasen setzen Substrate durch Reduktion und Oxidation um, wobei im Zuge dieser Reaktionen NADH zu NAD ⁺ bzw. NADPH zu NADP ⁺ oxidiert bzw. NAD ⁺ zu NADH bzw. NADP ⁺ zu NADPH reduziert wird. Daher umfasst das System zur Rege- nerierung des Redoxpartnersystems vorzugsweise mindestens eine Oxidoreduktase und mindestens ein Substrat der min- destens einen Oxidoreduktase.

[0046] Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Oxido- reduktase ist vorzugsweise eine Alkohol- und/oder Zucker- Dehydrogenasen .

[0047] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Oxidoreduktase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose-Dehydrogenase, Glu- cose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Arabinose-Dehydrogenase, Xylose-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase, Xylitol-De- hydrogenase, 12α-Hydroxysteroid-Dehydrogenase, 7α-Hydro- xysteroid-Dehydrogenase, 20 -Hydroxysteroid Dehydro- genase, 17ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase, 17 -Hydroxyste- roid Dehydrogenase, 3α-Hydroxysteroid Dehydrogenase, 3ß- Hydroxy-delta5 Dehydrogenase, 1lß-Hydroxysteroid Dehydro- genase und Formiat-Dehydrogenase.

[0048] Die Verwendung von einer oder mehreren der genannten Oxidoreduktasen ist besonders vorteilhaft, um die in der Umsetzungsreaktion eingesetzten Cofaktoren zu recyceln.

[0049] Es hat sich gezeigt, dass es besonders vorteilhaft ist Arabinose-Dehydrogenase, Sorbitol-Dehydrogenase und/oder Xylitol-Dehydrogenase zum Reaktionsgemisch zu geben, um einen hohen Umsatz des Substrats zum Produkt zu erzielen .

[0050] Das Reaktionsgemisch kann mindestens eine Oxidoreduk- tase und eine Hydroxylase umfassen. Besonders vorteilhaft ist die Zugabe einer Kombination von zwei oder drei oder weiterer Oxidoreduktasen zum Reaktionsgemisch, wobei eine Kombination einer 12α-Hydroxysteroid Dehydrogenase und einer 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase bzw. einer 12α-Hyd- roxysteroid Dehydrogenase, einer 7α-Hydroxysteroid Dehyd- rogenase und einer NAD (P)H-Oxidase bzw. einer NADH abhän- gigen Alkohol Dehydrogenase und einer Hydroxylase bzw. einer NADPH abhängigen Alkohol Dehydrogenase und einer Hydroxylase sich besonders für die Substratgemische eig- net, beispielsweise für die gleichzeitige Oxidation und Hydroxylierung von natürlich vorkommenden Gemischen von Cholsäuren .

[0051] Um die Oxidations- bzw. Reduktionsreaktionen der

Cofaktoren im Reaktionsgemisch des erfindungsgemäßen Ver- fahrens zu katalysieren, ist es notwendig mindestens ein Substrat für die darin vorhandenen Oxidoreduktasen be- reitzustellen. Daher umfasst das Reaktionsgemisch mindes- tens ein Substrat der mindestens einen Oxidoreduktase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arabinose, Xy- lose, Glucose, Sorbitol, Xylitol, Cholan-24-Säure,

3a,12α-Dihydroxycholan-24-Säure 2,3-Butandiol, Acetoin, 2-Propanol, Glutamate, Ethanol, Phosphonate, Phosphite, Nitrite, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Butanol, 2-Oktanol, Cyc- lohexanol, Ethandiol, 1,2-Propandiol, 1-Propanol, 1-Butα- nol, 3-Hydroxy-Butanoat und Formiat. Gemäß einer bevor- zugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur von 10°C bis 40°C, vorzugsweise von 15°C bis 38°C, noch mehr bevorzugt von 20°C bis 30°C, noch mehr bevorzugt von 22°C bis 26°C, durchgeführt. Es hat sich erfindungsgemäß ge- zeigt, dass die Enzymaktivität von Cytochrom P450 für die erfindungsgemäße Reaktion in diesem Bereich besonders hoch ist. [0052] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfah- ren bei einem pH Wert von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise von 7 bis 8, noch mehr bevorzugt von 7,2 bis 7,8, durchgeführt. Die Enzymaktivität von Cytochrom P450 ist bei diesem pH Wert am höchsten, um einen entsprechenden Umsatz des Sub- strats zu gewähren.

[0053] Die Hydroxylierung von Desoxysteroiden bzw. Desoxys- teroidderivaten kann regioselektiv an der Position 7 des Steroid-Grundgerüsts erfolgten. Dadurch kann insbesondere stereoselektiv eine 7betα-Hydroxylgruppe eingeführt wer- den, so dass z.B. Ursocholsäure und/oder Ursocholsäurede- rivate hergestellt werden können.

[0054] In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfin- dungsgemäße Verfahren in Anwesenheit von mindestens einem organischen Lösungsmittel durchgeführt. Bevorzugt wird ein einziges organisches Lösungsmittel verwendet, sodass ein Einphasensystem vorliegt. Es kann auch ein Gemisch von zwei oder mehreren organischen Lösungsmitteln einge- setzt werden, welche erfindungsgemäß miteinander mischbar sind, sodass ein Einphasensystem vorliegt. Das organische Lösungsmittel kann protisch oder aprotisch sein, wobei α- protische Lösungsmittel bevorzugt werden.

[0055] Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Anwe- senheit eines organischen Lösungsmittels, insbesondere eines aprotischen organischen Lösungsmittels den Umsatz des 7-Desoxysteroids der allgemeinen Formel (II) zum Ste- roid der allgemeinen Formel (I) gemäß dem erfindungsgemä- ßen Verfahren signifikant erhöhen kann. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Anwesenheit des orga- nischen Lösungsmittels erlaubt zudem überraschenderweise die Regenerierung des Redoxpartnersystems.

[0056] Als organische Lösungsmittel können beispielsweise Alkohole, Ether, Ester, Glycole, Ketone, Amide, Sul- foxide, organische Säuren, Cycloalkane, Aromaten und Chlorkohlenwasserstoffe verwendet werden. Beispiele für geeignete organische Lösungsmittel sind Methanol, Etha- nol, Isopropanol, 2-Butanol, 4-Methyl-2-pentanol (Methyl- Isobutyl-Alkohol, MIBA), Diethylether (Et ₂ 0), Diisopropy- lether (iPr ₂ O), Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), 2-Methyl- tetrahydrofuran (Me-THF), Ethylacetat, Ethylenglycol, Me- thylisobutylketon (MIBK), 2-Butanon, Aceton, Dimethylsul- foxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid (DMA), Cyclohexan, Toluol, Trichlormethan (CHCI ₃ ), Dich- lormethan (CH2CI ₂ ), Hexan oder Gemische davon. Geeignete Gemische sind beispielsweise Gemische aus Hexan und Ethylacetat oder Isopropanol, sowie Gemische aus Trich- lormethan und Phenol. Die gegenständliche Erfindung ist nicht auf die obige exemplarische Liste von Lösungsmit- teln beschränkt.

[0057] Das organische Lösungsmittel ist bevorzugt ein apro- tisches organsiches Lösungsmittel, besonders bevorzugt ein Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO) und Dime- thylacetamid (DMA).

[0058] Die Menge des organischen Lösungsmittels wird erfin- dungsgemäß derart gewählt, dass die Verbindung der allge- meinen Formel (II) vollständig gelöst wird und die Enzym- aktivität erhalten bleibt. Vorzugsweise wird die Verbin- dung der Formel (II), beispielsweise Lithocholsäure, in dem organischen Lösungsmittel bis zur Löslichkeitsgrenze gelöst. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Substrat des Enzyms im organischen Lösungsmittel vorge- legt.

[0059] Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Isolierung des Produkts auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen. Beispielsweise kann das Produkt durch ein geeignetes organisches Lösungsmittel aus der Reakti- onsmischung extrahiert werden. Je nach Substrat sind sol- che Lösungsmittel in der Literatur beschrieben. Cholsäu- ren und deren Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung können aus Reaktionsmischungen zum Beispiel mit Ethyl- acetat isoliert werden, ggf. nach Ansäuern der Reaktions- mischung, z.B. mit HCl. Einen speziellen Fall stellt ein Verfahren dar, bei dem Gallensäuren in Form eines Salzes, z.B. eines Natriumsalzes in wässriger Lösung vorliegen. In diesem Fall kann eine Fällung des Produkts durch An- säuern der Reaktionsmischung erfolgen. Dazu kann der Re- aktionsmischung, z.B. HCl oder verdünnte HCl in ausrei- chender Menge zugesetzt werden. Wird dabei ein pH-Wert von zum Beispiel 1 bis 4, vorzugsweise von 2 bis 3 er- reicht, liegt das Produkt überwiegend in Form einer Sus- pension vor. Das Produkt kann dann durch gängige Metho- den, wie z.B. Filtration oder Zentrifugation aus der Re- aktionsmischung entfernt werden. Eine weitere Alterna- tive, die beispielsweise zur Produktisolierung verwendet werden kann sind chromatographische Methoden, wie z.B. Affinitätschromatographie oder Ionenaustauscher-Chromato- graphie. Weiterhin ist beispielsweise die Gewinnung von Produkt durch die Verdampfung des Reaktions-Lösungsmit- tels möglich.

[0060] Alternativ kann bei einem Verfahren gemäß der vorlie- genden Erfindung das/die Produkt(e) nach der Reaktion auch in der Reaktionsmischung verbleiben, z.B. um noch weitere Reaktionen durchzuführen und ggf. nach Anschluss dieser Reaktionen ein Endprodukt zu isolieren. Ebenso ist es denkbar, dass das Substrat/die Substrate für das Ver- fahren gemäß vorliegender Erfindung durch vorangegangene oder parallel ablaufende Reaktionen im selben Reaktions- ansatz erzeugt werden.

[0061] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be- trifft ein Nukleinsäurekonstrukt umfassend ein Nuklein- säuremolekül kodierend für ein Cytochrom P450-Enzym wie oben definiert an dessen 3'-Ende und/oder 5'-Ende direkt oder über einen Spacer mindestens ein Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Ferredoxin, einer Ferredoxin-Reduk- tase und einer Oxidoreduktase gebunden ist.

[0062] Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte sind be- sonders geeignet zur Herstellung eines Steroids wie ein- gangs definiert. Durch die Expression des Cytochrom P450- Enzyms und mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ferredoxinen, Ferredoxin-Reduktasen und Oxidoreduktasen ausgehend von einem Nukleinsäurekon- strukt wird es ermöglicht, diese Enzyme bzw. Proteine in einer Menge zu produzieren, die für eine effiziente Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren nötig sind. Insbesondere von Vorteil ist es, wenn sämtliche dieser Proteine unter der Kontrolle desselben Promoters am er- findungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt exprimiert werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Vektor um- fassend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung .

[0063] Das Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Cytochrom P450-Enzym kann entweder direkt oder über einen Spacer bzw. eine Spacer-Sequenz an weitere Nukleinsäuremoleküle gebunden sein, die für Enzyme bzw. Proteine kodieren, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können. Der Vorteil eines derartigen Konstrukts liegt darin, dass ein solches Konstrukt es ermöglicht, die im erfindungsge- mäßen Verfahren eingesetzten Enzyme und Proteine, insbe- sondere Cytochrom P450 und Ferredoxin und/oder Ferredo- xin-Reduktase, in einer vergleichbaren Menge zu exprimie- ren.

[0064] „Spacer" bzw. „Spacer-Sequenz", wie hier verwendet, ist eine Nukleinsäuresequenz die weder ein Stop-Codon noch ein sonstiges funktionelles Motiv aufweist. Ein Spa- cer bzw. eine Spacer-Sequenz dient als Abstandshalter zwischen zwei ORF, um gegebenenfalls die Transkription dieser ORFs zu verbessern.

[0065] Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorlie- genden Erfindung ist das Cytochrom P450 Enzym durch eine Nukleinsäure kodiert, welche mindestens 90%, insbesondere 100%, ident ist mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 6.

[0066] Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Ferredoxin die Amino- säuresequenz SEQ ID Nr. 7.

[0067] Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Ferredoxin-Reduktase eine Adrenodoxin-Reduktase, vorzugsweise eine Putidaredoxin- Reduktase.

[0068] Die Ferredoxin-Reduktase umfasst vorzugsweise die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 8.

[0069] Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung be- trifft einen Vektor umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung.

[0070] Der erfindungsgemäße Vektor kann ein Klonierungs- o- der Expressionsvektor sein und je nach Organismus, in dem dieser eingebracht wird, entsprechende Abschnitte aufwei- sen, um beispielsweise die Transkription eines ORFs zu ermöglichen .

[0071] Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Wirtszelle umfassend ein Nukleinsäurekon- strukt gemäß der vorliegenden Erfindung.

[0072] Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann zur Klonierung oder zur Expression der rekombinant eingebrachten auf ei- nem Nukleinsäurekonstrukt befindlichen ORFs verwendet werden.

[0073] Das Lysat einer solchen Wirtszelle, sofern diese min- destens eines der im erfindungsgemäßen Verfahren benötig- ten Enzyme bzw. Proteine intrα- oder extrazellulär expri- miert hat, kann im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Das 7-Desoxy-Steroid oder ein Derivat davon mit der allgemeinen Formel (II) wird dabei vorzugsweise mit einer Zellsuspension oder Zellen in einem Kulturüberstand und/oder einem Lysat einer Wirtszelle gemäß der vorlie- genden Erfindung in Kontakt gebracht wird. Somit wird ge- mäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung 7-Desoxy-Steroid oder ein Derivat davon mit der allgemeinen Formel (II) mit mindestens einem Kulturüber- stand und/oder einem Lysat mindestens einer Wirtszelle, welche in der Lage ist, mindestens ein Ferredoxin, min- destens eine Ferredoxin-Reduktase und/oder mindestens eine Oxidoreduktase zu exprimieren, in Kontakt gebracht.

BEISPIELE [0074] Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele eingehender dargelegt, ohne jedoch darauf be- schränkt zu sein.

[0075] Beispiel 1: Test von Bakterienstämmen

[0076] Die folgenden bakteriellen Stämme wurden bei der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkul- turen (DSMZ) bezogen: Saccharothrix longispora (DSM- 43749), Catellatospora citrae (DSM-44097), Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (DSM-40578) und Asanoa ferruginea (DSM-44099). Die Stämme wurden unter Standard- bedingungen kultiviert, wie von DSMZ empfohlen. Sobald das Wachstum der Kulturen zu einer sichtbaren Trübung ge- führt hatte, wurde Desoxycholsäure (0,5 mM) zugegeben und für bis zu 72 h weiter kultiviert. Überstände der Kultu- ren wurden nach einem Zentrifugationsschritt mit Ethyl- acetat extrahiert und mittels HPLC und GC/MS analysiert. Im HPLC-Chromatogramm der Reaktion mit Streptomyces hyg- roscopicus wurde ein Peak registriert, dessen Retentions- zeit mit der von Ursocholsäure übereinstimmt. Die GC/MS- Analyse ergab einen Hinweis darauf, dass der potentielle Ursocholsäure-Peak von einer Gallensäure mit 3 Hydro- xylgruppen stammt. Die Untersuchung der anderen Stämme ergab keinen Hinweis auf 7-hydroxylierte Produkte von Desoxycholsäure .

[0077] Beispiel 2: Genomsequenzierung und Annotierung der P450-Gene

[0078] Nach Kultivierung von Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (DSM-40578) entsprechend der Vor- schrift von DSMZ wurde die genomische DNA des Stamms iso- liert (Kieser et al. (2000), Practical Streptomyces ge- netics (Norwich: John Innes Foundation)). Das Genom wurde mittels Illumina MiSeq sequenziert und ein Assembly ba- sierend auf dem bekannten Genom von Streptomyces ra- pamycinicus durchgeführt (Microsynth GmbH, Switzerland). Durch Homologie-Vergleiche konnten 42 P450-Gene identifi- ziert werden.

[0079] Beispiel 3: Klonierung Expressions-System [0080] Unter Verwendung des Restriktionsenzyms Xhol wurde folgendes Konstrukt umfassend kodierende Regionen für Putidaredoxin-Reduktase (PtR) und Putidaredoxin (Ptx) in das Plasmid pJ411 (DNA 2.0) kloniert.

[0081] Synthetische DNA (Life Technologies): 5', Xhol- Schnittstelle, Hindlll-Schnittstelle, ca. 50 bp spacer- DNA, ribosome binding site (rbs), ORF (open reading frame; offener Leserahmen) Putidaredoxin-Reduktase (PtR), ca. 50 bp spacer-DNA, rbs, ORF Putidaredoxin (Ptx), Xhol- Schnittstelle, 3'.

[0082] Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung überprüft.

[0083] Anschließend wurde unter Verwendung der Restriktions- enzyme Ndel und Hindill jeweils ein ORF kodierend für die P450-Enzyme, die in Beispiel 2 identifiziert wurden, in die oben erwähnte synthetische DNA bzw. Plasmid (Life Technologies) kloniert. Das Ergebnis wurde wieder mit Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung verifi- ziert. Der in diesem Beispiel verwendete Expressionsvek- tor sowie die verwendeten Redoxpartner stellen nur eine beispielhaft ausgewählte Möglichkeit dar, die erfindungs- gemäßen Cytochrom P450 Enzyme zu exprimieren.

[0084] Die mit den identifizierten P450-Kandidaten (s. Bei- spiel 2) hergestellten Expressionsplasmide, können zur gemeinsamen Expression der jeweiligen P450 Proteine ge- meinsam mit Putidaredoxin-Reduktase und Putidaredoxin verwendet werden. Die 3 ORFs der jeweiligen Expressions- plasmide werden unter Kontrolle eines T7-Promotors auf einer gemeinsamen mRNA aber als getrennte Polypeptide ex- primiert .

[0085] Beispiel 4: Expression P450/Ptx/PtR

[0086] Nach der Genom-Sequenzierung von Streptomyces hyg- roscopicus subsp. hygroscopicus lagen 42 P450-Sequenzen vor, die als Kandidaten für eine mögliche Desoxychol- säure-7-Hydroxylase in Frage kamen. Zur Identifizierung des gesuchten Enzyms wurden ORFs der Kandidaten in das in Beispiel 3 beschriebene Expressions-System und in einen pJ411 (DNA 2.0) Expressionsvektor ohne kodierende Regio- nen für Putidaredoxin-Reduktase (PtR) und Putidaredoxin (Ptx) kloniert. Zur Expression wurde folgendes Protokoll verwendet .

TB-P450-Expressionsmedium:

Terrific broth (TB) Medium + 50 μg/ml Kanamycin

+ 0.5 mM 5-Aminolävulinsäure (von 100x Stammlösung)

+ 1 mM Thiamin (von 100x Stammlösung)

+ 1 mM MgCl2 + 2.5 mM Ammoniumsulfat + 50 mM FeCl3 (von 100x Stammlösung)

+ 0.5 mM IPTG (von 1 M Stammlösung)

(die Zusätze wurden jeweils 0.2 μm sterilfiltriert)

P450 Lysepuffer:

100 mM Tris pH 7,5 20 % (v/v) Glycerin

1 mg/ml Lysozym

[0087] Die zu testenden Konstrukte der P450-Kandidaten wur- den in den E. coli Expressionsstamm BL21 (DE3) transfor- miert. Von Einzelkolonien wurden Übernachtkulturen ange- impft (LB (lysogeny broth) + Kanamycin). Am nächsten Tag wurden damit 1:100 Expressionskulturen angeimpft (150 ml TB (terrific broth)-P450-Expressionsmedium) und in Schi- kanenkolben (1 L) zunächst bei 37°C für 3 h geschüttelt. Anschließend wurde die Temperatur auf 24°C gesenkt und 22 h weitergeschüttelt. Die Kulturen wurden durch Zentrifu- gation bei 5000 g für 10 min geerntet, lx mit 0.9 % (w/v) NaCl gewaschen und Pellets bei -80°C eingefroren. Die Zellpellets wurden aufgetaut, gewogen und mit einer äqui- valenten Menge P450-Lysepuffer resuspendiert, 1 h auf Eis inkubiert und anschließend mittels Sonifier aufgeschlos- sen. Nach Zentrifugation (30 min, 21000 g) wurden die Überstände für Test-Reaktionen verwendet. [0088] Beispiel 5: Test von P450-Kandidaten auf DA-Hydroxy- lierung

[0089] Reaktions-Mischung:

10-80 mΐ 100 mM NADH (Redoxcofaktor)

250 mΐ 1 M Tris-HCl pH 7,5 17,5 mΐ Glycerin (50%)

100 mΐ 50 mM Desoxycholsäure-Lösung pH 8,5 (final 10 mM)

50 mΐ E. coli Lysat P450/PtR/Ptx (s. Beispiel 4) 17,5-87,5 mΐ dH ₂ O

[0090] Die Reaktionen wurden in 1,5 ml Schraubflaschen ange- setzt und mit Deckel mit Alufolie verschlossen. Die Folie wurde an mehreren Stellen eingestochen. Es wurde für 18 h bei 24°C leicht geschüttelt. 200 mΐ des Reaktionsansatzes wurden mit 600 mΐ Acetonitril / 5 mΐ H ₃ PO ₄ (50%) verdünnt und 15 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 20817 rcf zentrifugiert und mit- tels HPLC/DAD analysiert (z.B. Agilent 1200 Series;

Säule: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm, 5 pm; Flussrate: 1,5 ml/min, Gradient H2O+H3PO4 (pH=2.6) / Ace- tonitril) . Einer der untersuchten Kandidaten („P450_c866") war in der Lage, Desoxycholsäure zu Ur- socholsäure zu hydroxylieren. Dabei wurde die eingesetzte Desoxycholsäure umgesetzt (s. folgende Tabelle). Die Identität des Produkts Ursocholsäure wurde durch GC/MS- Analyse sowie durch 2D-NMR verifiziert.

[0091] In diesem Beispiel wird ein Redoxcofaktor (NADH) durch die P450/Ptx/PtR Reaktion oxidiert. [0092] Beispiel 6: Test von P450-Kandidaten auf DA-Hydroxy- lierung mit Cofaktor-Recycling Arabinose-Dehydrogenase

[0093] Reaktions-Mischung:

65 mΐ 100 mM NADH (final 0.5 mM)

1 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5 + 20 % (v/v) Glycerin

130 mΐ 50 mM Desoxycholsäure-Lösung pH 8.5 (final 0.5 mM)

6.5 mΐ Chloramphenicol-Lösung (final 20 pg/ml)

100 mΐ L-Arabinose-Dehydrogenase

(aus Burkholderia vietnamiensis, rekombinant in E. coli exprimiert, 400 U/ml)

98 mg L-Arabinose (final 50 mM)

2.0 ml E. coli Lysat P450/PtR/Ptx (s. Beispiel 4)

9.6 ml dH20

[0094] Die Reaktionen wurden in 50 ml Erlenmeyerkolben ohne Schikane angesetzt und mit Alufolie verschlossen. Die Fo- lie wurde an mehreren Stellen eingestochen. Es wurde für 16 h bei 24°C leicht geschüttelt. Die im Überstand vor- handenen Substanzen wurden mit Ethylacetat extrahiert und eingedampft. Es wurde in einem geringeren Volumen HPLC- Laufmittel gelöst (Methanol/Acetonitril/H20+H3P04 (pH=3.0); 40:30:33). Anschließend wurden die Proben mit- tels HPLC/RID analysiert (z.B. Agilent 1200 Series;

Säule: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184.6 x 150 mm, 5 pm; Flussrate: 0.8 ml/min). Einer der untersuchten Kandidaten („P450_c866") war in der Lage, Desoxycholsäure zu Ur- socholsäure zu hydroxylieren. Dabei wurde die eingesetzte Desoxycholsäure nahezu vollständig umgesetzt (>95 %). Die Identität des Produkts Ursocholsäure wurde durch GC/MS- Analyse sowie durch 2D-NMR verifiziert (Daten nicht ge- zeigt) .

[0095] In diesem Beispiel wird ein Redoxcofaktor (NADH) durch die P450/Ptx/PtR Reaktion oxidiert. Durch die Cofaktor-Regenerierung (hier beispielhaft mittels der Zu- cker-Dehydrogenase Arabinose-Dehydrogenase) wird der Re- doxcofaktor wieder zu seinem ursprünglichen Zustand redu- ziert (wobei hier Arabinose zu Arabinolacton/Arabonsäure oxidiert wird). Dadurch wird der Einsatz substöchiometri- scher Menge von Redoxcofaktor ermöglicht.

[0096] Beispiel 7: Beispiele: Umsatz abhängig vom Cofaktor- konzentration Umsatz mit Cofaktorrecycling

[0097] Reaktions-Mischung:

10 mΐ 10 mM NAD+

250 mΐ 100 mM TEA pH 8,2 25 mΐ Glycerin (50%)

100 mΐ 50 mM Desoxycholsäure-Lösung pH 8.0 (final 10 mM)

6,75 mg Zellen (wW) als 22,5 % Suspension in 100 mM TEA pH 8.0 und 25 % Glycerin 5 mΐ Katalase (bovine, Sigma 4 mg/ml)

1,7 Einheiten Xylitol/Sorbitol Dehydrogenase 25 mΐ 2M Sorbitol (final 100 mM)

70,8 mΐ dH ₂ 0

[0098] Die Reaktionen wurden in 1,5 ml Schraubflaschen ange- setzt und mit Deckel mit Alufolie verschlossen. Die Folie wurde an mehreren Stellen eingestochen. Es wurde für 18 h bei 24°C leicht geschüttelt.

[0099] Die Rückgewinnung von NADH erfolgte durch Sorbitol-, bzw. Xylitol Dehydrogenase in Gegenwart von Sorbitol und NAD ⁺ .

[0100] 200 mΐ des Reaktionsansatzes wurden mit 600 mΐ Aceto- nitril / 5 mΐ H3PO4 (50%) verdünnt und 15 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 20817 rcf zentrifugiert und mittels HPLC/DAD analy- siert (z.B. Agilent 1200 Series; Säule: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm oder Agilent Zorbax XDB-C8 mm 150 x 4,6 mm, 3,5 pm, 5 pm; Flussrate: 1,5 ml/min, Gradient H2O+H3PO4 (pH=2.6) / Acetonitril).

[0101] Unter den oben genannten Bedingungen wurde die einge- setzte Desoxycholsäure quantitativ (100% Umsatz) zu Ur- socholsäure umgesetzt. Die Identität des Produkts Ur- socholsäure wurde durch GC/MS-Analyse sowie durch 2D-NMR verifiziert .

[0102] In diesem Beispiel wird ein durch das Cofaktorrecyc- lingsystem Sorbitol/Xylitol Dehydrogenase/Sorbitol/NAD ⁺ gewonnener Redoxcofaktor (NADH) für die Hydroxylierungs- reaktion verwendet. Es können jedoch auch andere Systeme zum Cofaktorrecycling verwendet werden (siehe folgende Tabelle) .

[1] Eingesetzt als 20% Cholsäure Lösung

[2] Eingesetzt als Gallensäuren Lösung (237 mM Cholsäure; 45 mM Desoxycholsäure)

[0103] Beispiel 8: (Quantitativer LCA (Llthocholsäure) Umsatz

[0104] Reaktions-Mischung:

10 mΐ 10 mM NAD+

250 mΐ 100 mM TEA pH 8,2 10 mM (final)L _l thocholsäure

9,2 mg Zellen (wW) als 22,5 % Suspension in 100 mM TEA pH 8.0 und 25 % Glycerin 5 mΐ Katalase (bovine, Sigma 4 mg/ml)

1,7 Units Xylitol/Sorbitol Dehydrogenase 25 mΐ 2M Sorbitol (final 100 mM)

176 mΐ dHzO

[0105] Die Reaktionen wurden in 1,5 ml Schraubflaschen ange- setzt und mit Deckel mit Alufolie verschlossen. Die Folie wurde an mehreren Stellen eingestochen. Es wurde für 18 h bei 24°C leicht geschüttelt. [0106] Die Rückgewinnung von NADH erfolgte durch die Sor- bitol-, bzw. Xylitol Dehydrogenase in Gegenwart von Sor- bitol und NAD ⁺ .

[0107] 200 mΐ des Reaktionsansatzes wurden mit 600 mΐ Aceto- nitril / 5 mΐ H3PO4 (50%) verdünnt und 15 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 20817 rcf zentrifugiert und mittels HPLC/DAD analy- siert (z.B. Agilent 1200 Series; Säule: Merck Purospher STAR RP-18e 125 x 4 mm oder Agilent Zorbax XDB-C8 mm 150 x 4,6 mm, 3,5 gm, 5 gm; Flussrate: 1,5 ml/min, Gradient H2O+H3PO4 (pH=2.6) / Acetonitril).

[0108] Unter den oben genannten Bedingungen wurde nach dem Umsatz ausschließlich Ursodeoxycholsäure detektiert.

[0109] Beispiel 9: Umsatz von LCA (Lithocholsäure) zu Ur sodeoxycholsäure in Anwesenheit von organischen Lösungs mitteln

[0110] Zunächst wurden die Löslichkeitsgrenzen von LCA und UDCA in verschiedenen organischen Lösungsmitteln be- stimmt. Dazu wurden 10 mg bzw. 100 mg LCA oder UDCA in einem 15 mL Kolben vorgelegt. Das organische Lösungsmit- tel wurde in Schritten von 100 μL zugegeben und das Ge- misch wurde mittels Schütteln in einem Vortex-Schüttler und gegebenenfalls in einem Ultraschallbad behandelt. Es wurde optisch beurteilt, ob eine klare Lösung vorliegt.

[0111] Folgende Tabelle fasst die bestimmten Löslichkeits- grenzen für die analysierten Lösungsmittel zusammen:

[0112] Der Umsatz von LCA zu UDCA in Anwesenheit der Lö- sungsmittel wurde bestimmt, wie in folgenden Tabellen an- gegeben:

[0113] Beispiel 10: Umsatz von Lithocholsäure zu Ursodeoxy- cholsäure mit erhöhter Substratkonzentration ln Anwesen heit eines aprotischen Lösungsmittels

[0114] Reaktions-Mischung:

10 mΐ 10 mM NAD+

250 mΐ 200 mM TEA pH 8,4 mit 10,8 % Glycerin 25 μL 500 mM Lithocholsäure in DMF

30 mg Zellen (wW) als 30 % Suspension in 100 mM TEA pH 9.0

5 mΐ Katalase (bovine, Sigma 4 mg/ml)

1,7 Units Xylitol/Sorbitol Dehydrogenase 25 mΐ 2M Sorbitol (final 100 mM)

73 mΐ dH ₂ 0 [0115] Die Reaktionen wurden in 1,5 ml Schraubflaschen ange- setzt und mit Deckel mit Alufolie verschlossen. Die Folie wurde an mehreren Stellen eingestochen. Es wurde für 18 h bei 24°C leicht geschüttelt.

[0116] Die Rückgewinnung von NADH erfolgte durch die Sor- bitol-, bzw. Xylitol Dehydrogenase in Gegenwart von Sor- bitol und NAD ⁺ .

[0117] Der Reaktionsansatz wurde im Luftstrom vollständig abgedampft und mit 1,1 ml IPA + 0,5% TFA wieder gelöst. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten bei 20817 rcf zentrifugiert und der Überstand mittels HPLC/RID analy- siert (z.B. Agilent 1200 Series; Säule: Phenomenex Luna® Silica 100 Ä, 250 x 4,6 mm, 5 gm; Flussrate: 1,0 ml/min, n-Hexan/IPA 4:1 + 0,05% TFA isokratisch).

[0118] Unter den oben genannten Bedingungen wurde nach dem Umsatz 70% Ursodeoxycholsäure detektiert.