DOMAINE DE L'INVENTION

L'invention concerne un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant par utilisation de microorganismes spécifiques, dits nageurs, permettant du fait de leurs déplacements dans le biofilm, de créer des canaux et des trous à travers et dans les différentes couches du biofilm. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet une destruction tant mécanique que biologique du biofilm, les microorganismes nageurs pouvant être associés pour cela à un agent antimicrobien.

L'invention trouve des applications dans tous les domaines où la présence de microorganismes doit être supprimée, que ce soit dans le domaine agro-alimentaire, le domaine médical, le domaine industriel etc.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les microorganismes, tels que les bactéries, les levures, les champignons, les microalgues etc. s'organisent le plus souvent en biofilms lorsqu'ils colonisent une surface, notamment inerte (acier inoxydable, verre etc.).

Dans un biofilm, les microorganismes sont organisés en couches successives formant un édifice tridimensionnel. Les microorganismes y sont liés entre eux et à la surface colonisée. Les microorganismes baignent dans une matrice extracellulaire, synthétisée au moins en partie par ces mêmes microorganismes.

Les microorganismes d'un biofilm présentent des résistances accrues aux traitements antimicrobiens. Cela s'explique notamment par l'organisation même du biofilm en couches superposées, rendant les couches les plus profondes difficilement accessibles aux agents antimicrobiens. De même, la matrice extracellulaire tend à bloquer la pénétration des agents antimicrobiens dans l'épaisseur du biofilm. Par ailleurs, on a découvert que des gradients de pH, d'oxygène, nutritionnel etc. se créent dans l'épaisseur du biofilm. Aussi, on observe que dans certaines couches du biofilm, les microorganismes sont dans un état de sénescence, augmentant ainsi le phénomène de résistance aux antimicrobiens. Les biofilms étant susceptibles de coloniser toutes les surfaces, ils peuvent être à l'origine de nombreuses intoxications alimentaires, maladies nosocomiales etc.

C'est pourquoi on cherche à empêcher leur formation ou à les éradiquer, que se soit par des méthodes physiques, chimiques ou biologiques.

Ainsi, par exemple, on sait déstabiliser et éliminer au moins partiellement des biofilms par des traitements chimiques (détergents et/ou désinfectants). Bien entendu, l'utilisation de ces composés chimiques peut être incompatible avec certaines applications, notamment du fait de la nature des milieux colonisés. De plus, ces agents ne permettent pas toujours de supprimer les biofilms dans toute leur épaisseur et de nombreux biofilms présentent une forte résistance à leur action.

Dans certains cas, des procédés physiques tels que la température, les ultrasons, les plasmas gazeux, la lumière puisée ou la thérapie photodynamique etc. peuvent être utilisés mais leur mise en œuvre industrielle n'est pas toujours possible.

Pour certaines applications, il est connu d'utiliser des bactériophages à même d'éradiquer certains microorganismes du biofilm. Cependant, leur spectre étroit de spécificité, la présence de la matrice extracellulaire, l'organisation en couches successives et le phénomène de sénescence observé dans certaines couches favorisent la persistance au moins partielle des biofilms.

Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveaux moyens d'éradiquer les biofilms de microorganismes, de manière fiable.

EXPOSE DE L'INVENTION

L'observation et l'analyse de différents biofilms de microorganismes ont permis aux inventeurs de découvrir au sein d'un biofilm déjà établi de Bacillus thuhngiensis sur une surface inerte, l'existence d'une sous- population de microorganismes appelés par la suite « microorganismes nageurs », en ce sens que ces microorganismes dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont capables de se déplacer dans le plan du biofilm et dans son épaisseur, alors même que le biofilm est déjà créé. En se déplaçant, ces microorganismes nageurs créent localement et temporairement des trous et des canaux à travers les différentes couches du biofilm. Il semblerait que ces trous et canaux permettent le transfert de microorganismes d'une couche à une autre au sein du biofilm, l'irrigation et l'oxygénation du biofilm, etc. Ainsi, certaines souches de microorganismes ont une capacité de nage quand elles sont en solution, qu'elles conservent partiellement lorsqu'elles sont organisées en biofilm. Par ailleurs, ces souches présentent le plus souvent, lorsqu'elles sont en solution, une capacité de nage bien supérieure à la capacité de nage habituellement observée chez les microorganismes.

Les inventeurs ont ainsi eu l'idée avantageuse de tirer profit de ce phénomène de nage pour éliminer des biofilms préexistants de microorganismes, quels qu'ils soient.

L'invention a donc pour objet un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes déjà créé sur une surface inerte, caractérisé en ce que :

- on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins une population de microorganismes dits « nageurs >> dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et

- on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. L'étape de traitement du biofilm par le produit antimicrobien peut être simultanée ou ultérieure à l'étape de traitement dudit biofilm par le cocktail de microorganismes contenant les microorganismes nageurs.

Par biofilm de microorganismes déjà créé, ou préexistant, on entend un ensemble de microorganismes, hétérogènes ou homogènes, organisés en plusieurs couches successives, liés entre eux et/ou à la surface colonisée, et entourés d'une matrice extracellulaire. Le biofilm à éliminer peut aussi bien être un biofilm composé uniquement de bactéries, ou de champignons, ou de levures, ou de protozoaires etc., ces microorganismes pouvant par ailleurs être d'une même espèce ou de différentes espèces, qu'un biofilm composé d'au moins deux microorganismes de natures différentes.

Par surface inerte, on entend notamment les surfaces en acier inoxydable, verre, polymères, bois, carrelage etc., et plus généralement toute surface autre qu'une surface biologique, du corps humain, animal ou végétal. Ainsi, le procédé selon l'invention peut être utilisé tout le long de la chaîne de fabrication d'aliments (élevage et transformation), notamment pour le traitement des surfaces avec lesquelles lesdits aliments sont susceptibles d'être en contact, afin d'éliminer tout risque d'intoxication alimentaire. De même, le procédé selon l'invention permet d'éliminer des biofilms présents sur des dispositifs médicaux afin de limiter les risques d'infection nosocomiale suite à leur utilisation.

L'étape de soumission du biofilm au cocktail de microorganismes consiste par exemple à mettre en contact ledit biofilm avec ledit cocktail. Par exemple, on dépose la quantité souhaitée de cocktail de microorganismes sur la surface inerte à traiter. Le cocktail de microorganismes est de préférence un cocktail de bactéries.

Par microorganismes nageurs, on entend des microorganismes mobiles, maintenus en suspension dans le cocktail, dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont capables de se déplacer tant dans le plan dudit biofilm que dans toute son épaisseur, c'est-à-dire de traverser toutes les couches successives dudit biofilm, et ce malgré la forte cohésion des microorganismes entre eux et la présence de la matrice extracellulaire, dont la viscosité tend à immobiliser les microorganismes.

L'énergie cinétique que doit au moins présenter le microorganisme pour être capable de se déplacer dans un biofilm dans toutes les directions dépend des caractéristiques particulières de ce biofilm. Pour chaque biofilm de caractéristiques données, les microorganismes présentant une capacité de nage au sens de la présente invention, c'est-à-dire aptes à se déplacer dans le plan et dans l'épaisseur, dans ledit biofilm, peuvent être identifiés de manière expérimentale. Ceci peut notamment être réalisé par des observations au microscope confocal des déplacements éventuels de différents microorganismes mis en contact avec le biofilm, et la sélection des souches pour lesquelles on observe la formation de trous et de canaux dans les couches du biofilm, témoignant d'une capacité de nage du microorganisme dans ce dernier.

Pour la plupart des biofilms de microorganismes couramment rencontrés, des microorganismes présentant un disque de mobilité après 24h d'incubation à 37°C de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar à 0.25 % tel que décrit par la suite, possèdent une énergie cinétique suffisante pour présenter une capacité de nage, au sens de la présente invention, dans le biofilm. De tels microorganismes présentent en général une vitesse de déplacement en milieu de culture au moins égale à 10 μιη/s.

Préférentiellement, les microorganismes nageurs sont des bactéries nageuses.

L'utilisation de microorganismes nageurs, capables non seulement de se déplacer au sein d'une même couche, mais également de traverser de part en part toutes les couches du biofilm à éliminer, c'est-à-dire toute l'épaisseur dudit biofilm, permet de déstabiliser et de fluidifier la structure tridimensionnelle dudit biofilm.

Préférentiellement, on soumet le biofilm à éliminer au cocktail de microorganismes nageurs pendant un temps compris entre 30 minutes et 10 heures. Lorsque le cocktail de microorganismes est retiré de la surface inerte, un nombre important de microorganismes nageurs reste à l'intérieur du biofilm dans lequel ils se sont infiltrés, et continue de le déstabiliser.

Le cocktail de microorganismes utilisé peut en outre comporter au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ledit produit antimicrobien peut s'immiscer dans l'ensemble du biofilm, et atteindre toutes les couches, même les plus profondes et normalement inaccessibles. Le composé antimicrobien agissant sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm, il est ainsi possible de l'éliminer dans son intégralité.

Autrement, le biofilm peut être traité à l'aide d'un produit antimicrobien, une fois le cocktail de microorganismes nageurs retiré. Ledit composé antimicrobien est par exemple déposé sur la surface inerte préalablement traitée par le cocktail de microorganismes. Le composé antimicrobien peut ainsi s'infiltrer dans l'ensemble des couches du biofilm et agir sur chacune d'elles.

L'action du composé antimicrobien contre ne serait-ce qu'une seule sorte de microorganismes, dans le cas d'un biofilm composé de différents microorganismes, permet de déstabiliser le biofilm dans toute son épaisseur, et de conduire à son élimination.

Selon un exemple de mise en œuvre de l'invention, on prévoit d'utiliser des microorganismes nageurs aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ainsi, on utilise dans le cocktail de microorganismes des souches dites nageuses aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien.

Alors, le composé antimicrobien synthétisé est libéré localement au sein du biofilm, au niveau de toutes les couches du biofilm. Même les couches les plus profondes peuvent être atteintes, alors qu'elles sont autrement inaccessibles aux composés antimicrobiens. Le composé antimicrobien agit ainsi sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm.

Bien entendu, il est possible d'utiliser un microorganisme nageur synthétisant plusieurs composés antimicrobiens différents, et/ou plusieurs sortes de microorganismes nageurs synthétisant des composés antimicrobiens différents. Il est aisément possible d'adapter le panel de microorganismes nageurs et de composés antimicrobiens produits, en fonction des microorganismes à éliminer.

De tels microorganismes peuvent être des microorganismes synthétisant naturellement un produit antimicrobien dirigé contre tout ou partie des microorganismes ciblés. Autrement, ces microorganismes peuvent être des microorganismes recombinants, dans lesquelles un gène d'intérêt, codant le composé antimicrobien souhaité, est intégré.

De plus, il est possible d'associer aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, des microorganismes dits « non nageurs », par exemple des bactéries dites « non nageuses », ou tout autre microorganisme, aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre des souches dites non nageuses, aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien.

Les microorganismes non nageurs synthétisant le/les composé(s) antimicrobien(s) peuvent autrement être utilisés ultérieurement, c'est-à-dire après prétraitement de la surface inerte par le cocktail de microorganismes comportant des microorganismes nageurs. Par exemple, on soumet la surface inerte ainsi prétraitée, à un second cocktail de microorganismes comportant quant à lui des microorganismes non nageurs synthétisant les composés antimicrobiens. Le prétraitement s'entend de la mise en contact avec le cocktail de microorganismes nageurs, suivi après un temps choisi, du rinçage de la surface afin d'éliminer ledit cocktail de microorganismes nageurs.

Ainsi, selon des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à un second cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « non nageuses >> aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Par microorganismes non nageurs, on entend des microorganismes dont l'énergie cinétique n'est pas suffisante pour qu'ils soient aptes à se déplacer dans le plan et/ou dans l'épaisseur du biofilm de manière à y créer des trous et canaux.

Dans ce cas, les microorganismes nageurs peuvent avantageusement synthétiser un produit antimicrobien différent, mais peuvent également synthétiser le même produit antimicrobien, voire aucun produit antimicrobien.

Les microorganismes nageurs, produisant ou non eux-mêmes des composés antimicrobiens, créent des trous et des canaux dans le biofilm, favorisant la pénétration et la répartition des microorganismes non nageurs producteurs de composés antimicrobiens, dans tout le biofilm. On permet ainsi une action du ou des composé(s) antimicrobiens(s) dans toutes les couches du biofilm.

Par ailleurs, le cocktail de microorganismes peut comporter, en plus des microorganismes nageurs, un antimicrobien exogène, dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Tout antimicrobien, qui n'est pas nuisible aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, peut être utilisé.

La surface inerte peut autrement être traitée par l'antimicrobien, exogène, après prétraitement de ladite surface par le cocktail de microorganismes. Par exemple, on soumet la surface inerte prétraitée à une solution comportant l'antimicrobien désiré.

Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, on soumet ainsi le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes comportant des souches nageuses, à au moins un antimicrobien biologique ou chimique dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Avantageusement, les microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes utilisé sont choisis parmi les bactéries Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Serpens flexibilis. Les souches qui présentent un disque de mobilité de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar 0.25% décrit ci- dessous présentent une capacité de nage, au sens de la présente invention, dans la plupart des biofilms couramment rencontrés.

La concentration en microorganismes nageurs dans le cocktail de microorganismes utilisé est à ajuster en fonction des souches utilisées.

Dans des modes de mise en œuvre particulièrement préférés de l'invention, en termes d'efficacité d'élimination des biofilms de microorganismes préexistant sur une surface inerte, le cocktail de microorganismes comporte au moins une première souche de microorganismes nageurs de plus grande taille et de plus faible vitesse de déplacement dans le biofilm, et une deuxième souche de microorganismes nageurs de plus petite taille et de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm.

On entend par là que les microorganismes de la première souche présentent une taille plus importante, et une vitesse de déplacement dans le biofilm moins importante, que les microorganismes de la deuxième souche.

Il a été découvert par les présents inventeurs que la mise en œuvre combinée de deux souches de microorganismes nageurs présentant de telles différences de propriétés permettait d'obtenir un effet synergique pour l'élimination du biofilm, avec pour effet une élimination plus complète et plus rapide de celui-ci.

On ne préjugera pas ici des mécanismes sous-tendant un tel résultat avantageux. On peut cependant supposer que les microorganismes de plus grande taille créent de larges canaux dans le biofilm, ces larges canaux facilitant le déplacement dans le biofilm des microorganismes plus rapides, qui ont quant à eux pour effet d'accélérer et d'intensifier la déstabilisation mécanique du biofilm, et par conséquent de favoriser l'irrigation et la diffusion du produit antimicrobien dans tout le volume du biofilm.

Dans des modes de mise en œuvre avantageux de l'invention, le rapport de la taille des microorganismes nageurs de la première souche, sur la taille des microorganismes nageurs de la deuxième souche, est supérieur ou égal à 1 ,5. Il est préférentiellement environ égal à 2.

Le rapport de la vitesse de déplacement dans le biofilm des microorganismes nageurs de la deuxième souche, sur la vitesse de déplacement dans le biofilm des microorganismes nageurs de la première souche, est de préférence quant à lui supérieur ou égal à 1 ,5, et préférentiellement environ égal à 2.

Le choix de telles caractéristiques permet avantageusement d'obtenir une efficacité encore supérieure d'élimination du biofilm.

La première souche nageuse et la seconde souche nageuse peuvent appartenir à la même espèce, ou à des espèces différentes.

En particulier, dans des modes de mise en œuvre de l'invention, la première souche appartient à l'espèce Bacillus thuhngiensis et la deuxième souche appartient à l'espèce Bacillus licheniformis.

Le cocktail de microorganismes peut également comporter plus de deux souches nageuses, issues de la même espèce ou d'espèces différentes.

Dans d'autres modes de mise en œuvre de l'invention, la première souche de microorganismes nageurs et la deuxième souche de microorganismes nageurs sont mises en œuvre successivement, c'est-à-dire mises en contact avec le biofilm à éliminer l'une après l'autre, de préférence à quelques minutes d'intervalle. Ainsi, on soumet tout d'abord ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant une de ces souches nageuses, puis on soumet le biofilm à l'autre de ces souches nageuses. Dans un tel mode de mise en œuvre, il est tout à fait avantageux de mettre en œuvre la première souche, de plus grande taille, avant la deuxième souche, de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

Les figures 1 A et 1 B montrent des vues obtenues a l'aide d'un microscope laser confocale à balayage (MLCB) d'un biofilm de Bacillus thuhngiensis marqués génétiquement avec la protéine fluorescente GFP (protéine à fluorescence verte), sur lesquelles on peut voir des canaux (figure 1 A), et des trous (figures 1 B), formés dans le biofilm par des sous populations de Bacillus thuhngiensis nageuses au sein du biofilm ; Les figures 1 C et 1 D représentent chacune schématiquement la trajectoire effectuée en 80 secondes par une bactérie Bacillus thuringiensis nageuse, dans deux biofilms de Bacillus thuringiensis de 48 heures différents ;

Les figures 2A, 2B et 2C montrent le disque de mobilité de souches mobiles de Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B) et Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C) dans un test de mobilité en agar 0.25% et les figures 2D, 2E et 2F montrent le disque de mobilité de souches non mobiles de Bacillus subtilis 168 Ma pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 Ma (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (figure 2F) dans ce même test de mobilité.

Les figures 3A à 3E montrent des vues au microscope confocale d'un biofilm de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de bactéries nageuses, produisant ou non un produit antimicrobien ; ainsi la figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué génétiquement à la GFP seule ; la figure 3B montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ; la figure 3C montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a seulement ajouté le filtrat du cocktail de microorganismes contenant des bactéries de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3D montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries mobiles de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3E montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à ne pas être nageuses et à produire de la lysostaphine.

La figure 4 est un graphe présentant la quantification du biovolume en μιη ³ d'un biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en l'absence de cocktail de microorganismes nageurs (Biofilm cible St), en présence d'un cocktail de microorganismes nageurs Bacillus thuringiensis (Bt), d'un cocktail de microorganismes non nageurs Bacillus thuringiensis 407 Mla {Bt Mla), d'un cocktail de microorganismes nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (Bt Lys) et d'un cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuhngiensis 407 Ma pHT50 (Bt Mla Lys).

La figure 5 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuhngiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée ici dans la gamme de 0 à 0.5 μg/ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée dans la même gamme de 0 à 0.5 μg/ml) .

La figure 6 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 (utilisée ici dans une gamme de concentration de 6 à 8 unités logarithmiques par ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (utilisée ici dans la même gamme de concentration).

La figure 7 est un graphe présentant la réduction log d'un biofilm de Staphylococcus aureus non-traité, ou traité par une souche de bactéries non nageuses Bacillus thuringiensis 407 Mla (BiMIa, témoin négatif), ou par une souche de bactéries nageuses Bacillus thuringiensis 407 (Bt), ou par une souche de bactéries nageuses Bacillus licheniformis LMG7560 (Bl), ou par un mélange des deux souches nageuses Bt et Bl à des concentrations égales, ce prétraitement étant suivi d'un traitement par le biocide chlorure de benzalkonium à une concentration de 750 ppm.

EXPERIMENTATIONS

1- Test d'identification in vitro de microorqanismes nageurs Pour la plupart des biofilms, il est possible de déterminer si un microorganisme est un microorganisme nageur au sens de l'invention, par exemple via un test de mobilité microbienne en agar dont un exemple détaillé est décrit ci-dessous.

Le principe du test consiste à inoculer au centre d'une boite de Pétri remplie de gélose semi-liquide (agar 0.25%) une faible quantité de microorganismes (~10 ⁶ cellules) et de mesurer après une période d'incubation la taille du disque formé dans la boite de Pétri.

Matériel et méthode

Le test est ici présenté pour une série de Bacillus subtilis et Bacillus thuhngiensis et leurs mutants non mobiles (souches décrites dans le tableau I ci-dessous). La capacité de nage des souches est déterminée sur des boites de Pétri de diamètre 9 cm, remplies de milieu de culture Luria- Bertani (LB, Difco, référence 244620) supplémenté avec 0,25% d'agar.

Six souches différentes sont testées ici, trois souches de nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B), Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C), et trois souches non nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 Ma pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 Ma (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (figure 2F).

Les souches sont préalablement cultivées en milieu LB (sans addition d'agar) à 37 °C pendant 15h.

Un dépôt de 5μΙ de culture à environ 2.10 ⁸ UFC/ml est alors réalisé au centre de chaque boite de Pétri, soit environ 10 ⁶ UFC.

Les boites sont ensuite incubées 24h à 37°C, puis le diamètre du disque microbien obtenu est mesuré à l'aide d'un décimètre.

Résultats et interprétation

Les disques microbiens obtenus sont présentés aux figures 2A à 2F.

Dans ces conditions expérimentales et pour les microorganismes testés, un disque avec un diamètre supérieur à 30 mm indique une forte capacité de déplacement en milieu visqueux (un cercle de 30 mm est représenté en pointillés sur les figures).

Ainsi, on observe que la propagation du tapis microbien pour certaines souches est bien au moins égale à 30mm (figure 2A, 2B et 2C), tandis que pour d'autres souches la propagation du tapis microbien est très inférieure à 30mm (figures 2D, 2E et 2F) dans les conditions du test.

Le test est ici présenté pour des Bacillus, mais il peut aisément être adapté à d'autres microorganismes en jouant sur la nature du milieu de culture, la concentration en agar, le temps et la température d'incubation.

2- Identification de microorqanismes nageurs au sein d'un biofilm de Bacillus thuringiensis

Un biofilm Bacillus thuringiensis a été observé par microscopie confocale à balayage laser. Cette méthode permet de conserver l'intégrité du biofilm, et d'observer d'éventuels changements structuraux et physiologiques dans toutes les dimensions dudit biofilm.

Matériel et méthode

La souche utilisée pour ce protocole est Bacillus thuringiensis, naturellement dotée de capacité de nage et génétiquement marquée avec la GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescente. La souche est stockée en cryotubes à -80 °C dans du glycérol 20%. Après deux précultures, la souche est ensemencée au millième dans 1 0 mL de milieu de culture Luria-Bertani (LB, Difco, référence 244620) et incubée à 30 °C 15h sous agitation (180 rpm).

Les biofilms ont été cultivés à 30 °C dans des chambres à flux dédiées FC81 (Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, États-Unis). Pour lancer la croissance du biofilm, 2 ml de culture en phase exponentielle diluée à une DO ₆ oo de 0,01 sont injectés dans la chambre à flux. Après une heure d'adhésion, un flux constant de milieu de culture LB à 27ml/h est appliqué dans la chambre à l'aide d'une pompe péristaltique (Watson-Marlow 205S Watson-Marlow Ltd, Falmouth, Angleterre). Le biofilm est ainsi cultivé à 30 °C pendant 48h, à l'issue desquelles les mouvements cellulaires individuels sont observés par Microscopie Confocale Laser à Balayage (Leica SP2 AOBS, plateforme d'imagerie MIMA2). La fluorescence de la GFP est générée sous excitation d'un laser à 488 nm à travers un objectif x63 à immersion et elle est collectée dans la gamme 500-600 nm sur un photomultiplicateur. La nage des cellules est détectée par l'acquisition de séquences d'images dans le temps (une image toutes les 1 ,6s pendant quelques dizaines de secondes). Résultats et interprétation

L'observation de ce biofilm permet de mettre en évidence parmi l'ensemble des bactéries formant ce biofilm, la présence de bactéries mobiles à fort pouvoir de déplacement, ou bactéries nageuses. Ainsi, ces bactéries présentent une vitesse de déplacement d'environ 57000 μιη.η ^"1 , et peuvent se déplacer, de manière aléatoire, à travers tout le biofilm, en le traversant de part en part.

Ces bactéries forment transitoirement des canaux (figure 1 A) et des trous (figure 1 B), macroscopiques, à travers plusieurs couches, et qui ne se referment pas immédiatement.

Ces déplacements sont liés à la force propulsive des flagelles desdites bactéries. En effet, un biofilm de mutants de Bacillus thuringiensis sans flagelles ou à flagelles paralysés, ne présente pas de tels mouvements.

Ces bactéries à très forte mobilité changent de trajectoire dès lors qu'elles rencontrent un obstacle, ce qui laisse présager de leur potentiel à explorer l'ensemble du biofilm.

Sur les figures 1 C et 1 D, on a représenté la trajectoire d'une telle bactérie à fort pouvoir de déplacement dans un biofilm de 48h, sur une période de 80 secondes seulement. Ces représentations illustrent bien le fort potentiel de déplacement de telles bactéries dans un biofilm.

Par ailleurs, on a testé le potentiel de déplacement de ces bactéries Bacillus thuringiensis à fort pouvoir de déplacement dans des biofilms composés d'autres microorganismes. On a ainsi pu constater que ces bactéries gardaient leur capacité de déplacement dans de nombreux biofilms de bactéries Gram-positives {Staphylococcus aureus, Entereococcus faecalis, Listeria monocytogenes etc.) et de bactéries Gram-négatives { Yersinia enteritidis). Cette même capacité de déplacement a été observée entre autre chez Bacillus subtilis. EXEMPLES DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON

L'INVENTION

1 - Premier exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis produisant de la lysostaphine Dans cet exemple, on a voulu mettre en évidence l'effet d'une bactérie nageuse productrice d'un composé toxique sur un biofilm indésirable.

Le modèle d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 génétiquement marqué à la GFP fluorescente par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis productrices de lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus. La souche Bacillus thuringiensis 407 pHT50 et son mutant non mobile ont été construits pour les besoins de ces expérimentations.

Matériel et méthode

A- Souches et conditions de culture

Les souches de bactéries utilisées dans cette expérimentation sont listées dans le tableau I ci-dessous. Les souches sont conservées à -80 °C dans une solution de glycérol à 20%.

Tableau I : Souches utilisées.

Construction génétique des souches productrices de lysostaphine (Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 et Bacillus thuringiensis 407 Mla PHT50) : Le gène codant pour la lysostaphine a été amplifié par PCR à partir du plasmide pWG200 (Gaier et al., 1992) en introduisant les sites de restriction Xhol en 5' et Xbal en 3'.

Le promoteur papha3 du gène apha3 a été amplifié par PCR à partir du plasmide pDG783 (Guerout-Fleury et al., 1995) en introduisant les sites de restriction EcoRI en 5' et Xhol en 3'.

Les fragments obtenus ont étés digérés par Xhol et Xbal ou par EcoRI et Xhol et ligaturés dans le plasmide pHT1618 (Lereclus et al., 1992) ouvert par EcoRI et Xbal.

Le plasmide obtenu, résistant à la tétracycline et portant le gène de la lysostaphine sous le contrôle du promoteur papha3, est appelé pHT50. Les souches Bacillus thuringiensis 407 sauvage et Afla (Houry et al., 2010) ont été transformées par électroporation par le plasmide pHT50 et sélectionnées sur boîte de Pétri.

B- Formation des biofilms cibles de Staphylococcus aureus GFP.

Le protocole utilisé pour la formation des biofilms cibles est inspiré de celui décrit dans l'article Bridier et al. 2010.

Une préculture de Staphylococcus aureus RN4220 GFP est réalisée en inoculant 1 cryotube de 1 mL de la souche dans 9 mL de TSB (Biomérieux, réf : 51019), à 37 °C, avec agitation à 180rpm pendant 8h.

La culture est réalisée par inoculation de ~\ 0 μ1 de préculture dans 10 mL de milieu de culture, à 37°C, avec agitation à 180 rpm, pendant 15h.

La concentration bactérienne est alors ajustée à environ

10 ⁷ cellules/mL en ajustant la densité optique à 600nm de la suspension à 0,01 dans du TSB.

Dans une microplaque de 96 puits (GreinerBioOne, μΰΙβ3Γ, référence 655090) on inocule 250 μΐ de la suspension de Staphylococcus aureus GFP ajustée dans chaque puits et on incube la microplaque pendant 1 h à 37°C pour permettre l'adhésion initiale des cellules.

Les cellules non adhérentes sont alors éliminées par un renouvellement du milieu de culture dans chaque puits par 250 μΐ de TSB stérile. La microplaque est alors incubée à 37°C pendant 24h, ce qui permet la formation de 96 biofilms de Staphylococcus aureus GFP présentant une épaisseur au moins égale à 30 μιη. C- Mise en interaction avec un cocktail de microorganismes comportant Bacillus thuhngiensis.

Une première préculture des deux souches de Bacillus thuhngiensis {Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) se fait en inoculant 1 cryotube de 1 ml_ dans 9 mL de milieu LB (Difco, réf : 244620) que l'on incube 15h à 37°C, avec agitation à 180 rpm.

Une seconde préculture est réalisée en mettant 10 μΐ de la première préculture dans 10 mL de milieu de culture, pendant 8h, à 37°C, avec agitation à 180 rpm.

La culture est alors obtenue en inoculant 10 μΐ de la seconde préculture dans 10 mL de milieu de culture à 37°C avec agitation à 180 rpm durant 15h.

La concentration cellulaire des suspensions de Bacillus thuringiensis {Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) est ajustée en LB au spectrophotomètre à DO ₆ oonm = 0.02 (soit environ 2.10 ⁶ cellules/mL).

5 mL des suspensions sont stérilisés par filtration avec des filtres 0,22 μηπ (Syringe Filter Nalgene®, Cat n °190-2520) afin de récolter les surnageants stériles des cultures qui serviront de contrôle ultérieurement.

Sur la microplaque contenant les 96 biofilms de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de 24h d'une épaisseur supérieure à 30 μιη, les surnageants de chaque puits sont prélevés délicatement (en prélevant 250 μΐ avec une micropipette).

250 μΐ de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 puits.

250 μΐ de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits.

250 μΐ de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits. 250 μΙ_ de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuhngiensis 407 Ma pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits.

Les 24 puits restants sont simplement renouvelés en milieu de culture stérile et servent de contrôle des biofilms cibles sans traitement.

La microplaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C pour permettre l'interaction initiale entre les préparations et les biofilms cibles. Un renouvellement du milieu de culture de l'ensemble des puits est alors réalisé avec 250 μΐ de milieu de LB.

Après 24h d'incubation à 37°C sans agitation de la plaque, les biofilms résiduels de Staphylococcus aureus GFP sont analysés à l'aide d'un Microscope Confocale Laser à Balayage (MCLB) selon le protocole décrit par Bridier et al. 2010.

Il est possible de visualiser et de quantifier le biovolume de cellules pathogènes du biofilm résiduel en présence ou non du traitement biologique, et ainsi d'évaluer quantitativement l'efficacité du procédé à éliminer le biofilm cible.

Par exemple, on construit des projections 3D de la structure des biofilms à l'aide de la fonction easy 3D du logiciel Imaris 7.0 (Bitplane, Suisse). Puis, on détermine le biovolume des biofilms cibles résiduels à partir des séries d'images confocales obtenues par l'outil Matlab PHLIP comme décrit dans l'article Bridier et al. 2010.

Interprétation des résultats

Seul les résultats obtenus avec Bacillus thuhngiensis 407 pHT50 sont montrés (figures 3A à 3E et figure 4), mais des résultats similaires sont obtenus avec Bacillus subtilis.

Afin de montrer la stabilité/répétabilité des résultats obtenus, les figures 3A à 3E montrent, pour chaque expérimentation, les résultats obtenus pour trois puits de Staphylococcus aureus.

La figure 4 présente la quantification (biovolume en μιη ³ ) du biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de microorganismes nageurs, produisant ou non un produit antimicrobien.

La figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h. Le biofilm présente une épaisseur de 30 μιη, et une homogénéité visuelle et structurelle dans toutes ses dimensions. Sur la figure 3B, le même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h a été soumis à un cocktail de bactéries comportant uniquement des Bacillus thuringiensis 407.

La figure 3C montre que l'on n'observe aucune action sur ce même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h d'un filtrat de Bacillus thuringiensis 407 pHT50. Ainsi, la quantité de lysostaphine contenue dans le surnageant du cocktail n'est pas suffisante pour déstructurer le biofilm cible. Il en est de même avec le filtrat de la souche Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50 qui ne présente aucune activité sur le biofilm cible.

De même, l'interaction du biofilm avec un cocktail de bactéries non nageuses produisant la lysostaphine {Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) n'induit pas d'effet visible sur le biofilm, qui après 24h continue de persister (figure 3E).

L'effet le plus spectaculaire observé est celui obtenu par interaction, toujours de 24h, avec Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 3D). La production et la libération de lysostaphine par les bactéries nageuses permet d'éradiquer l'ensemble du biofilm dans un temps court.

Les résultats quantitatifs de la figure 4 confirment clairement les résultats des figures 3A à 3E, à savoir que les bactéries mobiles produisant de la lysostaphine permettent une destruction rapide du biofilm. L'étoile indique une différence de biovolume statistiquement différente de celle du biofilm non traité (P<0.05). Le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine mobile est environ 6 fois plus faible que le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine, mais non mobiles, démontrant l'apport de la nage dans le traitement du biofilm cible.

2- Deuxième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien exogène : la lysostaphine

Le composé actif peut être un composé antimicrobien (désinfectants chimiques, biomolécules actives) ou un agent dispersant (tensio-actifs, enzymes...). Dans l'exemple qui suit, le composé actif est la lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus dont l'efficacité est améliorée par un pré-traitement des biofilms cibles avec un cocktail de bactéries nageuses non productrices de composé antimicrobien.

Matériel et méthode

Les souches de bactéries utilisées pour ces expérimentations correspondent aux souches de Staphylococcus aureus RN4220 GFP et de

Bacillus thuhngiensis 407 décrites dans le tableau I.

Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuhngiensis 407 utilisées sont obtenues selon le protocole décrit précédemment.

Sur une microplaque contenant des biofilms de 24h de

Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits. 250μί de milieu de culture (contrôle) ou de suspension de Bacillus thuhngiensis 407 calibrée à 10 ⁸ cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits.

Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont ensuite incubés à 37°C pendant 4h.

Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non durant 4h par un cocktail de bactéries nageuses, sont alors traités par ajout dans les puits de 250 μΐ de lysostaphine dans la gamme de concentration 0 à 0,5 μg/ml.

Interprétation des résultats

Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action de la lysostaphine avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses).

Les résultats présentés à la figure 5 montrent que, lorsque le composé antimicrobien seul ne permet pas l'éradication du biofilm cible (concentration en lysostaphine < 0.5 μg/ml), son efficacité sur le biofilm cible est améliorée par le pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses (l'étoile indique un effet du prétraitement statistiquement significatif, P<0.05). „„

3- Troisième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de bactéries comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens

D'une manière générale, le protocole décrit ici permet de mettre en évidence l'effet sur un biofilm indésirable, d'un microorganisme nageur (non producteur de composés antimicrobiens) en association avec un (ou plusieurs) microorganismes non nageurs mais producteur de composé(s) antimicrobien(s).

Le microorganisme non doté de capacité de nage peut produire des bactériocines (exemple : Lactococcus lactis producteur de nisin), des acides (bactéries lactiques), d'autres biomolécules actives.... L'exemple d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis en association avec des souches non nageuses productrices de lysostaphine. Matériel et méthode

Les souches de microorganismes utilisés pour ces expérimentations correspondent aux souches de bactéries Staphylococcus aureus RN4220 GFP, de Bacillus thuringiensis 407 (bactéries nageuses) et Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 (bactéries non nageuses productrices de composés antimicrobiens) décrites dans le tableau I.

Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuringiensis 407 et Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 utilisées sont obtenus selon les protocoles décrits précédemment.

Sur la microplaque contenant les biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits.

250 μΐ de milieu de culture (contrôle, indiqué « Sans Bt Mla » à la figure 6) ou de suspension de Bacillus thuringiensis 407 calibrée à 10 ⁸ cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits. Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont alors incubés à 37°C pendant 4h.

Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non par un cocktail de bactéries nageuses, sont ensuite mis en contact avec 250 μΙ_ d'une suspension contenant 6, 7 ou 8 log/ml de bactéries non mobiles produisant un agent antimicrobien spécifique, la lysostaphine (souche Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50 indiquée « Bt Afla Lys 6 log », « Bt Afla Lys 7 log », ou « Bt Ma Lys 8 log » à la figure 6).

Après une heure d'interaction, le surnageant des biofilms est remplacé par 250 μΙ_ de milieu de culture stérile, et les biofilms incubés à 37°C pendant 15h.

Comme précédemment, les biofilms résiduels du pathogène cible sont alors quantifiés par calcul du biovolume à partir de séries d'images obtenues en MCLB.

Interprétation des résultats

Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action du cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine, avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de microorganismes nageurs).

Les résultats présentés à la figure 6 montrent que, lorsque le biofilm cible n'est pas éradiqué par le cocktail de bactéries non nageuses mais produisant de la lysostaphine (concentration < 8 log/ml de Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50), le prétraitement du biofilm par un cocktail de bactéries nageuses a permis d'améliorer l'efficacité du traitement (l'étoile indique un effet significatif du prétraitement sur la déconstruction du biofilm cible, P<0,05).

4- Quatrième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien et des bactéries nageuses Bacillus licheniformis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien exogène : le chlorure de benzalkonium Dans l'exemple qui suit, le composé actif est le chlorure de benzaikonium, un biocide fréquemment utilisés dans les hôpitaux et les sites industriels.

Deux souches de bactéries nageuses différentes sont utilisées.

- la souche de bactéries nageuses Bacillus thuhngiensis 407 {Bt), ainsi que la souche non nageuse mutante correspondante 407Afla {Bt àfla, contrôle négatif) décrites dans le tableau 1 ci-dessus. Ces bactéries présentent un diamètre d'environ 1 ,5 μιη.

- la souche de bactéries nageuses Bacillus licheniformis LMG7560 (désignée par le code Bl) (disponible dans la collection www.belspo.be/bcm), présentant un diamètre plus faible, inférieur à 1 μιη, et une capacité de nage estimée par microscopie environ deux fois plus rapide que la souche de Bacillus thuhngiensis 407. Matériel et méthodes

Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures des bacilli utilisés sont obtenus selon le protocole décrit précédemment pour Bacillus thuhngiensis 407.

Sur une microplaque contenant des biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits. 250 μΐ de milieu de culture (contrôle) ou de suspension de :

- Bt

- BtAfla

- Bl

- ou Bt + Bl à des concentrations égales,

calibrée à 10 ⁸ cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits.

Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries sont ensuite incubés à 37°C pendant 4h pour permettre l'infiltration des bactéries nageuses. Les surnageants sont éliminés avant la mise en contact avec le biocide.

Ces biofilms cibles sont alors traités par ajout dans les puits de 200 μΐ de chlorure de benzaikonium C14 (BAC, Fluka, Buchs, Suisse) à une concentration de 750 ppm, ou de 200 μΙ de chlorure de sodium (NaCI) 150 M (biofilm « non traité ». Après 5 minutes de contact à 20 °C, 200 μΙ d'une solution neutralisante (3 g/1 L- -phosphatidylcholine, 30 g/1 Tween 80, 5 g/1 thiosulfate de sodium, 1 g/l L-histidine, 30 g/l saponine) sont ajoutés dans les puits pour bloquer l'activité du biocide.

Les biofilms sont alors mécaniquement désagrégés à l'aide d'un cône de micropipette et la suspension collectée immédiatement dispersée dans 5 ml de solution neutralisante.

Les bactéries S. aureus survivantes sont dénombrées sur de l'agar TSA après dilutions sériées dans du NaCI 150 mM et incubation pendant 24 h à 37 °C.

Les réductions Iog10 des bactéries S. aureus sont calculées en comparant le rapport de survivants dans les biofilms désinfectés avec la population de biofilms non-traités.

Interprétation des résultats

Les témoins négatifs, c'est-à-dire ayant subi le traitement au moyen de la souche non nageuse BtMa, ou n'ayant subi aucun traitement par le chlorure de benzalkonium, ont donné des résultats comparables.

La figure 7 montre les résultats obtenus, en termes de réduction log des biofilms. Sur cette figure, les barres représentent les erreurs standards à partir de 16 valeurs obtenues dans 5 expérimentations indépendantes.

On y observe que la réduction log des biofilms augmente significativement lorsque le traitement par le chlorure de benzalkonium a été précédé d'un traitement par les bactéries nageuses, qu'il s'agisse de la souche de Bacillus thuringiensis {Bf) ou de la souche de Bacillus licheniformis {Bl).

On observe par ailleurs que le pré-traitement par un cocktail de microorganismes comportant ces deux souches {Bt + BI) a provoqué une réduction plus importante du biofilm que chacune de ces souches mise en œuvre séparément.

5- Cinquième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien et des bactéries nageuses Bacillus licheniformis ne produisant aucun produit antimicrobien, de deux souches différentes, en association avec un composé antimicrobien exogène : le chlorure de benzalkonium

L'expérimentation de l'Exemple 4 ci-dessus a été reproduite en utilisant deux souches différentes de Bacillus licheniformis : la souche LMG 7560, décrite ci-dessus, désignée dans cet exemple par le code BI1, et la souche également nageuse LMG 7559, désignée par BI2 (également disponible dans la collection www.belspo.be/bcm).

Ces deux souches ont été testées isolément, ainsi qu'en mélange, et en mélange chacune avec la souche de Bacillus thuhngiensis 407 {Bf). Un mélange de ces trois souches nageuses {Bt + BI1 + BI2) a également été testé.

Les résultats, en termes de réduction log des biofilms, sont montrés dans le Tableau 2 ci-après.

Tableau 2 - Effet sur l'élimination du biofilm du mélange de plusieurs souches nageuses de propriétés différentes

Comme dans l'exemple précédent, on observe de ces résultats que le mélange de deux souches nageuses de propriétés différentes, dont une souche de bactéries de plus grand diamètre {Bt) et une souche de bactéries de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm {BI1 et/ou BI2) présentent, en combinaison avec le chlorure de benzalkonium, une efficacité bien plus importante que chacune de ces souches isolément. BIBLIOGRAPHIE

Bridier A, F. Dubois-Brissonnet, A. Boubetra, V. Thomas, R. Briandet. 2010. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered by a high throughput CLSM method, Journal of Microbiological Methods 82 (2010) 64-70.

Gaier W, Vogel RF, Hammes WP. Cloning and expression of the lysostaphin gene in Bacillus subtilis and Lactobacillus casei. Lett Appl Microbiol. 1992 Mar;14(3):72-6 Guérout-Fleury AM, Shazand K, Frandsen N, Stragier P, Antibiotic- resistance cassettes for Bacillus subtilis., Gene. 1995 Dec 29;167(1 -2):335- 6.

Houry A, Briandet R, Aymerich S, Gohar M. Involvement of motility and flagella in Bacillus cereus biofilm formation. Microbiology. 2010 Apr;156(Pt 4):1009-18.

Lereclus D, Vallade M, Chaufaux J, Arantes O, Rambaud S. Expansion of insecticidal host range of Bacillus thuringiensis by in vivo genetic recombination. Biotechnology (N Y). 1992 Apr;10(4):418-21

Malone CL, Boles BR, Lauderdale KJ, Thoendel M, Kavanaugh JS, Horswill AR. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 2009;77(3):251 -60

Salamitou S, Ramisse F, Brehélin M, Bourguet D, Gilois N, Gominet M, Hernandez E, Lereclus D. The plcR regulon is involved in the opportunistic properties of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus in mice and insects. Microbiology. 2000 Nov;146:2825-32.