[0001] 本申请要求于 2018年 11月 29日在中国专利局提交的、 申请号为 201811446689.5

、 发明名称为“生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的 方法及其应用”的中国专利申请的 优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

[0002] 本申请涉及生物技术领域， 涉及采用基因工程手段对生物酶进行改造后， 高效 催化牛磺鹅去氧胆酸生物转化的方法， 具体涉及一种生物转化制备牛磺熊去氧 胆酸的方法， 及生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法的应用 。

背景技术

[0003] 牛磺熊去氧胆酸， 化学名称为 3oc, 7(3 -二羟基胆烷酰 -N-牛磺酸， 具有解痉、 抗惊 厥、 抗炎及溶胆石等作用。 牛磺熊去氧胆酸主要是存在于黑熊胆汁中， 是熊胆 中标志性有效成分。 2007年， 商品名为滔罗特的牛磺熊去氧胆酸胶囊， 获准在 中国销售。 其主要用于溶解胆固醇结石。 熊去氧胆酸， 是亲水性的胆汁酸， 溶 石率有限， 安全性好， 副作用较少， 已被广泛用于临床。 牛磺熊去氧胆酸， 是 熊去氧胆酸与牛磺酸的共轭体， 与熊去氧胆酸相比， 亲水性更强， 溶石速度更 快， 安全性更好。

[0004] 起初， 牛磺熊去氧胆酸是从“人工引流”的黑熊胆汁 中提取的， 来源有限， 收率 低， 批次间差异大， 对动物不人道。 后来， 逐渐被人工合成方法所取代。 人工 化学合成方法， 主要分为三类： 一是通过形成活性中间体如混合酸酐、 活性硫 酯等， 再与牛磺酸钠反应； 二是在缩合剂作用下形成酰胺； 三是通过胱胺类物 质形成酰硫化物再氧化得到目的产物。 这些方法选择性低， 使用大量有机试剂 ， 污染环境。

[0005] 为了解决“人工引流”熊胆汁提取和人工化学 合成方法的缺陷， 逐渐发展出用生 物转化的方法制备牛磺熊去氧胆酸。 牛磺鹅去氧胆酸， 广泛存在于鸡、 鸭、 鹅 等禽畜胆汁中， 与牛磺熊去氧胆酸是 7位羟基上的差向异构体。 中国发明专利 CN 102994604A公开了一种通过 7oc-类固醇脱氢酶和 7(3 -类固醇脱氢酶两步催化， 将 牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的方法 。 此种方法中， 底物浓度较低 ( 1 g/L) ， 底物转化不完全， 需要使用大量成本昂贵的辅酶， 反应中间体牛磺 7 -酮 石胆酸作为副产物难以去除。 中国发明专利 CN 107287272A公开了一种制备牛磺 熊去氧胆酸的方法。 其分别构建含有 7oc-类固醇脱氢酶和 7(3-类固醇脱氢酶的表达 载体或二者的共表达载体， 在培养基中加入底物， 发酵的同时进行转化， 将牛 磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸。 但此种方法底物浓度低、 转化率低， 反 应中间体牛磺 ₇ -酮石胆酸含量高， 转化周期长， 不易进行工业化生产。

发明概述

技术问题

[0006] 本申请实施例的目的之一在于： 提供一种生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法 及其应用， 旨在解决采用现有的生物转化技术制备牛磺熊 去氧胆酸时存在底物 浓度低、 转化率低， 反应中间体牛磺 7 -酮石胆酸含量高， 转化周期长， 不易进行 工业化生产的问题。

问题的解决方案

技术解决方案

[0007] 为解决上述技术问题， 本申请实施例采用的技术方案是：

[0008] 第一方面， 提供了一种生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方 法， 包括基因密码子 优化、 工程菌构建、 工程菌培养、 底物转化及产物制备； 采用工程菌直接发酵 转化底物制备牛磺熊去氧胆酸； 其中， 所述底物为牛磺鹅去氧胆酸， 所述工程 菌选自能够表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢 酶的工程菌系。

[0009] 第二方面， 提供了一种上述方法在制备熊去氧胆酸中的应 用。

[0010] 本申请实施例提供的生物转化制备牛磺熊去氧 胆酸的方法的有益效果在于：

[0011] ( 1) 采用本申请提供的生物转化方法， 可以提高待转化的底物浓度， 使底物 浓度高达 250g/L， 反应时间短， 且对底物的转化率高达 98%以上， 所获得的产品 纯度在 99%以上；

[0012] (2) 采用上述特定表达的大肠杆菌作为生物工程菌 ， 生物转化过程中反应中 间物牛磺 7 -酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的效率高， 最终产品中几乎不含有副 产物；

[0013] (3) 使用 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢 酶， 在反应体系中使 NAD ⁺ 循环再生， 极大降低了辅酶 NAD ⁺ 的使用量， 使酶催 化反应的成本降低， 利于工业放大；

[0014] (4) 将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序 列连接在一起构建成融合 蛋白多聚体， 与底物和辅酶的结合距离更近， 更有利于转化反应的进行， 在工 业化生产中， 减少发酵的次数， 简化了工艺， 节约时间成本和原料成本；

[0015] (5) 本申请可以使用 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及 7(3 -类固醇脱氢酶和 葡萄糖脱氢酶的全细胞进行牛磺鹅去氧胆酸的 转化， 避免了破碎细胞、 细胞液 澄清、 酶的亲和纯化等工业成本大的步骤， 节约大量成本， 且过程简单可控。

[0016] 本申请实施例提供的生物转化制备牛磺熊去氧 胆酸的方法应用的有益效果在于 : 将生物转化法制备的牛磺熊去氧胆酸转化液中 ， 进行碱裂解制备熊去氧胆酸 ， 避免了化学法合成熊去氧胆酸中大量有机溶剂 的使用； 且该方法反应时间短 ， 反应温和可控， 操作简单。

发明的有益效果

对附图的简要说明

附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案 ， 下面将对实施例或示范性技术 描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅 是本申请的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动 的前提下， 还可以根据这些附图获得其它的附图。

[0018] 图 1是本申请实施例提供的利用生物转化方法制� �牛磺熊去氧胆酸的原理图；

[0019] 图 2是本申请一实施例提供的类固醇脱氢酶与辅� �再生酶融合表达催化底物示 意图；

[0020] 图 3是本申请提供的实施例 9制备所得的牛磺熊去氧胆酸的 HPLC图谱。

发明实施例

本发明的实施方式 [0021] 为了使本申请的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 以下结合附图及实施例 ， 对本申请进行进一步详细说明。 应当理解， 此处所描述的具体实施例仅用以 解释本发明， 并不用于限定本申请。

[0022] 术语“第 “第二”仅用于便于描述目的， 而不能理解为指示或暗示相对重要 性或者隐含指明技术特征的数量。 “多个”的含义是两个或两个以上， 除非另有明 确具体的限定。

[0023] 本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重 量不仅仅可以指代各组分的具体 含量， 也可以表示各组分间重量的比例关系， 因此， 只要是按照本申请实施例 说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在 本发明实施例说明书公开的范围 之内。 具体地， 本申请实施例说明书中所述的重量可以是 |ig、 mg、 g、 kg等化工 领域公知的质量单位。

[0024] 为了说明本申请所述的技术方案， 以下结合具体附图及实施例进行详细说明。

[0025] 第一方面， 本申请一些实施例提供了一种生物转化制备牛 磺熊去氧胆酸的方法 ， 包括基因密码子优化、 工程菌构建、 工程菌培养、 底物转化及产物制备； 采 用工程菌直接发酵转化底物制备牛磺熊去氧胆 酸； 其中， 所述底物为牛磺鹅去 氧胆酸， 所述工程菌选自能够表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱 氢酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌系。

[0026] 本申请实施例提供的生物转化制备牛磺熊去氧 胆酸的方法的有益效果在于：

[0027] ( 1) 采用本申请提供的生物转化方法， 可以提高待转化的底物浓度， 使底物 浓度高达 250g/L， 反应时间短， 且对底物的转化率高达 98%以上， 所获得的产品 纯度在 99%以上；

[0028] (2) 采用上述特定表达的大肠杆菌作为生物工程菌 ， 生物转化过程中反应中 间物牛磺 7 -酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的效率高， 最终产品中几乎不含有副 产物；

[0029] (3) 使用 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢 酶， 在反应体系中使 NAD ⁺ 循环再生， 极大降低了辅酶 NAD ⁺ 的使用量， 使酶催 化反应的成本降低， 利于工业放大；

[0030] (4) 将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过柔性多肽序 列连接在一起构建成融合 蛋白多聚体， 与底物和辅酶的结合距离更近， 更有利于转化反应的进行， 在工 业化生产中， 减少发酵的次数， 简化了工艺， 节约时间成本和原料成本；

[0031] (5) 本申请可以使用 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶以及 7(3 -类固醇脱氢酶和 葡萄糖脱氢酶的全细胞进行牛磺鹅去氧胆酸的 转化， 避免了破碎细胞、 细胞液 澄清、 酶的亲和纯化等工业成本大的步骤， 节约大量成本， 且过程简单可控。

[0032] 如附图 1所示， 本申请提供的生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的 方法的原理为： 以牛磺鹅去氧胆酸为底物， 通过使用基因工程手段改造后的 7oc-类固醇脱氢酶， 转化为牛磺 7 -酮石胆酸， 同时共表达或融合表达的乳酸脱氢酶在丙酮酸 钠存在的 情况下将辅酶 NAD+循环再生； 然后 7(3 -类固醇脱氢酶将牛磺 7 -酮石胆酸转化为牛 磺熊去氧胆酸， 同时共表达或融合表达的葡萄糖脱氢酶在葡萄 糖存在的情况下 将 NAD+循环再生。 上述方法中融合表达蛋白是将类固醇脱氢酶和 辅酶再生酶通 过柔性多肽序列连接在一起构建成融合蛋白多 聚体， 使底物和辅酶的结合距离 更近， 更有利于转化反应的进行， 能够实现高收率、 高纯度牛磺熊去氧胆酸的 制备。

[0033] 所述工程菌选自能够表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和 葡萄糖脱氢酶的工程菌系， 是指 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢 酶和葡萄糖脱氢酶四种酶并不一定在同一个工 程菌中完全表达， 而是可以通过 两个或两个以上的工程菌形成的工程菌系， 来表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢 酶、 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶中的一种或� �种， 最终实现 7oc-类固醇脱氢 酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四种酶的表达� � 且大多情况 下， 通过两个或两个以上的工程菌形成的工程菌系 实现 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸 脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四种酶的表达� � 当然， 所述工程菌系 中的多个工程菌可以为同一类工程菌。 在一些实施例中， 工程菌系包括能够表 达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的工程菌， 以及能够表达 7(3 -类固醇脱氢酶和葡 萄糖脱氢酶的工程菌。 当然， 应当理解的是， 工程菌系中的工程菌的组成方式 不限于此， 只要能够表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡 萄糖脱氢酶即可。 且所述在一些实施例中， 表达上述酶的工程菌可以为大肠杆 菌。 [0034] 在一些实施例中， 所述 7oc-类固醇脱氢酶和所述乳酸脱氢酶的表达酶� �自 7oc-类 固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶单表达酶、 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶共表达酶、 7 a-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合酶� �� 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶 双四聚体融合酶与乳酸脱氢酶共表达酶、 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚 体融合酶与 _7a -类固醇脱氢酶共表达酶中的一种。

[0035] 在一些实施例中， 所述 7(3-类固醇脱氢酶和所述葡萄糖脱氢酶的表达� �选自 7(3- 类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶单表达酶、 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表 达酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶� � 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄 糖脱氢酶四聚体融合酶与葡萄糖脱氢酶共表达 酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱 氢酶四聚体融合酶与 7(3-类固醇脱氢酶共表达酶中的一种。

[0036] 在一些实施例中， 所述工程菌选自能够表达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶单 表达酶， 或 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶共表达酶， 或 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸 脱氢酶双四聚体融合酶， 或 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合� �与乳 酸脱氢酶共表达酶， 或 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶双四聚体融合� �与 7oc-类固 醇脱氢酶共表达酶的工程菌； 和能够表达 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶单表 达酶， 或 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶共表达酶， 或 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄 糖脱氢酶四聚体融合酶， 或 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合� �与葡 萄糖脱氢酶共表达酶， 或 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶四聚体融合酶� � 7(3 -类 固醇脱氢酶共表达酶的工程菌。

[0037] 本申请实施例中， 7a-类固醇脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID

NO:l , 乳酸脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID

NO:3 , 7(3-类固醇脱氢酶 DNA序列为 SEQ ID

NO:5和葡萄糖脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID NO:7。

[0038] 在一些实施例中， 对 7(3-类固醇脱氢酶基因的 A78和 VI 16位点进行突变。

[0039] 本申请实施例中， 所述 7a-类固醇脱氢酶的蛋白质序列为 SEQ ID NO:2， 所述乳 酸脱氢酶的蛋白质序列为 SEQ ID NO:4， 所述 7(3-类固醇脱氢酶蛋白质序列为 SEQ ID NO:6 , 所述葡萄糖脱氢酶的蛋白质序列为 SEQ ID NO:8。

[0040] 本申请实施例中， 采用上述原理生物转化制备牛磺熊去氧胆酸时 ， 需要构建用 于工程菌表达 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶 的基因， 并进行基因密码子优化。

[0041] 在一些实施例中， 所述基因密码子优化的方法为： 对基因序列进行大肠杆菌表 达密码子优化， 加入亲和标签， 并进行全基因合成， 分别记为 7oc-类固醇脱氢酶 基因 7a-HSDH、 乳酸脱氢酶基因 LDH、 7(3 -类固醇脱氢酶基因 7(3-HSDH、 葡萄糖 脱氢酶基因 GDH。

[0042] 在优化完基因密码子后， 构建含有优化密码子基因的工程菌， 将构建的表达载 体分别转化入大肠杆菌 BL21 (DE3) 的感受态细胞中， 得到工程菌， 并对其进 行培养。

[0043] 在一些实施例中， 所述工程菌构建的方法包括：

[0044] 构建基因表达载体， 将构建得到的 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3-类固醇 脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因表达载体转化入 大肠杆菌 BL21的感受态细胞中， 得到工程菌。

[0045] 在一些实施例中， 将表达 7oc-类固醇脱氢酶的基因标记为 7oc-HSDH， 将表达乳 酸脱氢酶的基因标记为 LDH， 将表达 7(3-类固醇脱氢酶的基因标记为 7(3-HSDH， 将表达葡萄糖脱氢酶的基因标记为 GDH， 所述构建基因表达载体的方法为：

[0046] 将 7a-HSDH、 LDH、 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到 单基因表达载体 pETDuet-l-7a-HSDH， pETDuet-l-LDH, pETDuet-l-7(3-HSDH, pETDuet-1-GDH; 或

[0047] 将 7a-HSDH和 LDH， 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到 双基因表达载体 pETDuet-l-7a-HSDH/LDH， pETDuet-l-7(3-HSDH/GDH; 或

[0048] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢 酶单基因分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到单基因融合蛋白表达载体 pETD uet- l-(LDH-Linker-7a-HSDH) , pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH); 或

[0049] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳� �脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱 氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶 单基因分别构建至 pETDuet-1载体 中， 分别得到单基因融合蛋白与脱氢酶共表达载体 pETDuet-1 -(LDH-Linker-7a-H SDH)/LDH, pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/GDH; 或 [0050] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与 7oc-类固醇脱氢酶单基因， 7(3 -类固 醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与 7(3 -类固醇脱氢酶单基因分别构建至 pETDue t-1载体中， 分别得到单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表 达载体 pETDuet-l-(LD H-Linker-7a-HSDH)/7a-HSDH , pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/7(3-HSDH。

[0051] 在一些实施例中， 所述 ⁷ a-HSDH来源于 Campylobacter hyointestinalis (UniProt:

CDQ67_02445) , 所述 LDH来源于 Human (UniProt: P00338) ， 所述、 7(3-HSDH 来源于 Collinsella aerofaciens ATCC 25986 (UniProt: A4ECA9) 和所述和 GDH来 源于 Bacillus subtilis (strain 168) (UniProt: P12310)。

[0052] 在一些实施例中， 所述 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的 DNA序列为 S EQ ID NO:9 , 所述 7(3-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的 DNA序列为 SEQ ID NO:l l。

[0053] 在一些实施例中， 所述 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因的蛋� �质序列 为 SEQ ID NO: 10, 所述 7(3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因的蛋� �质序列 为 SEQ ID NO: 12。

[0054] 在所述工程菌构建完成后， 对其进行培养， 使其能够大量发酵表达。 在一些实 施例中， 所述工程菌培养包括： 工程菌小量发酵表达和工程菌大量发酵表达。 其中， 工程菌小量发酵表达的方法为： 工程菌菌液涂布氨苄抗性的 LB平板， 挑 选单克隆， 接种至 5mL含有氨苄的 LB培养基中， 37°C, 220rpm, 进行培养， OD 值为 0.8-1.2时， 加入 ImM IPTG诱导 2h， SDS-PAGE检测表达量， 选取表达量高 的克隆， 进行菌种保藏； 20pL菌种接种至 200mL氨苄抗性 LB培养基中过夜培养 ， OD值为 2.5-4.0, 取 2mL培养液接种至氨节抗性培养基中培养， OD值为 1时， 加入 IPTG诱导过夜表达， 收集菌体。 工程菌大量发酵表达的方法为： 挑选工程 菌接种至氨苄抗性 LB培养基的 1L三角瓶中， 37°C, 220rpm过夜培养， OD600值 为 2.5-4.0， 各取 20mL培养液接种至含有 10个 1L氨苄抗性培养基的 3L三角瓶中， 3 TC 140 rpm过夜培养； 将 10L种子液无菌接种至装有 200L大肠杆菌高密度发酵 培养基的发酵罐中， 37°C, 通气搅拌培养 8小时， 通气搅拌培养 8小时后， 向发酵 罐中加入终浓度为 O.lmM的 IPTG溶液进行诱导， 诱导 10- 12h后发酵结束， 放液 ， 离心收集菌体并 4°C保存， 取少量菌体重悬于 lOOmM磷酸盐缓冲液中， 超声破 碎， 得到粗酶液；

[0055] 在工程菌培养并大量发酵表达后， 可对工程菌表达的酶进行活力测定。

[0056] 本申请实施例中， 7oc-类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以牛磺鹅去氧胆酸为底 物， 在一个 3mL的反应体系中加入 2.97mL的 100mM

pH8.0磷酸缓冲液， 终浓度 0.5mM的牛磺鹅去氧胆酸， lOpL的稀释酶液， 终浓度 0.5mM的 NADP+， 在 pH8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸光值增加。

[0057] 本申请实施例中， 乳酸脱氢酶的酶活测定方法： 以丙酮酸钠为底物， 在一个 3 mL的反应体系中加入 2.7mL的 100mM磷酸缓冲液 （pH8.0） ， 0.2mL的 100mM丙 酮酸钠， 50pL的稀释酶液， NADH终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸光值减少。

[0058] 本申请实施例中， 7（3 -类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以牛磺熊去氧胆酸为底 物， 在一个 3mL的反应体系中加入 2.97mL的 lOOmM磷酸缓冲液 （pH8.0） ， 终浓 度 0.5mM的牛磺熊去氧胆酸， 1（VL的稀释酶液， 终浓度 0.5mM的 NADP+， 在 pH 8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸光值增加。

[0059] 本申请实施例中， 葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法： 以葡萄糖为底物， 在一个 3 mL的反应体系中加入 2.7mL的 lOOmM磷酸缓冲液 （pH8.0） ， 0.2mL的 1.5M葡萄 糖， 50pL的稀释酶液， NADP+终浓度为 2mM， 在 pH8.0和 25°C反应 2min， 在 340 nm处测定吸光值增加。

[0060] 本申请实施例中， 在工程菌培养至能够稳定表达目的酶后， 采用工程菌直接转 化底物制备牛磺熊去氧胆酸。 其中， 所述底物为牛磺鹅去氧胆酸。 在一些实施 例中， 所述底物的浓度为 20g/L-250g/L。 所述底物在低浓度反应时， 反应体积大 ， 辅酶用量大。 通过优化 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7（3 -类固醇脱氢酶和葡 萄糖脱氢酶的用量， 将底物浓度提高至 250g/L， 从而减少了反应体积和辅酶的用 量。 当所述底物浓度继续增加， 超过 250g/L时， 底物溶解性能降低， 导致底物的 转化不充分。

[0061] 在一些实施例中， 以所述牛磺鹅去氧胆酸， 采用工程菌直接转化底物的方法包 括：

[0062] 将牛磺鹅去氧胆酸溶解于 20-100mM甘氨酸缓冲液中， 力 P入 0.01-0.8mM的 NAD ⁺ ， 加入 5-60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重 悬液的表达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌� �， 补加 20-100mM甘氨 酸缓冲液至最终体积， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5， 25°C, 反应 6-18h; 加入 1.8- 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重悬液的表达 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌� �体， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5 ， 25°C, 反应 6-18h。

[0063] 本申请实施例中， 在底物转化完后， 提取工程菌中的产物牛磺熊去氧胆酸。 在 一些实施例中， 所述牛磺熊去氧胆酸的制备方法包括： 将转化完成的反应液， 旋蒸至膏状， 加入 2-10倍的无水乙醇或 95%乙醇， 离心或过滤去除沉淀， 上清液 经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品， 把牛磺熊去氧胆酸粗品， 使用乙腈溶解， 0.22 um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液； 将所述上柱液使用制备型高效液相制备设 备注入装填硅胶层析填料的高压不锈钢柱中； 然后使用不同浓度甲醇-水流动相 进行逐步洗脱， 将收集的洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸 发至粘稠状， 同 时回收甲醇； 然后置于真空干燥箱内干燥， 采用高效液相色谱法测定样品中牛 磺熊去氧胆酸的纯度。

[0064] 在一些实施例中， 所述生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法包括 以下步骤：

[0065] ( 1) 基因密码子优化

[0066] 对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化， 加入亲和标签， 并进行全基因合成 ， 分别记为 7oc-类固醇脱氢酶基因 7oc-HSDH、 乳酸脱氢酶基因 LDH、 7(3-类固醇 脱氢酶基因 7(3-HSDH、 葡萄糖脱氢酶基因 GDH;

[0067] (2) 工程菌构建

[0068] 构建基因表达载体， 将构建得到的 7oc-类固醇脱氢酶、 乳酸脱氢酶、 7(3-类固醇 脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因表达载体转化入 大肠杆菌 BL21的感受态细胞中， 得到工程菌；

[0069] (3) 工程菌培养：

[0070] 工程菌小量发酵表达： 工程菌菌液涂布氨苄抗性的 LB平板， 挑选单克隆， 接 种至 5mL含有氨苄的 LB培养基中， 37°C, 220rpm, 进行培养， OD值为 0.8-1.2时 ， 加入 ImM IPTG诱导 2h， SDS-PAGE检测表达量， 选取表达量高的克隆， 进行 菌种保藏； 20pL菌种接种至 200mL氨苄抗性 LB培养基中过夜培养， OD值为 2.5-4 .0， 取 2mL培养液接种至氨苄抗性培养基中培养， OD值为 1时， 加入 IPTG诱导过 夜表达， 收集菌体；

[0071] 工程菌大量发酵表达： 挑选工程菌接种至氨苄抗性 LB培养基的 1L三角瓶中， 3

7°C, 220rpm过夜培养， OD600值为 2.5-4.0， 各取 20mL培养液接种至含有 10个 1L 氨苄抗性培养基的 3L三角瓶中， 37°C, 140 rpm过夜培养； 将 10L种子液无菌接 种至装有 200L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中， 37°C, 通气搅拌培养 8小 时， 通气搅拌培养 8小时后， 向发酵罐中加入终浓度为 O. lmM的 IPTG溶液进行诱 导， 诱导 10-12h后发酵结束， 放液， 离心收集菌体并 4°C保存， 取少量菌体重悬 于 lOOmM磷酸盐缓冲液中， 超声破碎， 得到粗酶液；

[0072] (4) 底物转化

[0073] 将牛磺鹅去氧胆酸溶解于 20-100mM甘氨酸缓冲液中， 力 P入 0.01-0.8mM的 NAD ⁺ ， 加入 5-60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重 悬液的表达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌� �， 补加 20-100mM甘氨 酸缓冲液至最终体积， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5， 25°C, 反应 6-18h; 加入 1.8- 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重悬液的表达 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌� �体， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5 ， 25°C, 反应 6-18h;

[0074] (5) 产物制备

[0075] 将步骤 (4) 转化完成的反应液， 旋蒸至膏状， 加入 2-10倍的无水乙醇或 95%乙 醇， 离心或过滤去除沉淀， 上清液经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品， 把牛磺熊 去氧胆酸粗品， 使用乙腈溶解， 0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液； 将所 述上柱液使用制备型高效液相制备设备注入装 填硅胶层析填料的高压不锈钢柱 中； 然后使用不同浓度甲醇 -水流动相进行逐步洗脱， 将收集的洗脱液倒入旋转 蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状， 同时回收甲醇； 然后置于真空干燥箱内干燥 ， 采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆 酸的纯度。

[0076] 在一些实施例中， 步骤 (2) 中， 所述构建基因表达载体的方法为：

[0077] 将 7a-HSDH、 LDH、 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到 单基因表达载体 pETDuet-l-7a-HSDH， pETDuet-l-LDH, pETDuet-l-7(3-HSDH, pETDuet-l-GDH; 或

[0078] 将 7a-HSDH和 LDH， 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到 双基因表达载体 pETDuet-l-7a-HSDH/LDH， pETDuet-l-7(3-HSDH/GDH; 或

[0079] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢 酶单基因分别构建至 pETDuet-1载体中， 分别得到单基因融合蛋白表达载体 pETD uet- l-(LDH-Linker-7a-HSDH) , pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH); 或

[0080] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳� �脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱 氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶 单基因分别构建至 pETDuet-1载体 中， 分别得到单基因融合蛋白与脱氢酶共表达载体 pETDuet-1 -(LDH-Linker-7a-H SDH)/LDH, pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/GDH; 或

[0081] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与 7oc-类固醇脱氢酶单基因， 7(3 -类固 醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与 7(3 -类固醇脱氢酶单基因分别构建至 pETDue t-1载体中， 分别得到单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表 达载体 pETDuet-l-(LD H-Linker-7a-HSDH)/7a-HSDH , pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/7(3-HSDH。

[0082] 本申请实施例中， 所述 7a-类固醇脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID NO:l， 所述乳酸 脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID NO:3 , 所述 7(3-类固醇脱氢酶 DNA序列为 SEQ ID NO:5 , 所述葡萄糖脱氢酶的 DNA序列为 SEQ ID NO:7。

[0083] 本申请实施例中， 所述 7oc-类固醇脱氢酶、 所述乳酸脱氢酶、 所述 7(3 -类固醇脱 氢酶和所述葡萄糖脱氢酶独立的选自液体酶或 固定化酶， 所述 7oc-类固醇脱氢酶 、 所述乳酸脱氢酶、 所述 7(3 -类固醇脱氢酶和所述葡萄糖脱氢酶独立的选� �全细 胞、 未经纯化的酶或经纯化的酶。

[0084] 在一些实施例中， 生物转化法的具体步骤如下：

[0085] ( 1) 基因密码子优化

[0086] 对基因序列进行大肠杆菌表达密码子优化， 加入亲和标签， 并进行全基因合成 ， 分别记为 7oc-类固醇脱氢酶基因 7oc-HSDH、 乳酸脱氢酶基因 LDH、 7(3-类固醇 脱氢酶基因 7(3-HSDH、 葡萄糖脱氢酶基因 GDH;

[0087] (2) 单基因表达载体构建 [0088] 将 7a-HSDH、 LDH、 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 得 pETDu et-l-7a-HSDH, pETDuet-l-LDH, pETDuet-l-7(3-HSDH, pETDuet-l-GDH；

[0089] (3) 双基因表达载体构建

[0090] 将 7a-HSDH和 LDH， 7(3-HSDH和 GDH分别构建至 pETDuet-1载体中， 得 pETDu et-1 -7a-HSDH/LDH， pETDuet- 1 -7 (3-HSDH/GDH ;

[0091] (4) 单基因融合蛋白表达载体构建

[0092] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢 酶单基因分别构建至 pETDuet-1载体中， 得 pETDuet- l-(LDH-Linker-7a-HSDH)， pETDuet- l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)；

[0093] (5) 单基因融合蛋白与脱氯酶共表达载体构建

[0094] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳� �脱氢酶单基因， 7(3 -类固醇脱 氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与葡萄糖脱氢酶 单基因分别构建至 pETDuet-1载体 中， 得 pETDuet- l-(LDH-Linker-7a-HSDH)/LDH， pETDuet- l-(GDH-Linker-7(3-HS DH)/GDH；

[0095] (6) 单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达载体构 建

[0096] 将 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与 7oc-类固醇脱氢酶单基因， 7(3 -类固 醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与 7(3 -类固醇脱氢酶单基因分别构建至 pETDue t-1载体中， 得 pETDuet- l-(LDH-Linker-7a-HSDH)/7a-HSDH， pETDuet- 1-(GDH-L inker-7(3-HSDH)/7(3-HSDH；

[0097] (7) 工程菌构建

[0098] 将步骤 (2) -步骤 (6) 构建的所有表达载体分别转化入大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 的感受态细胞中， 得到工程菌；

[0099] (8) 工程菌小量发酵表达

[0100] 工程菌菌液涂布氨苄抗性的 LB平板， 挑选单克隆， 接种至 5mL含有氨苄的 LB 培养基中， 37°C, 220rpm, 进行培养， OD值为 0.8-1.2时， 加入 ImM

IPTG诱导 2h， SDS-PAGE检测表达量， 选取表达量高的克隆， 进行菌种保藏； 2 (VL菌种接种至 200mL氨苄抗性 LB培养基中过夜培养， OD值为 2.5-4.0， 取 2mL 培养液接种至氨节抗性培养基中培养， OD值为 1时， 加入 IPTG诱导过夜表达， 收集菌体；

[0101] (9) 工程菌大量发酵表达

[0102] 挑选工程菌接种至氨苄抗性 LB培养基的 1L三角瓶中， 37°C, 220rpm过夜培养 ， OD600值为 2.5-4.0， 各取 20mL培养液接种至含有 10个 1L氨苄抗性培养基的 3L 三角瓶中， 37°C, 140 rpm过夜培养； 将 10L种子液无菌接种至装有 200L大肠杆 菌高密度发酵培养基的发酵罐中， 37°C, 通气搅拌培养 8小时， 通气搅拌培养 8小 时后， 向发酵罐中加入终浓度为 O. lmM的 IPTG溶液进行诱导， 诱导 10-12h后发 酵结束， 放液， 离心收集菌体并 4°C保存， 取少量菌体重悬于 lOOmM磷酸盐缓冲 液中， 超声破碎， 得到粗酶液；

[0103] ( 10) 酶活力测定

[0104] 7oc-类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以牛磺鹅去氧胆酸为底物， 在一个 3mL的 反应体系中加入 2.97mL的 lOOmM pH8.0磷酸缓冲液， 终浓度 0.5mM的牛磺鹅去氧 胆酸， 1(VL的稀释酶液， 终浓度 0.5mM的 NADP+， 在 pH8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸光值增加；

[0105] 乳酸脱氢酶的酶活测定方法： 以丙酮酸钠为底物， 在一个 3mL的反应体系中加 入 2.7mL的 lOOmM磷酸缓冲液 (pH8.0) ， 0.2mL的 lOOmM丙酮酸钠， 50^L的稀 释酶液， NADH终浓度为 0.2mM， 在 pH8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸 光值减少；

[0106] 7(3 -类固醇脱氢酶的酶活测定方法： 以牛磺熊去氧胆酸为底物， 在一个 3mL的反 应体系中加入 2.97mL的 lOOmM磷酸缓冲液 (pH8.0) ， 终浓度 0.5mM的牛磺熊去 氧胆酸， 1(VL的稀释酶液， 终浓度 0.5mM的 NADP+， 在 pH8.0和 25°C反应 lmin， 在 340nm处测定吸光值增加；

[0107] 葡萄糖脱氢酶的酶活测定方法： 以葡萄糖为底物， 在一个 3mL的反应体系中加 入 2.7mL的 lOOmM磷酸缓冲液 (pH8.0) ， 0.2mL的 1.5M葡萄糖， 50^L的稀释酶 液， NADP+终浓度为 2mM， 在 pH8.0和 25°C反应 2min， 在 340nm处测定吸光值增 加；

[0108] ( 11) 牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸

[0109] 将牛磺鹅去氧胆酸溶解于 20-100mM甘氨酸缓冲液中， 力卩入 0.01-0.8mM的 NAD+ ， 加入 5-60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重 悬液的表达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌� �， 补加 20-100mM甘氨 酸缓冲液至最终体积， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5， 25°C, 反应 6-18h; 加入 1.8- 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的或细胞裂解液或菌 体重悬液的表达 7(3-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌� �体， 用氢氧化钠调节 pH至 6.5-8.5 ， 25°C, 反应 6-18h;

[0110] ( 12) 牛磺熊去氧胆酸的制备

[0111] 将步骤 ( 11) 转化完成的反应液， 旋蒸至膏状， 加入 2-10倍的无水乙醇或 95% 乙醇， 离心或过滤去除沉淀， 上清液经干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品， 把牛磺 熊去氧胆酸粗品， 使用乙腈溶解， 0.22um滤膜过滤除去不溶物形成上柱液； 将 所述上柱液使用制备型高效液相制备设备注入 装填硅胶层析填料的高压不锈钢 柱中； 然后使用不同浓度甲醇 -水流动相进行逐步洗脱， 将收集的洗脱液倒入旋 转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠状， 同时回收甲醇； 然后置于真空干燥箱内干 燥， 采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆 酸的纯度。

[0112] 第二方面， 本申请实施例提供了一种上述方法在制备熊去 氧胆酸中的应用。

[0113] 本申请实施例提供的生物转化制备牛磺熊去氧 胆酸的方法应用的有益效果在于 : 将生物转化法制备的牛磺熊去氧胆酸转化液中 ， 进行碱裂解制备熊去氧胆酸 ， 避免了化学法合成熊去氧胆酸中大量有机溶剂 的使用； 且该方法反应时间短 ， 反应温和可控， 操作简单。

[0114] 在一些实施例中， 所述制备过程如下： 在转化生成的牛磺熊去氧胆酸溶液中加 入氢氧化钠调节 pH至 8-11， 升温至 80-100°C， 反应 18-24h， 降温至 1(M5°C， 加盐 酸调节 pH至 3-5 , 析出熊去氧胆酸。 在生物转化法制备的牛磺熊去氧胆酸转化液 中， 加入氢氧化钠调节 pH至 8-11进行碱裂解， 然后加盐酸中和， 析出熊去氧胆 酸， 避免了化学法合成熊去氧胆酸中大量有机溶剂 的使用； 反应时间短， 反应 温和可控， 操作简单。

[0115] 以上生物转化反应过程中， 底物的浓度为 20-250g/L。

[0116] 以上所有酶均可以为液体酶或固定化酶， 也可以是全细胞、 未经纯化的酶或纯 化的酶。 [0117] 下面结合具体实施例进行说明。

[0118] 下述具体实施例中， 重组质粒的构建方法具体如下：

[0119] 1.单基因表达载体的构建

[0120] a)含有 7a-类固醇脱氢酶基因的重组质粒 pETDuet-l-7a-HSDH的制备

[0121] 将来源于 Campylobacter hyointestinalis

的 7a-类固醇脱氢酶基因 (DNA序列： SEQ ID NO:l , 编码的蛋白质序列： SEQ

ID NO:2) , 用引物对 (SEQ ID

NO:13) 5 CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-31^ (SEQ ID NO: 14) 5 -CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3通过 PCR进行扩增， 用 BamH I和 EcoR I酶切， 用 Dpn l酶消化模板。 用：8&11111 1和£0^ 1酶切 £701^-1载体。 用 连接酶连接 7oc-类固醇脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄 抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌 体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0122] b)含有乳酸脱氢酶基因的重组质粒 pETDuet-1-LDH的制备

[0123] 将来源于 的乳酸脱氢酶基因 (DNA序列： SEQ ID NO:3 , 编码的蛋白质 序列： SEQ ID NO:4) 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3 口 (SEQ ID NO:16 ) 5 -TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde l 和 Ava l酶切， 用 Dpn l酶消化模板。 将 pETDuet-1质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用连 接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用 天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0124] c)含有 7(3 -类固醇脱氢酶基因的重组质粒 pETDuet-l-7(3-HSDH的制备

[0125] 将来源于 Collins ella aerofaciens ATCC 2598(5的 7(3-类固醇脱氢酶基因的突变子

(A78C, V116C) (DNA序歹 ij: SEQ ID NO:5 , 编码的蛋白质序列： SEQ ID NO:6) 用引物对 (SEQ ID

NO:17) 5 CGGGATCCATGGGCAGCAGCCATCATCA-31^ (SEQ ID NO: 18) 5 -CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3通过 PCR进行扩增， 用 BamH I 和 EcoR I酶切， 用 Dpn l酶消化模板。 用 BamH I和 EcoR I酶切 pETDuet-1载体。 用 连接酶连接 7(3 -类固醇脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄 抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌 体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0126] d)含有葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒 pETDuet-1-GDH的制备

[0127] 将来源于 的葡萄糖脱氢酶基因 (DNA序歹 ij : SEQ ID

NO:7 , 编码的蛋白质序列： SEQ ID NO:8) 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3 口 (SEQ ID NO: 19 ) 5 TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde I和 Ava I酶切， 用 Dpn I酶消化模板。 将 pETDuet-1质粒用 Nde I和 Ava I酶切 ， 用连接酶连接乳酸脱氢酶片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性 的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0128] 2.双基因共表达载体的构建

[0129] a)含有 7a-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶基因的重组质粒 pETDuet-l-7a-HSDH/LD

H的制备

[0130] 将来源于 的乳酸脱氢酶基因用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-31^ (SEQ ID

用 Nde I和 Ava I酶切， 用 Dpn

I酶消化模板。 将上述测序正确的 pETDuet-l-7a-HSDH质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用连接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗 性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体 ， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0131] b)含有 7(3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因的重组质� � pETDuet-l-7(3-HSDH/G

DH的制备

[0132] 将来源于 Bacillus subtilis (strain 7 j的葡萄糖脱氢酶基因用引物对 (SEQ ID NO:15) 5 GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-31^ (SEQ ID NO:19) 5 -TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3通过 PCR进行 扩增， 用 Nde I和 Ava l酶切， 用 Dpn

I酶消化模板。 将上述测序正确的 pETDuet-l-7(3-HSDH质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用连接酶连接乳酸脱氢酶片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用 天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0133] 3.单基因表达融合蛋白载体的构建

[0134] a)7a-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因重组� ��粒 pETDuet-l-(LDH-Linker-7a-

HSDH)的制备

[0135] 将 7a-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因 (DNA序列： SEQ ID NO:9 , 编码的 蛋白质序列： SEQ ID NO: 10) 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3 口 (SEQ ID NO:14 ) 5 -CGGAATTCTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3通过 PCR进行扩增， 用 BamH I 和 EcoR I酶切， 用 Dpn I酶消化模板。 用 BamH I和 EcoR I酶切 pETDuet-1载体。 用 连接酶连接 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因基因� �段和载体。 连接产物 转化 DH5a， 涂布在氨苄抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB 中进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存 测序正确的质粒。

[0136] b)7(3-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因重 组质粒 pETDuet-l-(GDH-Linker-

7(3-HSDH)的制备

[0137] 将 7(3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因 (DNA序列： SEQ ID NO:l l， 编 码的蛋白质序列： SEQ ID NO: 12) 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGATGGGCAGCAGCCATCATCA-31^5 (SEQ ID NO: 18) CGGAATTCTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3通过 PCR进行扩增， 用 BamH I和 EcoR I酶切， 用 Dpn I酶消化模板。 用 BamH I和 EcoR I酶切 pETDuet-1 载体。 用连接酶连接 7(3-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因基� �片段和载体 。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种 到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测 序。 保存测序正确的质粒。

[0138] 4.单基因融合蛋白与脱氢酶共表达表达载体的� ��建

[0139] a)含有 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与乳� �脱氢酶基因共表达的重组 质粒 pETDuet-l-(LDH-Linker-7a-HSDH)/LDH的制备

[0140] 将来源于 Human的乳酸脱氢酶基因用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3 口 (SEQ ID NO:16 ) 5 -TCCCTCGAGTTAAAACTGCAGTTCTTTCT-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde l 和 Ava I酶切， 用 Dpn

I酶消化模板。 将 pETDuet-l-(LDH-Linker-7a-HSDH)质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用 连接酶连接乳酸脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性 的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0141] b)含有 7(3-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与� �萄糖脱氢酶基因共表达的 重组质粒 pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/GDH的制备

[0142] 将来源于 Bacillus subtilis (strain 7 )的葡萄糖脱氢酶基因用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3 口 (SEQ ID NO:19 ) 5 TCCCTCGAGTTAACCACGACCGGCCTGAAAGCT-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde I和 Ava I酶切， 用 Dpn I酶消化模板。 将 pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH) 质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用连接酶连接葡萄糖脱氢酶片段和载体。 连接产物转 化 DH5a， 涂布在氨苄抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中 进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测 序正确的质粒。

[0143] 5.单基因融合蛋白与类固醇脱氢酶共表达表达� ��体的构建

[0144] a)含有 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶单基因与 7oc-类固醇脱氢酶基因共表达 的重组质粒 pETDuet-l-(LDH-Linker-7a-HSDH)/7a-HSDH的制备

[0145] 将来源于 Campylobacter hyointestinalis

的 7oc-类固醇脱氢酶基因， 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3和 (SEQ ID NO:20 ) 5 TCCCTCGAGTTATTTAAAGGTGGTGCCA-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde I 和 Ava I酶切， 用 Dpn

I酶消化模板。 将 pETDuet-l-(LDH-Linker-7a-HSDH)质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用 连接酶连接 7oc-类固醇脱氢酶基因片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄 抗性的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌 体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0146] b)含有 7(3-类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶单基因与 7(3 -类固醇脱氢酶基因共表 达的重组质粒 pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)/7(3-HSDH的制备

[0147] 将来源于 Collinsella aerofaciens ATCC 259 的 7(3-类固醇脱氢酶基因的突变子

(A78C , V116C) 用引物对 (SEQ ID

NO:15) 5 GGAATTCCATATGGGCAGCAGCCATCATCA-3和 (SEQ ID NO:21 ) 5 TCCCTCGAGTTAGTCACGGTAGAAAGAAC-3通过 PCR进行扩增， 用 Nde I和 Ava I酶切， 用 Dpn

I酶消化模板。 将 pETDuet-l-(GDH-Linker-7(3-HSDH)质粒用 Nde I和 Ava I酶切， 用 连接酶连接 7(3 -类固醇脱氢酶片段和载体。 连接产物转化 DH5oc， 涂布在氨苄抗性 的 LB平板进行筛选。 挑选单克隆， 接种到 5mL LB中进行过夜培养。 收集菌体， 用天根质粒提取试剂盒提取质粒， 送测序。 保存测序正确的质粒。

[0148] 实施例 1含有重组质粒的大肠杆菌在三角瓶中发酵表� �

[0149] 取 20pL含有重组质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)菌种， 接种至 200mL氨苄抗性 LB培 养基中， 37°C, 220rpm, 过夜培养， OD600值为 2.5-4.0。 取 20mL培养液接种至 1 L氨苄抗性培养基中， 37°C, 140rpm, 培养 3小时， OD600值为 1时， 加入 0.5mM IPTG诱导过夜表达。 离心收集菌体。 取少量菌体重悬于 100mM磷酸盐缓冲液中 ， 超声破碎， 得到粗酶液。 按照技术方案中的方法测定酶活。

[0150] 实施例 2含有重组质粒的大肠杆菌在发酵罐中发酵表� �

[0151] 取 20pL含有重组质粒的大肠杆菌 BL21(DE3)菌种， 接种至 200mL氨苄抗性 LB培 养基中， 37°C, 220rpm, 过夜培养， OD600值为 2.5-4.0。 取 20mL培养液接种至 1 L氨苄抗性培养基中， 37°C, 140rpm, 过夜培养。 将 10L种子液无菌接种至装有 2 00L大肠杆菌高密度发酵培养基的发酵罐中， 37°C, 通气搅拌培养 8小时。 大肠 杆菌高密度发酵培养基含有： 18g/L的十二水磷酸氢二钾， 6.8g/L的磷酸二氢钾 ， 0.7g/L的无水硫酸钠， 0.48g/L的硫酸镁， 2.25g/L的甘油， 2.5g/L的酵母粉， 5g/ L的蛋白胨。 通气搅拌培养 8小时后， 向发酵罐中加入终浓度为 O.lmM的 IPTG溶 液进行诱导， 诱导 l（M2h后发酵结束， 放液， 离心收集菌体并 4°C保存。 取少量 菌体重悬于 lOOmM磷酸盐缓冲液中， 超声破碎， 得到粗酶液。 按照技术方案中 的方法测定酶活。

[0152] 实施例 3 1L反应体系中用单基因表达蛋白转化牛磺熊去� ��胆酸

[0153] 将 250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于 700mL的 lOOmM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.25mM 的 NAD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的 7oc-类固醇脱氢酶 （含纯酶约 5g） 和乳酸脱氢酶 （含纯酶约 2g ） ， 补加 lOOmM甘氨酸缓冲液至 1L， 用 5M

NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 加入 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或 部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的 7（3-类固醇脱氢酶 （含纯酶约 5g） 和葡萄糖脱氢酶 （含纯酶约 2g） 的大肠杆菌， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 底物转化率在 98%以上， 成品含量在 96.8%以上， 收率大于 85%。

[0154] 实施例 4 1L反应体系中用双基因共表达蛋白转化牛磺熊� ��氧胆酸

[0155] 将 250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于 700mL的 lOOmM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.25mM 的 NAD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的共表达 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶 （含酶量共约 10g） ， 补 力口 lOOmM甘氨酸缓冲液至 1L， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 力口 入 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液 或菌体重悬液 的共表达 7（3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶 （含酶量共约 10g） ， 用 5M NaOH调 节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 底物转化率在 98%以上， 成品含量在 96.8%以上 ， 收率大于 85%。

[0156] 实施例 5 1L反应体系中用单基因表达融合蛋白转化牛磺� ��去氧胆酸

[0157] 将 250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于 700mL的 lOOmM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.25mM 的 NAD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶 （含酶量约 5g） ， 补加 100m M甘氨酸缓冲液至 1L， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 加入 100g/L 的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液 或菌体重悬液的 7（3 -类 固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶 （含酶量约 5g） ， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C ， 反应 6-18h。 底物转化率在 99.7%以上， 成品含量在 96.8%以上， 收率大于 85%

[0158] 实施例 6 1L反应体系中用单基因融合蛋白与脱氢酶共表� ��蛋白转化牛磺熊去氧 胆酸

[0159] 将 250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于 700mL的 100mM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.20mM 的 NAD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的共表达 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶与乳酸脱氢� � （含酶 量共约 7g） ， 补加 100mM甘氨酸缓冲液至 1L， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 加入 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的共表达 7（3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢酶与葡萄糖脱� �酶 （ 含酶量共约 7g） ， 用 5M

NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 底物转化率在 98.5%以上， 成品含量在 96 .8%以上， 收率大于 85%。

[0160] 实施例 7 1L反应体系中用单基因融合蛋白与类固醇脱氢� ��共表达蛋白转化牛磺 熊去氧胆酸

[0161] 将 250g牛磺鹅去氧胆酸溶解于 700mL的 100mM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.50mM 的 NAD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解 液或菌体重悬液的共表达 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶与 7oc-类固醇脱氢酶 （ 含酶量共约 7g） ， 补加 100mM甘氨酸缓冲液至 1L， 用 5M

NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 加入 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或 部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的 共表达 7（3 -类固醇脱氢酶融合葡萄 糖脱氢酶与 7（3-类固醇脱氢酶 （含酶量共约 7g） ， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25 °C, 反应 6-18h。 底物转化率在 99.5%以上， 成品含量在 96.8%以上， 收率大于 85 %。

[0162] 实施例 8 100L反应体系中单基因表达融合蛋白转化牛磺� �去氧胆酸 [0163] 将 25Kg牛磺鹅去氧胆酸溶解于 70L的 lOOmM甘氨酸缓冲液中， 加入 0.25mM的 N AD ⁺ ， 加入 60g/L的丙酮酸钠， 加入纯化后的或部分纯化的酶液或细胞裂解液 或 菌体重悬液的 7oc-类固醇脱氢酶融合乳酸脱氢酶 （含酶量约 500g） ， 补加 lOOmM 甘氨酸缓冲液至 100L， 用 5M

NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 加入 100g/L的葡萄糖， 加入纯化后的或 部分纯化的酶液或细胞裂解液或菌体重悬液的 7（3 -类固醇脱氢酶融合葡萄糖脱氢 酶 （含酶量约 500g） ， 用 5M NaOH调节 pH至 7.5。 25°C, 反应 6-18h。 底物转化 率在 99.5%以上， 成品含量在 96.8%以上， 收率大于 85%。

[0164] 实施例 3-8中 7oc-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的用量、 7（3 -类固醇脱氢酶和葡萄糖 脱氢酶的用量、 NAD ⁺ 加入量以及底物转化率如下表 1所示。

[0165] 表 1

[] [表 1]

[0166] 实施例 9牛磺熊去氧胆酸的制备

[0167] 将上述转化完成的反应液， 旋蒸至膏状， 加入 10倍体积的无水乙醇或 95%乙醇 ， 离心或过滤去除沉淀。 上清液经真空干燥即得牛磺熊去氧胆酸粗品。 把反应 后的牛磺熊去氧胆酸粗品， 使用乙腈溶解粗品， 0.22um滤膜过滤除去不溶物形 成上柱液； 将所述上柱液使用制备型 HPLC注入装填 C18硅胶填料的高压不锈钢 柱中 （柱子规格 15*255mm） ; 然后使用 30%甲醇-水溶液配制的流动相 A注入不 锈钢柱中进行洗脱， 洗脱速度为 240mL/h， 洗脱时间为 175分钟， 收集洗脱液 1 ; 再将流动相梯度在 50分钟内线性提升至 50%流动相 B （80%甲醇-水溶液） 进行洗 脱， 保持 50%流动相 B洗脱 75分钟， 收集洗脱液 2; 将洗脱梯度在 40分钟内线性 提升至 100%流动相 B， 保持 100%流动相 B洗脱 70分钟， 收集洗脱液 3 ; 将收集的 洗脱液倒入旋转蒸发仪内进行旋转蒸发至粘稠 状， 同时回收甲醇； 然后置于真 空干燥箱内干燥， 采用高效液相色谱法测定样品中牛磺熊去氧胆 酸胆酸的纯度 ， 以质量分数计， 其中洗脱液 1中牛磺熊去氧胆酸含量为 5.77%， 回收率为 8.2%

， 洗脱液 2中牛磺熊去氧胆酸含量为 99.3%， 回收率为 81.5%， 洗脱液 3中牛磺熊 去氧胆酸含量为 14.9% , 回收率为 10.3%。 实施例 9制备得到的牛磺熊去氧胆酸的 HPLC图谱如图 3所示。

[0168] 实施例 10熊去氧胆酸的制备

[0169] 向上述转化完成的反应液中， pH至 10， 升温至 100°C， 反应 24h， 降温至 10°C， 加盐酸调节 pH至 4, 析出熊去氧胆酸。 即得熊去氧胆酸粗品。

[0170] 以上仅为本申请的可选实施例而已， 并不用于限制本申请。 对于本领域的技术 人员来说， 本申请可以有各种更改和变化。 凡在本申请的精神和原则之内， 所 作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本申请的权利要求范围之内。