Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H202-generierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats, insbesondere zur enzymatischen Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin.

Sulfinsäuren sind eine Klasse von chemischen Verbindungen mit organisch gebundenem Schwefel und Sauerstoff der allgemeinen Struktur R-S(=0)-OH, wobei R ein organischer Rest ist. Die Grundsubstanz Sulfinsäure besitzt die Struktur H-S(=0)-OH und ist tautomer zur Sulfoxylsäure HO-S-OH. Die Salze der Sulfinsäuren sind die Sulfinate.

Sulfonsäuren sind organische Schwefelverbindungen mit der allgemeinen Struktur R-SO2-OH, wobei R ein organischer Rest ist. Ihre Salze und Ester mit der allgemeinen Struktur R-S020 bzw. R1-SO2-O-R2 (Ri, R2 jeweils organische Reste) heißen Sulfonate .

Die Umwandlung von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren ist chemisch durch Oxidation, z.B. mit Peroxiden, möglich (siehe z.B. Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255- 6259) . In der chemischen Industrie ist eine mögliche enzymatische Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren nicht von Bedeutung, ist jedoch für biotechnologische Verfahren zur Herstellung in der Natur vorkommender Sulfonsäuren aus den korrespondierenden Sulfinsäuren von Interesse.

Zu den in der Natur vorkommenden Sulfinsäuren gehören z.B. L- Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin. Zu den in der Natur vorkommenden Sulfonsäuren gehören z.B. L-Cysteinsäure und Taurin.

Taurin (2-Aminoethansulfonsäure, CAS-Nummer 107-35-7) ist eine Aminosulfonsäure, die natürlicherweise in der Natur als Abbauprodukt der Aminosäuren Cystein und Methionin vorkommt. Taurin hat wirtschaftliche Bedeutung, ist z.B. Bestandteil von Energiedrinks und wird auch in der Tiernahrung, z.B. für Katzen oder in der Fischzucht (Salze and Davis, Aquaculture (2015) 437: 215-229), eingesetzt. Taurin werden jedoch auch gesundheitsfördernde Effekte zugeschrieben (Ripps and Shen, Molecular Vision (2012) 18: 2673-2686).

Für den kommerziellen Gebrauch wird Taurin gegenwärtig chemisch hergestellt. Bekannt ist z.B. ein Verfahren der Fa. Changshu Yudong Chemical Factory, das von Ethylen ausgeht und über Ethylenimin zum Taurin führt. Mit dem von Konsumentenwünschen beförderten Trend weg von chemisch hergestellten Inhaltsstoffen werden zunehmend biotechnologische Verfahren zur Herstellung von Taurin untersucht .

In der Natur kommt Taurin fast ausschließlich im Tierreich vor, mit nur wenigen Beispielen für ein Vorkommen in Pflanzen, Algen oder Bakterien. Es gibt verschiedene biosynthetische Wege zum Taurin (siehe z.B. die KEGG Pathway Datenbank: „Taurine and hypotaurine metabolism"), u.a. ausgehend von L- Cystein. Die wichtigsten Syntheseschritte, die von L-Cystein zu Taurin führen, sind in den Gleichungen (1) bis (5) dargestellt .

(1) L-Cystein + O2 -> L-Cysteinsulfinsäure

(2) L-Cysteinsulfinsäure + t O2 -> L-Cysteinsäure

(3) L-Cysteinsulfinsäure -> Hypotaurin + CO2

(4) Hypotaurin + t O2 -> Taurin

(5) L-Cysteinsäure -> Taurin + CO2 (1): In einem ersten Schritt wird L-Cystein durch das Enzym Cysteindioxygenase (CDO, EC 1.13.11.20) zu L- Cysteinsulfinsäure (3-Sulfinoalanin, CAS Nummer 207121-48-0) oxidiert .

(3) und (5): Cysteinsulfinatdecarboxylase (CSAD, EC 4.1.1.29) decarboxyliert L-Cysteinsulfinsäure zu Hypotaurin (2- Aminoethansulfinsäure, CAS Nummer 300-84-5) und kann in einer ähnlichen Reaktion L-Cysteinsäure zu Taurin decarboxylieren.

(2) und (4): Bisher nicht eindeutig geklärt ist die Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure sowie die Oxidation von Hypotaurin zu Taurin.

Ein Nachteil der bekannten biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von Taurin liegt darin, dass Hypotaurin im allgemeinen das Hauptprodukt ist. Soll Taurin das Produkt sein, so muss auf chemische Verfahren zur Oxidation von Hypotaurin zurückgegriffen werden.

Honjoh et al. (2010), Amino Acids 38: 1173-1183 beschreiben einen gentechnisch veränderten Hefestamm, der die CDO- und CSAD-Gene aus Karpfen (Cyprinus carpio) heterolog exprimiert. Hauptprodukt war Hypotaurin und daneben ein geringerer Anteil an Taurin. Beide Produkte wurden intrazellulär akkumuliert.

Für die Produktanalyse war daher ein Zellaufschluss erforderlich. Hypotaurin konnte in Zellextrakten für analytische Zwecke chemisch durch Behandlung mit H2O2 zu Taurin oxidiert werden. Es wurde kein Verfahren beschrieben, wie Hypotaurin in einem nicht-chemischen Schritt für die weitere Verwendung zu Taurin umgewandelt werden kann.

WO 17/213142 Al (Ajinomoto) beschreibt einen Taurin produzierenden Stamm, der durch heterologe Expression einer Cystein Dioxygenase und einer L-Cysteinsulfinsäure Decarboxylase in einem ursprünglich Cystein-produzierenden Stamm erhalten wurde. Hauptprodukt war Hypotaurin mit max. 450 mM Ausbeute, das nur durch nachträgliche chemisch-alkalische Behandlung und auch nur in geringer Ausbeute zu Taurin umgewandelt werden konnte.

US 2019-0062757 Al (KnipBio) beschreibt heterologe Produktionsstämme zur Herstellung von Taurin oder seiner Vorläufersubstanzen, wobei die offenbarten Produktionsstämme in der Mehrzahl kein einheitliches Produktprofil aufwiesen und die besten Ausbeuten für Hypotaurin erzielt wurden. Die erzielten Ausbeuten waren darüberhinaus mit max. 419 ng/ml Hypotaurin, ohne nachweisbares Taurin, sehr gering.

Die im Stand der Technik offenbarten biotechnologischen Ansätze zur Herstellung von Taurin haben neben den geringen Ausbeuten den Nachteil eines uneinheitlichen Produktspektrums, wobei Hypotaurin als Hauptprodukt und Taurin nur als Nebenprodukt anfällt.

Einen Ansatz zur enzymatischen Oxidation von Hypotaurin offenbaren Veeravalli et al. (2020), bioRxiv Preprint Server doi: https://doi.org/10.1101/750273. Sie beschreiben die Flavin-abhängige Monooxygenase 1 (EM01) aus Säugern als ein

Enzym für die Konversion von Hypotaurin zu Taurin. Die Oxidation verläuft nach Gleichung (6):

(6) Hypotaurin + NAD(P)H + 0 ₂ -> Taurin + NAD(P) + H ₂ 0

Von dem Enzym EM01 aus Säugern zur Konversion von Hypotaurin zu Taurin nach Gleichung (6) ist nicht bekannt, ob es sich auch zur Oxidation anderer Sulfinsäuren der Formel H ₂ N-CH(R)- CH ₂ -S0 ₂ H eignet.

Zur Oxidation von Hypotaurin verwendet EM01 in stöchiometrischen Mengen die Cofaktoren NADH oder NADPH. Der Einsatz dieser kommerziell teuren Cofaktoren macht den technischen Einsatz unwirtschaftlich. Weiterhin ist für das in Säugern identifizierte EMOl kein für die großtechnische Produktion geeignetes Herstellungsverfahren bekannt. Somit ist keine Wirtschaftlichkeit für die enzymatische Oxidation unter Verwendung des EMOl-Enzyms gegeben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein wirtschaftlich günstiges biotechnologisches Verfahren zur Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren, insbesondere von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin bereitzustellen.

Gelöst wurde die Aufgabe durch ein Verfahren zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H zu Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H mit einem Enzym ausgewählt aus der Klasse der H202-generierenden Oxidasen in Gegenwart ihres Substrats. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Aminoalkylsulfinsäure, besonders bevorzugt 2- Aminoalkylsulfinsäure handelt. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfonsäure um Aminoalkylsulfonsäure, besonders bevorzugt 2-

Aminoalkylsulfonsäure handelt. Besonders bevorzugt handelt es ich bei der Sulfinsäure um Aminoalkylsulfinsäure und bei der Sulfonsäure um Aminoalkylsulfonsäure.

Der Rest R kann beliebig sein und ist bevorzugt Wasserstoff, ein organischer, linearer, verzweigter, cyclischer, gesättigter oder ungesättigter, aromatischer oder heteroaromatischer Rest, mit oder ohne Substituenten. Das bedeutet, dass die Reste R substituiert oder unsubstituiert sein können. Bevorzugte Substituenten sind -CN, -NCO, -NR2, - COOH, -COOR, -Halogen, -(Meth)acryl, -Epoxy, -SH, -OH, -CONR _2, -O-R, -CO-R, -COO-R, -OCO-R, oder -OCOO-R, -S-R, -NR-, -N=R, - N=N-R, oder -P=R. Vorzugsweise werden gesättigte oder ungesättigte Reste mit C ₁ -C ₄ -, besonders bevorzugt Ci-C ₄ -Alkyl, Vinyl, insbesondere Methyl oder Ethyl, im speziellen Methyl eingesetzt. R ist bevorzugt ausgewählt aus R = H oder R = CO2H, d.h. es ist bevorzugt, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin oder Cysteinsulfinsäure handelt. Insbesondere bevorzugt ist R = H.

Von der Erfindung betroffen ist somit auch die enzymatische Oxidation von L-Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure und von Hypotaurin zu Taurin als Verfahrensschritt einer biotechnologischen Herstellung von Taurin.

Unter dem Substrat des Enzyms ausgewählt aus der Klasse der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidasen ist der Stoff zu verstehen, der durch die Oxidase oxidierbar ist. Die Oxidase reagiert mit ihrem oxidierbaren Substrat nach der Formel (7).

(7) Substrat + O2 -> Substrat _(OX) + H2O2

Die durch die H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase katalysierte Gesamtreaktion erfolgt nach der Gleichung (8):

(8) Substrat + 0 ₂ + H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -S0 ₂ H ->

Substrat _(ox) + H ₂ 0 ₂ + H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -S0 ₂ H ->

Substrat _(ox) + H ₂ 0 + H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -S0 ₃ H

Geeignete H ₂ 0 ₂ -generierende Oxidasen sind in der „KEGG Enzyme" Datenbank unter dem Suchbegriff „Oxidase" als Teilmenge der dort aufgeführten Enzyme zu finden. Aus der Vielzahl der H2O2- generierenden Oxidasen sind für den verfahrenstechnischen Einsatz allerdings nur solche Oxidasen von Interesse, die ein kostengünstiges Substrat verwenden, um durch dessen Oxidation nach Gleichung (7) H2O2 zu generieren.

Beispiele bevorzugter geeigneter H ₂ 0 ₂ -generierender Oxidasen und nicht auf diese beschränkt sind Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5), Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), Sekundäralkoholoxidase (EC 1.1.3.18), Pyranoseoxidase (EC 1.1.3.10), L-Lactatoxidase (EC 1.1.3.2), Arylalkoholoxidase (EC 1.1.3.7), Galactoseoxidase (EC

1.1.3.9), L-Sorboseoxidase (EC 1.1.3.11), Aldehydoxidase (EC

1.2.3.1), Pyruvatoxidase (EC 1.2.3.3 oder EC 1.2.3.6), Oxalatoxidase (EC 1.2.3.4), Glyoxylatoxidase (EC 1.2.3.5), L- Aminosäureoxidase (EC 1.4.3.2), D-Aminosäureoxidase (EC

1.4.3.3 oder EC 1.4.3.1), Sulfitoxidase (EC 1.8.3.1), Thioloxidase (EC 1.8.3.2).

Besonders bevorzugte H ₂ 0 ₂ - enerierende Oxidasen sind Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4), Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5), Alkoholoxidase (EC 1.1.3.13), Sekundäralkoholoxidase (EC 1.1.3.18), Pyranoseoxidase (EC 1.1.3.10), L-Lactatoxidase (EC

1.1.3.2) .

Bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren aus diesem Grund dadurch gekennzeichnet, dass die Kombination aus H2O2- generierender Oxidase und ihrem oxidierbaren Substrat ausgewählt ist aus Glucoseoxidase/Glucose,

Alkoholoxidase/Methano1 , Alkoholoxidase/Ethanol, Sekundäralkoholoxidase/Isopropanol und L-Lactatoxidase/Lactat.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase um Alkoholoxidase handelt und als Substrat ein primärer Alkohol, besonders bevorzugt Methanol, vorhanden ist. D.h. es handelt sich bei der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase um ein Enzym der mit Alkoholoxidasen bezeichneten Klasse EC 1.1.3.13 der KEGG-Datenbank .

Alkohole sind Verbindungen der allgemeinen Formel R-OH mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, die keine funktionelle Gruppe mit einer höheren Priorität besitzen. Man unterscheidet Alkohole nach der Zahl der C- und H-Atome an dem C-Atom der funktionellen Gruppe, an das auch die Hydroxygruppe gebunden ist. Bei primären Alkoholen sind an dieses C-Atom neben einem C-Atom zwei H-Atome gebunden, so dass sich die allgemeine Formel RCH2OH ergibt. Zudem wird ein primärer Alkohol durch Oxidation zu einem Aldehyd. Beispielsweise wird aus Ethanol unter Abspaltung von 2 H-Atomen das Aldehyd Ethanal.

Zu den bevorzugten primären Alkoholen zählen Methanol und Ethanol, besonders bevorzugt handelt es sich beim primären Alkohol um Methanol.

Im Falle der Alkohole ist R ein Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl- Rest, jedoch kein Aryl-Rest, Acyl-Rest oder ein Heteroatom.

In einer alternativ bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der H2O2- generierenden Oxidase um Glucoseoxidase handelt und als Substrat Glucose vorhanden ist. D.h. es handelt sich bei der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase um ein Enzym der mit Glucoseoxidase bezeichneten Klasse EC 1.1.3.4 der KEGG-Datenbank.

Voraussetzung für die technische Umsetzung des Verfahrens ist die Verfügbarkeit der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase sowie ein kostengünstiges oxidierbares Substrat.

H ₂ 0 ₂ -generierende Oxidasen sind herstellbar z.B. durch Kultivierung eines geeigneten Produktionsstammes, der die betreffende Oxidase natürlicherweise produziert (homologe Produktion) oder infolge Expression eines geeigneten rekombinanten Genkonstrukts in einem Wirtsorganismus (heterologe Produktion). Darüber hinaus sind verschiedene H2O2- generierende Oxidasen kommerziell verfügbar, was sich positiv auf die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens auswirken kann. Beispiele für kommerziell verfügbare Oxidasen sind Alkoholoxidase AOX aus der Hefe Pichia pastoris (erhältlich z.B. von Sigma-Aldrich) oder Glucoseoxidase GOX aus dem Pilz Aspergillus niger (erhältlich z.B. von Sigma-Aldrich aus homologer wie heterologer Produktion). Ein weiteres Beispiel einer kommerziell verfügbaren Glucoseoxidase ist das unter dem Markennamen Gluzyme ^® vertriebene Enzym (Novozymes) für Anwendungen z.B. in der Backindustrie. Es ist bevorzugt, dass die tbC^-generierende Oxidase fermentativ hergestellt wird.

Für die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens ist darüber hinaus die kostengünstige Verfügbarkeit des Substrats der H2O2- generierenden Oxidase entscheidend. Im Falle der AOX Alkoholoxidase ist das Substrat ein primärer Alkohol, bevorzugt ausgewählt aus Methanol oder Ethanol. Das AOX Enzym generiert H2O2 mit Methanol nach Reaktion (9):

(9) Methanol + O2 -> Formaldehyd und H2O2

Im Falle der Glucoseoxidase GOX ist das Substrat D-Glucose.

Das GOX Enzym generiert H2O2 mit D-Glucose nach Reaktion (10):

(10) D-Glucose + O2 -> D-Glucono-1,5-Lacton + H2O2

Ein Verfahren im Sinne der Erfindung ist definiert als eine mehrstufige Abfolge von Arbeitsschritten, wo in einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Reaktionsansätzen in einer vorab definierten Reihenfolge ein Edukt (Ausgangsstoff) über die durch die Reaktionsbedingungen festgelegten Zwischenprodukte in das Produkt umgewandelt wird.

Ein biotechnologisches Verfahren im Sinne der Erfindung ist definiert als die Nutzung von Enzymen, Zellen oder ganzen Organismen in technischen Anwendungen zur Herstellung chemischer Verbindungen, wie z.B. der Herstellung von Taurin aus Hypotaurin unter Verwendung einer Glucoseoxidase. Im Gegensatz zu biotechnologischen Verfahren stehen Verfahren, die sich durch chemische Verfahrensschritte auszeichnen.

Ein Ansatz oder Reaktionsansatz ist definiert als Mischung aus Edukt (Ausgangsstoff), Enzym und ggf. weiteren Reaktanden, bei dem das Edukt unter definierten Bedingungen in ein Produkt überführt wird. Ein Ansatz oder Reaktionsansatz der vorliegenden Erfindung umfasst mindestens eine Sulfinsäure der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₂ H, mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Klasse der fhCh-generierenden Oxidasen, das durch die Oxidase oxidierbare Substrat und Luftsauerstoff O ₂ .

Biotransformation ist definiert als Überführung eines Edukts in das Produkt unter enzymatischer Katalyse. Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Biotransformation.

Die Ausbeute der Reaktion kann angegeben werden als Volumenausbeute in absoluter, auf das Volumen bezogene Menge Produkt (mM oder g/L) oder als relative Ausbeute von Produkt in Prozent des eingesetzten Edukts (unter Berücksichtigung der Molekulargewichte des Edukts und des Produkts), auch bezeichnet als prozentuale Ausbeute. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet die molare Ausbeute, ausgedrückt in Prozent, die molare Gesamtmenge an Sulfonsäure der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₃ H nach der enzymatischen Oxidation durch eine H ₂ 0 ₂ -generierende Oxidase in Gegenwart ihres Substrats im Verhältnis zur Summe der in diese Reaktion eingesetzten molaren Menge an Sulfinsäure der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₂ H und Sulfonsäure der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -S0 ₃ H.

Fermentation ist ein Verfahrensschritt zur Herstellung von Zellkulturen, bei dem ein mikrobieller Produktionsstamm unter definierten Bedingungen von Kulturmedium, Temperatur, pH, Sauerstoffzufuhr und Mediumsdurchmischung zum Wachstum gebracht wird. Ziel der Fermentation ist, abhängig von der Konfiguration des Produktionsstamms, die Produktion eines Proteins/Enzyms und/oder eines Stoffwechselprodukts, jeweils mit möglichst hoher Ausbeute, für die weitere Verwendung in einem Verfahren.

Die Enzymaktivität wird angegeben in U/ml, wobei 1 U/ml definiert ist als der Umsatz von 1 pmol Substrat/min in 1 ml Testansatz unter Testbedingungen. Als offener Leserahmen (open reading frame, ORF, gleichbedeu tend mit cds, coding sequence) wird derjenige Bereich der DNS bzw. RNS bezeichnet, der mit einem Startcodon beginnt und mit einem Stoppcodon endet und für die Aminosäuresequenz eines Proteins codiert. Der ORF wird auch als codierende Region oder Strukturgen bezeichnet.

Als Gen oder Expressionseinheit wird der DNS-Abschnitt bezeichnet, der alle Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven RNS enthält. Ein Gen enthält den DNS- Abschnitt, von dem durch Transkription eine einzelsträngige RNS-Kopie hergestellt wird und die Expressionssignale, die an der Regulation dieses Kopiervorgangs beteiligt sind. Zu den Expressionssignalen zählen z.B. mindestens ein Promotor, ein Transkriptions-, ein Translationsstart und eine Ribosomenbindestelle. Des Weiteren sind als Expressionssignale ein Terminator und ein oder mehrere Operatoren möglich.

Eine mRNS, auch messenger-RNS oder Boten-RNS genannt, ist eine einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNS), welche die genetische Information für den Aufbau eines Proteins trägt. Mit einer mRNS steht die Bauanleitung für ein bestimmtes Protein in einer Zelle zur Verfügung. Das mRNS-Molekül trägt die zum Proteinaufbau notwendige Botschaft aus der Erbinformation (DNS) an die proteinaufbauenden Ribosomen. In einer Zelle wird es gebildet als Transkript eines zu einem Gen gehörenden Teilabschnitts der DNS. Die in der DNS gespeicherte genetische Information wird dabei nicht verändert.

Gene eukaryotischer Organismen sind überwiegend sog.

Mosaikgene und enthalten im Gegensatz zu prokaryotischen Genen auch nichtcodierende Abschnitte, sog. Introns (engl. intragenic regions). Codierende Sequenzen, sog. Exons (engl. expressed regions) sind DNS-Abschnitte eines eukaryotischen Gens, die nach der Transkription in RNS von den Ribosomen in die Aminosäure-Sequenz eines Proteins übersetzt werden. Die Introns werden nach der Transkription der DNS zur RNS aus dem Primärtranskript gespleißt. Die von Introns befreite proteincodierende RNS wird als messenger-RNS (mRNS), auch als „reife" mRNS bezeichnet. Diese wird weiteren Modifikationen wie dem Capping und der Polyadenylierung unterzogen. Der codierende Bereich der reifen mRNS wird dann in die Proteinsequenz übersetzt. Soll ein eukaryotisches Gen mit Exon/Intronstruktur in prokaryotischen Organismen exprimiert werden, ist es notwendig, die Proteinsequenz oder den codierenden Bereich der reifen mRNS in Intron-freie DNS zurückzuübersetzen, da bei Prokaryoten die Prozessierung der Exon/Intronstruktur nicht stattfindet. Wenn im Rahmen dieser Erfindung von aus der Proteinsequenz oder der mRNS abgeleiteten Gensequenzen die Rede ist, ist genau dieser Prozess der Rückübersetzung gemeint. Es ist bevorzugt, dass gleichzeitig mit der Rückübersetzung der mRNS-Sequenz in DNS- Sequenz eine Sequenzoptimierung, d.h. Anpassung an die Codon- Nutzung des entsprechenden Prokaryoten erfolgt (Codon- Optimierung) .

Ein Operon ist definiert als übergeordnete Expressionseinheit, bei der mehrere Gene unter Kontrolle nur eines Promotors transkribiert, aber von jeweils einer eigenen Ribosomenbindestelle translatiert werden.

Als Genkonstrukt wird im Rahmen der Erfindung ein zirkuläres DNS-Molekül (Plasmid, Vektor) bezeichnet, bei dem mindestens ein Gen verknüpft ist mit weiteren genetischen Elementen (z.B. Promotor, Ribosomenbindestelle (RBS), Terminator, Selektionsmarker, Replikationsursprung). Die genetischen Elemente des Genkonstrukts bewirken seine extrachromosomale Vererbung während des Zellwachstum und die Produktion des vom Gen codierten Proteins. Wie in den Beispielen 1 und 2 der vorliegenden Erfindung offenbart, sind tbC^-generierende Oxidasen in Kombination mit ihrem oxidierbaren Substrat dazu geeignet, Sulfinsäuren wie z.B. L-Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin zu den korrespondierenden Sulfonsäuren L-Cysteinsäure, bzw. Taurin zu oxidieren. Diese Beobachtung war neu und überraschend. Nach dem Stand der Technik, wenn auch weitgehend nur im analytischen Maßstab untersucht (siehe z.B. Chauvin and Pratt, Angew. Chem. Int. Ed. (2017) 56: 6255-6259), ist H2O2 grundsätzlich zur Oxidation von Sulfinsäuren zu Sulfonsäuren geeignet. Für eine quantitative Reaktion muss H2O2 nach Gleichung (8) jedoch mindestens in stöchiometrischen Mengen eingesetzt werden, so dass für die Herstellung größerer Mengen einer Sulfonsäure entsprechend große Mengen H2O2 erforderlich sind. Obwohl H ₂ 0 ₂ -generierende Oxidasen lange bekannt sind, war es für den Fachmann daher nicht abzusehen, ob die aus der Alkoholoxidase-Reaktion bzw. der Glucoseoxidase-Reaktion gebildete Menge H2O2 ausreichend ist, um größere Mengen der Sulfinsäuren zu oxidieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit nicht nur den Vorteil, dass es sich um ein biotechnologisches Verfahren handelt, sondern auch, dass es in technischem Maßstab umsetzbar ist und es sich dabei um ein wirtschaftlich günstiges Verfahren handelt, da es keine teuren Cofaktoren benötigt .

Wie in Beispiel 3 erstmals offenbart und nach dem Stand der Technik nicht zu erwarten, wurde z.B. Hypotaurin in einer für die chemische Synthese relevanten Konzentration von 20 g/L durch Glucoseoxidase/Glucose überraschend praktisch quantitativ zu Taurin oxidiert. Damit stellt die Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Verfügung, welches für die immer stärker nachgefragte nachhaltige Produktion von Sulfonsäuren wie z.B. Taurin, unter Vermeidung chemischer Syntheseschritte, für die Verwendung im Lebensmittel-, Futtermittel- oder Pharmabereich geeignet ist. Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um 2-Aminoethansulfinsäure (Hypotaurin) und bei der entstehenden Sulfonsäure um 2- Aminoethansulfonsäure (Taurin) handelt.

Das erfindungsgemäße enzymatische Verfahren zur Oxidation einer Sulfinsäure zur Sulfonsäure wird bevorzugt bei einer Temperatur von 15°C bis 80°C durchgeführt, besonders bevorzugt von 20°C bis 60°C und insbesondere bevorzugt von 25°C bis 50°C.

Der pH, bei dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann, hängt ab von den enzymatischen Eigenschaften der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase. Wie in den Beispielen beschrieben, wurde die Reaktion der Alkoholoxidase bei pH 7,5 und die der Glucoseoxidase bei pH 5,5 durchgeführt. Der pH-Bereich, bei dem die Reaktion bevorzugt durchgeführt wird, beträgt pH 3,0 bis pH 8,5, besonders bevorzugt pH 4,0 bis pH 8,0 und insbesondere bevorzugt pH 4,5 bis pH 7,5.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Zufuhr von Luftsauerstoff durchgeführt, entweder durch passiven Eintrag, wie er durch Durchmischung des Reaktionsansatzes z.B. auf einem Inkubationsschüttler erfolgt, oder durch aktiven Eintrag, wie er durch Begasung mit Druckluft erfolgt.

Die Dosierung der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt neben Parametern wie Temperatur, pH und Sauerstoffeintrag den Umsatz der Reaktion und wird so gewählt, dass die Reaktion bei möglichst geringer Dosierung der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase in möglichst kurzer Zeit erfolgt. Die Dosierung der H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase wie z.B. der Glucoseoxidase beträgt bevorzugt 1 U/ml bis 200 U/ml, besonders bevorzugt 2 U/ml bis 150 U/ml und insbesondere bevorzugt 4 U/ml bis 100 U/ml. Das durch die PhC^-generierende Oxidase oxidierbare Substrat wird, bezogen auf den molaren Gehalt der Sulfinsäure, bevorzugt mindestens in äquimolarer Menge im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt (molares Verhältnis

Sulfinsäure :oxidierbares Substrat bevorzugt mindestens 1:1). Besonders bevorzugt ist ein molares Verhältnis Sulfinsäure :oxidierbares Substrat von mindestens 1:2 und insbesondere bevorzugt von mindestens 1:5.

Die Reaktionsdauer ist abhängig von der Dosierung der H2O2- generierenden Oxidase und beträgt bevorzugt maximal 72 h, besonders bevorzugt maximal 48 h und insbesondere bevorzugt maximal 24 h.

Als Lösemittel für die Reaktion wird bevorzugt Wasser verwendet .

Die Konzentration der Sulfinsäure im Ansatz beträgt bevorzugt mindestens 1 g/L, besonders bevorzugt mindestens 10 g/L und insbesondere bevorzugt mindestens 20 g/L.

Der molare Umsatz der Sulfinsäure zur Sulfonsäure in der erfindungsgemäßen Biotransformation beträgt bevorzugt mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 % und insbesondere bevorzugt mindestens 90 %.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Oxidation von Sulfinsäuren kann in diskontinuierlicher oder kontinuierlicher Weise betrieben werden. Im diskontinuierlichen Betrieb (Batch Betrieb) werden dem Ansatz im Verlauf der Reaktion alle Reaktanden zugeführt und nach Beendigung der Reaktion der Ansatz aufgearbeitet.

Im kontinuierlichen Betrieb wird das Oxidase-Enzym als stationäre Phase vorgelegt, z.B. in einem Membranreaktor oder an einen Träger immobilisiert und die Substrate umfassend eine Sulfinsäure und ein durch die ThCh-generierende Oxidase oxidierbares Substrat als mobile Phase mit der stationären Phase in Kontakt gebracht. Die Kontaktzeit der mobilen Phase mit der stationären Phase wird dabei bevorzugt so eingestellt, dass die Sulfinsäure zum Produkt Sulfonsäure abreagieren kann.

Bevorzugt ist der diskontinuierliche (Batch) Betrieb.

Die Sulfonsäure aus der erfindungsgemäßen enzymatischen Oxidation kann entweder ohne weitere Aufarbeitungsschritte direkt weiterverwendet oder aber mittels bekannter Methoden angereichert oder gereinigt werden. Dabei ist der Grad der Anreicherung abhängig von der weiteren Verwendung.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfonsäure, besonders bevorzugt Taurin aus dem Reaktionsansatz isoliert wird.

Methoden zur Isolierung von Sulfonsäuren, im speziellen von Taurin, sind dem Fachmann aus Verfahren zur Isolierung z.B. von Aminosäuren bekannt. Sie umfassen z.B. Filtration, Zentrifugation, Extraktion, Adsorption, Ionenaustauscher- Chromatographie, Präzipitation, Kristallisation.

Das erfindungsgemäße Verfahren offenbart einen neuen und unerwarteten Weg zur enzymatischen Oxidation von Sulfinsäuren zu den entsprechenden Sulfonsäuren und ist insbesondere geeignet für die biotechnologische Herstellung von L- Cysteinsäure und Taurin.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Gehalt an Sulfinsäure (Edukt) und Sulfonsäure (Produkt) zu Beginn, zu verschiedenen Zeiten während der Reaktion und am Ende der Reaktion bestimmt, um den Reaktionsfortschritt zu verfolgen. Der Gehalt einer Lösung oder Zellkultur an Sulfinsäure der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ - SO2H wie beispielsweise der Hypotauringehalt oder der Gehalt an Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie beispielsweise der Tauringehalt kann wie folgt bestimmt werden:

Der Gehalt kann direkt aus einem Aliquot des Ansatzes quantifiziert werden, sofern die Konzentration des Sulfinsäure-Edukts zu Beginn der Reaktion mindestens 0,1 g/L beträgt, entsprechend einer äquivalenten Konzentration des Sulfonsäure-Produkts am Ende der Reaktion bei vollständigem Umsatz, bestimmt z.B. durch HPLC. Dazu wird dem Ansatz ein Aliquot von 1 ml entnommen, 5 min bei 80 °C inkubiert, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch 5 minütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für die betreffende Sulfinsäure oder Sulfonsäure kalibrierte HPLC quantifiziert, wie z.B. in Beispiel 1 für Hypotaurin und Taurin beschrieben. Ist die Konzentration des Sulfinsäure- Edukts zu Beginn der Reaktion geringer als 0,1 g/L, kann die Probe zur Erhöhung der Messgenauigkeit sowohl für das Sulfinsäure-Edukt wie das Sulfonsäure-Produkt vorher aufkonzentriert werden, z.B. durch Eindampfen der Probe und Wiederauflösen in einem geeigneten Volumen H2O (z.B. 10 % des Probenvolumens, entsprechend einer 10-fachen Konzentrierung).

Wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine Sulfinsäure-haltige Kulturbrühe eingesetzt, so kann diese direkt in die Quantifizierung eingesetzt werden. Alternativ ist es auch möglich, zuerst die Zellen z.B. durch Zentrifugation oder Filtration aus der Kulturbrühe zu entfernen und den resultierenden Sulfinsäure-haltigen Zellkulturüberstand im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Es ist auch möglich, die Sulfinsäure mittels an sich bekannter Methoden aus dem Zellkulturüberstand zu isolieren und die aufgereinigte Sulfinsäure im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen. Als Nachweis des erfindungsgemäßen Verfahrens und zur Bestimmung des Umsatzes, kann folgender Biotransformationsassay dienen:

Die Sulfinsäure-haltige Lösung oder Kultur wie z.B. Hypotaurin-haltige Kulturbrühe, bevorzugt Fermenterbrühe, bzw. der entsprechende Zellkulturüberstand, die gereinigte oder kommerziell erhältliche Sulfinsäure wie z.B. Hypotaurin wird verwendet, um einen Biotransformationsansatz herzustellen. Der Biotransformationsansatz im Labormaßstab hat ein Ansatzvolumen von 10 ml und enthält mindestens 0,1 g/L Sulfinsäure (wie oben beschrieben aus der Kultur/Kulturbrühe/Fermenterbrühe, dem abzentrifugierten Kulturüberstand oder als gereinigte Substanz und entsprechend quantifiziert oder als entsprechend dosiertes kommerzielles Produkt). Das Ansatzvolumen kann auch in Abhängigkeit vom Produktionsmaßstab höher sein und beträgt z.B. im präparativen Maßstab mindestens 1 L. Die H2O2- generierende Oxidase, bevorzugt AOX oder GOX, und das durch diese Oxidase oxidierbare Substrat werden zugegeben, sodass die Dosierung der Enzymaktivität mindestens 1 U/ml, beträgt. Wenn AOX verwendet wird, wird als Substrat des AOX-Enzyms mindestens 1 % (v/v) Methanol, d.h. mindestens 0,1 ml auf 10 ml Reaktionsansatz zugegeben. Als Substrat des GOX-Enzyms wird Glucose in einer Dosierung von mindestens 10 g/L dem Reaktionsansatz zugegeben. Der Biotransformationsansatz wird mit Luftsauerstoff versorgt, entweder passiv durch Mischung z.B. auf einem Inkubationsschüttler oder mit einem Rührer, jeweils unter Luftzutritt oder aktiv durch Einträgen von Pressluft, bzw. von reinem Sauerstoff mit und ohne Mischung. Der pH der Reaktion beträgt 7,5, sofern AOX verwendet wird.

Der pH der Reaktion beträgt 5,5, sofern GOX verwendet wird.

Der pH des Ansatzes kann konstant gehalten werden, indem er z.B. mit einer pH-Elektrode ausgestattet wird, welche mit einer pH-Kontrolleinheit verbunden ist, die aus einer Bürette ein Korrekturmittel (Lauge oder Säure) zudosiert (sog. pH-Stat Verfahren) . Die Reaktionstemperatur beträgt 25°C (AOX) oder 30°C (GOX). Der Reaktionsfortschritt kann durch Verbrauch des Edukts Hypotaurin und Bildung des Produkts Taurin verfolgt werden, wobei die quantitative Bestimmung von Hypotaurin und Taurin z.B. durch HPLC erfolgen kann. Entsprechend des Reaktionsfortschritts wird der Zeitpunkt des Reaktionsendes gewählt. Bevorzugt wird das Reaktionsende gewählt, wenn die molare Ausbeute an Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie beispielsweise Taurin mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% beträgt. Die im Reaktionsansatz gebildete Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H steht dann zur weiteren Verwendung zur Verfügung.

Sulfinsäuren können aus chemischer oder fermentativer Herstellung stammen, wobei es bevorzugt ist, dass die in das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Sulfinsäure aus fermentativer Herstellung stammt. Besonders bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses aus fermentativer Herstellung stammt. Wenn die Sulfinsäuren der Formel H2N-CH(R)- CH2-SO2H wie z.B. Hypotaurin aus fermentativer Herstellung stammt und aus dieser im erfindungsgemäßen Verfahren eine Sulfonsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie z.B. Taurin gebildet wird, ist der große Vorteil, dass mittels der vorliegenden Erfindung ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Sulfonsäuren der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO3H wie z.B. von Taurin zur Verfügung gestellt wird. Dieses Verfahren erfordert keine chemischen Reaktionsschritte.

Geeignet zur Produktion von Sulfinsäuren der Formel H ₂ N-CH(R)- CH ₂ -SO ₂ H wie z.B. Hypotaurin sind Bakterienstämme (z.B. E. coli, Corynebakterium glutamicum, Pantoea ananatis, Bacillus subtllls), Algen (z.B.Chlamydomonas reinhardtii), Hefen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia llpolytlca) oder Pilze (z.B. Aspergillus niger). Wenn es sich bei der Sulfinsäure der Formel H2N-CH (R)-CH2-SO2H um Hypotaurin handelt, wird ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm verwendet. Ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm ist gekennzeichnet dadurch, dass er einen Stoffwechselweg enthält, der nach einem der in der KEGG Pathway Datenbank „Taurine and hypotaurine metabolism" angegebenen Stoffwechselwege zu Hypotaurin führt. Da die Biosynthese von Hypotaurin entsprechend der Gleichungen (1) und (3) von L-Cystein ausgeht, ist ein Mikroorganismenstamm bevorzugt, der auch zur Cysteinproduktion geeignet ist. Wie z.B. von Wada und Takagi, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2006) 73: 48-54 beschrieben, ist die Cysteinproduktion in einem Wildtyp-Mikroorganismus strikt reguliert, sodass ein Mikroorganismenstamm mit einem reguliertem Cystein-Biosyntheseweg, wie im Stand der Technik dokumentiert, für die Produktion wirtschaftlich verwertbarer Mengen Hypotaurin nicht geeignet ist. Bevorzugt ist daher ein zur Hypotaurinproduktion geeigneter Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg.

Ein Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein- Biosyntheseweg und damit zur Cystein-Produktion geeignet ist dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine der folgenden Veränderungen aufweist: a) Der Mikroorganismenstamm zeichnet sich durch ein verändertes serA-Gen aus, codierend für eine 3- Phosphoglycerat Dehydrogenase (SerA) mit einer im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym um mindestens den Faktor zwei verminderten Feedback-Hemmung durch L-Serin (wie beispielsweise beschrieben in EP 1950 287 Bl), wobei die SerA-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch die vom SerA-Substrat 3-Phosphohydroxypyruvat abhängige Oxidation von NADH wie z.B. von McKitrick und Pizer, J. Bacteriol. (1980) 141: 235 - 245 beschrieben.

Besonders bevorzugte Varianten der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (serA) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch L-Serin auf. und/oder b) Der Mikroorganismenstamm enthält ein verändertes cysE-Gen, codierend für eine Serin-O-Acetyl-Transferase (CysE), die im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor zwei verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein aufweist (wie beispielsweise beschrieben in EP 0858 510 Bl oder Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611), wobei die CysE-Enzymaktivität z.B. photometrisch bestimmt werden kann durch den Verbrauch des CysE-Substrats Acetyl-CoA infolge der Reaktion mit L-Serin zu O-Acetyl-L-Serin, wie z.B. von Nakamori et al., Appl. Env. Microbiol. (1998) 64: 1607-1611 beschrieben. Besonders bevorzugte Varianten der Serin-O-Acetyl-Transferase (cysE) weisen im Vergleich zum entsprechenden Wildtypenzym eine um mindestens den Faktor 5, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 10 und in einer darüber hinausgehend bevorzugten Ausführung um mindestens den Faktor 50 verminderte Feedback-Hemmung durch Cystein auf. und/oder c) Der Mikroorganismenstamm weist einen durch Überexpression eines Effluxgens um mindestens den Faktor zwei erhöhten Cystein-Export aus der Zelle im Vergleich zu der entsprechenden Wildtypzelle auf, wobei der Cystein-Export bestimmt werden kann durch photometrische Messung des extrazellulären Cystein-Gehalts nach Gaitonde, Biochem. J. (1967) 104: 627 - 633 (umfassend Cystein, Cystin und das aus Cystein und Pyruvat gebildete Addukt 2-Methyl- Thiazolidin-2,4- (R)-dicarbonsaure), wie z.B. in EP 0885 962 Bl beschrieben.

Die Überexpression eines Effluxgens führt im Vergleich zu einer Wildtypzelle bevorzugt zu einem um mindestens den Faktor 5, besonders bevorzugt um mindestens den Faktor 10, insbesondere bevorzugt um mindestens den Faktor 20 erhöhten Cystein-Export aus der Zelle. Das Effluxgen stammt vorzugsweise aus der Gruppe ydeD (siehe EP 0885 962 Bl), yfiK (siehe EP 1382 684 Bl), cydDC (siehe WO 2004/113373 Al), bcr (siehe US 2005-221453 AA) und emrAB (siehe US 2005-221453 AA) von E. coli oder dem entsprechend homologen Gen aus einem anderen Mikroorganismus .

Der zur Hypotaurinproduktion geeignete Mikroorganismenstamm wird entsprechend dem Stand der Technik, bevorzugt durch Fermentation, zur Produktion von Hypotaurin eingesetzt. Es entsteht eine Hypotaurin-haltige Kulturbrühe, bevorzugt Fermenterbrühe. Der Gehalt an Hypotaurin und ggf. Taurin als Nebenprodukt kann aus der Kulturbrühe quantifiziert werden. Dazu wird der Kulturbrühe mit einer Zelldichte OD ₆ oo/nil von mindestens 1,0/ml ein Aliquot von 1 ml entnommen, 5 min bei 80 °C inkubiert, anschließend alle festen Bestandteile beispielsweise durch 5 minütiges Zentrifugieren bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge abgetrennt und der Überstand durch für Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC quantifiziert, wie z.B. in Beispiel 1 für Hypotaurin und Taurin beschrieben.

Der Fachmann kann mittels Isotopenanalyse feststellen, ob ein Stoff wie beispielsweise Hypotaurin, den er als Sulfinsäure in das Verfahren einsetzen will, aus chemischer oder fermentativer Herstellung stammt. Ein zur Unterscheidung geeignetes Verfahren der Isotopenanalyse ist z.B. in Sieper et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. (2006) 20: 2521-2527 beschrieben und beruht auf der Bestimmung der Isotopenverhältnisse für z.B. C oder N, welche verschieden sind, je nachdem ob ein Produkt aus chemischer (Erdöl basierter) oder natürlicher (Pflanzen-basierter) Herstellung stammt. Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren zur Herstellung von Hypotaurin zählt dabei zu den Verfahren natürlicher (Pflanzen-basierter) Herstellung, da die zur Anzucht des Produktionsstammes verwendete Glucose entsprechend dem Stand der Technik aus pflanzlicher Produktion stammte.

Unter homologen Genen, Proteinen bzw. homologen Sequenzen ist zu verstehen, dass die DNS- oder Aminosäure-Sequenzen dieser Gene, DNS-Abschnitte oder Proteine zu mindestens 70%, bevorzugt zu mindestens 80% und besonders bevorzugt zu mindestens 90% identisch sind.

Der Grad der DNA-Identität wird durch das Programm „nucleotide blast", zu finden auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, bestimmt, welches auf dem blastn-Algorithmus basiert. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Nukleotidsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust Parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die entsprechenden voreingestellten Scoring Parameter sind: Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linear.

Für den Vergleich von Proteinsequenzen wird das Programm „protein blast", auf der Seite http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, genutzt. Dieses Programm greift auf den blastp-Algorithmus zurück. Als Algorithmus-Parameter für ein Alignment zweier oder mehrerer Proteinsequenzen wurden die voreingestellten Parameter genutzt. Die voreingestellten generellen Parameter sind: Max target sequences = 100; Short queries = "Automatically adjust parameters for short input sequences"; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0. Die voreingestellten Scoring Parameter sind: Matrix = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score matrix adjustment.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses Hypotaurin aus bakterieller Herstellung stammt, d.h. mit Hilfe eines bakteriellen Produktionsstamms hergestellt wurde. Beim bakteriellen Produktionsstamm handelt es sich bevorzugt um einen Stamm der Art Escherichia coli.

Der bevorzugte bakterielle Produktionsstamm zeichnet sich darüberhinaus dadurch aus, dass er zur Cystein-Produktion geeignet ist. Zur Cystein-Produktion geeignete und bevorzugte Stämme sind die in den Beispielen offenbarten Stämme E. coli K12 W3110 x pCys und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys. Wie in Beispiel 5 der vorliegenden Erfindung offenbart, führt die heterologe Expression eines CDO-Gens, kodierend für eine Cystein-Dioxygenase und eines CSAD-Gens, kodierend für eine Cysteinsulfinsäure-Decarboxylase in dem aus W3110 x pCys abgeleiteten Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs sowie in dem aus W3110-ppsA-MHI x pCys abgeleiteten Stamm W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs zur Produktion von Hypotaurin und es wird nur wenig Taurin gebildet.

Bei einem mit ppsA-MHI bezeichneten Mikroorganismenstamm, ist dieser dadurch gekennzeichnet, dass diesem die kodierende Sequenz des Wt-ppsA-Gens fehlt und diese durch die ppsA-MHI cds, SEQ ID NO: 9 ersetzt wurde, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 10. ppsA bezeichnet das Gen, das ein Protein mit der Enzymaktivität der in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichneten Enzymklasse codiert. Das entsprechende Protein wird auch bezeichnet mit PpsA oder als Phosphoenolpyruvat-Synthase (PEP-Synthase) oder auch synonym als Phosphoenolpyruvat-H ₂ 0-Dikinase. Die Enzymklasse ist dadurch definiert, dass sie in einer reversiblen Reaktion Pyruvat aus Phosphoenolpyruvat herstellen kann gemäß der Formel:

(11) Phosphoenolpyruvat +Phosphat + AMP <-> Pyruvat + H2O + ATP Wie in Beispiel 6 offenbart, kann das Hypotaurin aus diesen Ansätzen durch Verwendung einer Glucoseoxidase zusammen mit D- Glucose in bisher nicht bekannter Weise vollständig zu Taurin umgewandelt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht somit die biotechnologische Herstellung von Taurin durch eine Kombination der biosynthetischen Herstellung von Hypotaurin mit dessen enzymatischer Oxidation zu Taurin.

In einer Weiterführung und Vereinfachung des Verfahrens ist es auch denkbar, die H ₂ 0 ₂ -generierende Oxidase im Hypotaurin- Produktionsstamm zu exprimieren. Gene für geeignete H2O2- generierende Oxidasen können in Datenbanken wie NCBI (National Center for Biotechnology Information) identifiziert werden.

Ein Beispiel für eine heterolog in E. coli produzierte Glucoseoxidase ist das GOX-Gen aus Penicillium amagasakiense (Witt et al., App. Environ. Microbiol (1998) 64: 1405 - 1411).

Bevorzugt ist ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von Taurin, bei dem in einem ersten Schritt Hypotaurin durch Anzucht eines Produktionsstammes hergestellt wird und in einem zweiten Schritt das gebildete Hypotaurin ohne weitere Aufarbeitung enzymatisch zu Taurin oxidiert wird, wobei die enzymatische Oxidation von Hypotaurin zu Taurin durch Glucoseoxidase/D-Glucose besonders bevorzugt ist. In den Beispielen der vorliegenden Erfindung sind die biotechnologische Herstellung von Hypotaurin (Beispiel 5) und dessen enzymatische Oxidation zu Taurin (Beispiel 6) offenbart .

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Hypotaurin handelt und dieses Hypotaurin aus bakterieller Herstellung stammt, d.h. mit Hilfe eines bakteriellen Produktionsstamms hergestellt wurde, der einen deregulierten Cystein- Biosyntheseweg aufweist. Für den Mikroorganismenstamm mit dereguliertem Cystein-Biosyntheseweg gilt die oben gegebene Definition .

Besonders bevorzugt wird zuerst Cystein hergestellt, welches entsprechend der Gleichung (1) durch das im Produktionsstamm enthaltene CDO-Enzym weiter zu Cysteinsulfinsäure (CDO- Reaktion) und entsprechend der Gleichung (3) durch das ebenfalls im Produktionsstamm enthaltene CSAD-Enzym zu Hypotaurin (CSAD-Reaktion) reagiert.

Besonders bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um mittels eines bakteriellen Produktionstamms hergestelltes Hypotaurin und beim Produktionsstamm um einen der Stämme E. coli K12 W3110 x pCYS- CDOrn-CSADhs oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCYS-CDOrn- CSADhs, besonders bevorzugt um den Stamm E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCYS-CDOrn-CSADhs handelt.

Die Erfindung zeigt somit auch Produktionsstämme zur biotechnologischen Herstellung von Hypotaurin. Besonders bevorzugter Ausgangsstamm ist einer der zur Cysteinproduktion geeigneten Stämme E. coli K 12 W3110 x pCys E. coli K 12 W3110-ppsA-MHI x pCys. Wie in Beispiel 4 der vorliegenden Erfindung beschrieben, wurde der Vektor pCys (Fig. 1) um die Gene für Cystein Dioxygenase aus Rattus norvegicus (CDOrn),

SEQ ID NO: 1, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 und für L-Cysteinsulfinsäure Decarboxylase aus Homo sapiens (CSADhs), SEQ ID NO: 3, nt 1 bis nt 1509, kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresquenz SEQ ID NO: 4 erweitert. Es entstand der zur Hypotaurin-Produktion geeignete Vektor pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2).

Dabei ist das verwendete CDO-Gen nicht auf die Spezies Rattus norvegicus beschränkt. Es ist jedes CDO-Gen geeignet, dessen aus der mRNS abgeleitetes Genprodukt (Protein) nach Gleichung (1) geeignet ist, L-Cystein zu L-Cysteinsulfinsäure zu oxidieren. Solche Proteine sind z.B. in der NCBI-Datenbank zu finden, wenn man in der „Protein" Unterdatenbank unter dem Suchbegriff „Cysteine Dioxygenase" nach CDO-Proteinen sucht. Weitere aus dem Stand der Technik bekannte CDO-Proteine und nicht auf diese beschränkt sind bevorzugt das CDO-Protein aus Homo sapiens (Mensch), Cyprinus carpio (Karpfen) oder Synechococcus (Alge) oder ein Protein mit dazu zu 70% homologer Aminosäuresequenz, besonders bevorzugt ein Protein mit dazu zu 80% homologer Aminosäuresequenz und insbesondere bevorzugt hat die Aminosäuresequenz des CDO-Proteins die in SEQ ID NO: 2 angegebene Sequenz und wird codiert durch die in SEQ ID NO: 1 angegebene DNS-Sequenz.

Desgleichen ist das verwendete CSAD-Gen nicht auf die Spezies Homo sapiens beschränkt. Es ist jedes CSAD-Gen geeignet, dessen aus der mRNS abgeleitetes Genprodukt (Protein) nach Gleichung (3) geeignet ist, L-Cysteinsulfinsäure zu Hypotaurin zu decarboxylieren. Solche Proteine sind z.B. in der NCBI- Datenbank zu finden, wenn man in der „Protein" Unterdatenbank unter dem Suchbegriff „Cysteine Sulfinic Acid Decarboxylase" nach CSAD-Proteinen sucht. Weitere aus dem Stand der Technik bekannte CSAD-Proteine und nicht auf diese beschränkt sind bevorzugt das CSAD-Protein aus Rattus norvegicus (Ratte), Cyprinus carpio (Karpfen), Synechococcus (Alge) oder E coli oder ein Protein mit dazu zu 70% homologer Aminosäuresequenz, besonders bevorzugt ein Protein mit dazu zu 80% homologer Aminosäuresequenz und insbesondere bevorzugt hat die Aminosäuresequenz des CSAD-Proteins die in SEQ ID NO: 4 angegebene Sequenz und wird codiert durch die in SEQ ID NO: 3 von nt 1-1509 angegebene DNS-Sequenz.

Ein Genkonstrukt enthaltend das CDO- und CSAD-Gen, wie beispielsweise besonders bevorzugt das Konstrukt pCys-CDOrn- CSADhs kann entsprechend dem Stand der Technik mit Hilfe von dem Fachmann bekannten rekombinanten DNS-Techniken hergestellt werden, wie z.B. in Beispiel 4 detailliert beschrieben.

Dazu werden ein CDO-Gen, das für die Cystein-Dioxygenase codiert, und ein CSAD-Gen, das für eine Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase codiert, in einen hierfür geeigneten Vektor kloniert. Grundsätzlich ist jeder Vektor geeignet, mit dem sich das CDO- und das CSAD-Gen in einem Produktionsstamm exprimieren lassen.

Zur Herstellung eines das CDO- und CSAD-Gen enthaltenden Genkonstrukts können das CDO- und CSAD-Gen jeweils mit eigenem Promotor und ggf. Terminator als eigenständige Expressionseinheiten oder aber auch, in beliebiger Reihenfolge, als Operon unter Kontrolle nur eines Promotors in den Vektor kloniert werden. Weiterhin möglich ist eine Operonstruktur, bei der das CDO- und CSAD-Gen, jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle, hinter eines der sich bereits auf dem Vektor befindlichen Gene kloniert und unter Kontrolle des Promotors des betreffenden Gens exprimiert werden. Für das CDO- und das CSAD-Gen sind darüber hinaus alle weiteren denkbaren Kombinationen aus Expression unter eigenem Promotor und als Operon möglich.

Ebenso denkbar ist, das CDO- und CSAD-Gen als eigene Expressionseinheiten unabhängig von dem eine deregulierte Cystein Biosynthese gewährleistenden Vektor wie z.B. pCys in einen eigenen Vektor zu klonieren, bzw. ins Genom eines Wirtsorganismus wie E. coli zu integrieren.

Für die Expression des CDO- und CSAD-Gens bevorzugt ist die Form eines künstlichen Operons jeweils mit eigener Ribosomenbindestelle (RBS), aber ohne eigenen Promotor.

Besonders bevorzugt handelt es sich beim Vektor um pCys-CDOrn- CSADhs, bei dem das CDO- und das CSAD-Gen hinter das in pCys enthaltene serA317-Gen kloniert werden, so dass ihre Expression unter Kontrolle des serA317-Promotors erfolgt entsprechend einer Reihenfolge der Expressionseinheiten: serA- Promotor-> (serA317-cds)->RBS-(CDOrn-cds)->RBS-(CSADhs-cds)- rrnB-Terminator . Dabei ist eine Konfiguration der Expressionseinheiten, bei der die CSAD-cds vor der CDO-cds angeordnet ist, ebenso möglich. pCys-CDOrn-CSADhs zeichnet sich darüber hinaus dadurch aus, dass er eine deregulierte Cystein-Biosynthese gewährleistet, indem er Expressionseinheiten für die Feedback-resistente Variante serA317 der 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase (serA- Gen), die Feedback-resistente Variante CysEX der Serin-O- Acetyl-Transferase (cysE-Gen) sowie das ydeD-Gen eines Cystein-Efflux Proteins umfasst. Von der Erfindung betroffen sind Vektoren, die mindestens eines, bevorzugt zwei und besonders bevorzugt drei der Gene serA317, cysEX oder ydeD enthalten, wobei die betroffenen Gene in beliebiger Auswahl und Reihenfolge auf dem Vektor enthalten sein können.

Wenn CDO und CSAD in einen Vektor kloniert wurden, wird dieser anschließend in bekannter Weise in einen geeigneten Wirtsstamm transformiert. Als Wirtsstamm eignet sich jeder Mikroorganismus, der rekombinanten DNS-Techniken zugänglich ist und der für eine fermentative Herstellung von rekombinanten Proteinen geeignet ist. Bevorzugter Wirtsstamm ist ein Stamm der Art Escherichia coli, besonders bevorzugt der Stamm E. coli K12 W3110 oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI. Die aus der Transformation erhaltenen Stämme wie besonders bevorzugt W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs oder W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs sind zur Produktion von Hypotaurin geeignet, wie in Beispiel 5 beschrieben.

Die Herstellung von Hypotaurin unter Verwendung von besonders bevorzugt einem der Stämme E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn- CSADhs oder E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs kann dabei durch Anzucht im Schüttelkolben erfolgen (wie in Beispiel 5 beschrieben) oder im Produktionsmaßstab durch Fermentation des Stammes.

Das gebildete Hypotaurin wird im erfindungsgemäßen Verfahren durch enzymatische Oxidation zu Taurin umgewandelt. Dazu wird die Hypotaurin-haltige Zellkultur mit einer H ₂ 0 ₂ -generierenden Oxidase in Gegenwart ihres Substrats wie beispielsweise mit einer Glucoseoxidase in Gegenwart von Glucose inkubiert (siehe Beispiel 6).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Sulfinsäure um Cysteinsulfinsäure und bei der entstehenden Sulfonsäure um Cysteinsäure handelt.

Bevorzugt ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die molare Ausbeute an Sulfonsäuren der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₃ H bezogen auf die eingesetzte additive molare Konzentration an Sulfinsäuren der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₂ H und Sulfonsäuren der Formel H ₂ N-CH (R)-CH ₂ -SO ₃ H mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 80% und insbesondere bevorzugt mindestens 90% beträgt. Bevorzugt beträgt dabei die eingesetzte Menge Sulfinsäure mindestens 1 mM (109,2 mg/L), besonders bevorzugt mindestens 10 mM (1,1 g/L) und insbesondere bevorzugt mindestens 100 mM (10,9 g/L).

Um den Wert der molaren Ausbeute zu bestimmen, werden der molare Gehalt der in die enzymatische Oxidation eingesetzten Sulfin- und Sulfonsäuren zu Beginn und am Ende der Reaktion mittels HPLC wie im Stand der Technik bekannt bestimmt. Beispielsweise kann die Bestimmung erfolgen, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Molekulargewichte 109,2 g/Mol für Hypotaurin und 125,2 g/Mol für Taurin berücksichtigt werden. Der molare Gehalt Sulfonsäure im Ansatz am Ende der Reaktion im Verhältnis zum aufsummierten molaren Gehalt aus Sulfinsäure und Sulfonsäure zu Beginn der Reaktion ergibt die molare Ausbeute der Sulfonsäure, ausgedrückt in Prozent.

Die Figuren zeigen die in den Beispielen verwendeten Plasmide. Fig. 1: pCys.

Fig. 2: pCys-CDOrn-CSADhs.

Fig. 3: pKD46.

Fig. 4: pKan-SacB.

In den Figuren verwendete Abkürzungen : bla: Gen, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht

(ß-Lactamase) kanR: Gen, das Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht araC: araC-Gen (Repressorgen)

P araC: Promotor des araC-Gens

P araB: Promotor des araB-Gens

Garn: Lambda Phage Gam-Rekombinationsgen

Bet: Lambda Phage Bet-Rekombinationsgen

Exo: Lambda Phage Exo-Rekombinationsgen

ORI101: Temperatur-sensitiver Replikationsursprung

RepA: Gen für das Plasmid-Replikationsprotein A sacB: Levansucrase-Gen pr-f: Bindungsstelle f für Primer (vorwärts) pr-r: Bindungsstelle r für Primer (revers) OriC: Replikationsursprung C

TetR: Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin verleiht

P15A ORI: Replikationsursprung serA317 : serA (3-Phosphoglycerat Dehydrogenase-Gen, codiert für Aminosäure 1 bis 317) cds cysE X: cysE (Serin-O-Acetyltransferase-Gen, Feedback resistent) eds

ORF306: ydeD (Cystein Efflux-Gen) eds Seal: Schnittstelle für das Restriktionsenzym Seal PpuMI: Schnittstelle für das Restriktionsenzym PpuMI CDOrn: CDO (Cystein Dioxygenase) R. norvegicus eds CSADhs: CSAD (Cysteinsulfinsäure Decarboxylase) H. sapiens eds

RBS: Ribosomenbindestelle

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne diese auf sie zu beschränken.

Beispiele

Beispiel 1: Oxidation von Hypotaurin und Cysteinsulfinsäure mit Alkoholoxidase (AOX)

A) Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure mit AOX:

Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne AOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg L-Cysteinsulfinsäure x H2O (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 9,9 ml 100 mM Na- Phosphat, pH 7,5 gelöst und 0,1 ml Methanol

(Endkonzentration 1%, v/v) zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 30 mΐ kommerziell erhältlicher AOX aus Pichia pastoris (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die AOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml.

Der zweite Ansatz ohne AOX (Vergleichsansatz) erhielt 30 mΐ 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Die Ansätze wurden bei 25°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC analysiert. Der Gehalt an L- Cysteinsulfinsäure und L-Cysteinsäure im Ansatz mit AOX und im Ansatz ohne AOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von L-

Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure durch AOX in Gegenwart von Methanol

+ 5 U/ml AOX ohne AOX

Zeit L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- sulfinsäure säure sulfinsäure säure

[mg/L] [mg/L] [mg/L] [mg/L]

0 h 1171,5 0,0 1239,3 0,0 5 h 13,4 1023,3 1244,3 0,0

B) Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit AOX :

Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne AOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg Hypotaurin (Sigma- Aldrich) eingewogen, in 9,9 ml 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5 gelöst und 0,1 ml Methanol (Endkonzentration 1%, v/v) zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 30 mΐ kommerziell erhältlicher AOX aus Pichia pastoris (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die AOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne AOX (Vergleichsansatz) erhielt 30 mΐ 100 mM Na-Phosphat, pH 7,5. Die Ansätze wurden bei 25°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler) . Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC analysiert. Der Gehalt an Hypotaurin und Taurin im Ansatz mit Alkoholoxidase (AOX) und im Ansatz ohne Alkoholoxidase zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 2 zusammengefasst .

Tabelle 2: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von

Hypotaurin zu Taurin durch AOX in Gegenwart von Methanol HPLC-Analytik von L-Cysteinsulfinsäure, L-Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin:

Zur quantitativen Bestimmung der in den Beispielen quantitativ analysierten Verbindungen wurde eine jeweils für L- Cysteinsulfinsäure, L-Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin kalibrierte HPLC-Methode eingesetzt, wobei alle zur Kalibrierung verwendeten Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich waren (Sigma-Aldrich). Verwendet wurde ein HPLC- Gerät der Fa. Agilent, Modell 1260 Infinity II, ausgerüstet mit einer aus der Analytik von Aminosäuren bekannten Vorsäulenderivatisierung mit o-Phtaldialdehyd (OPA- Derivatisierung) vom gleichen Hersteller. Zum Nachweis der OPA-derivatisierten Produkte von L-Cysteinsulfinsäure, L- Cysteinsäure, Hypotaurin und Taurin war das HPLC-Gerät mit einem Fluoreszenzdetektor ausgerüstet. Der Detektor war eingestellt auf eine Excitationswellenlänge von 330 nm und eine Emissionswellenlänge von 450 nm. Des weiteren verwendet wurde eine Accucore™ aQ Säule der Fa. Thermo Scientific™,

Länge 100 mm, innerer Durchmesser 4,6 mm, Partikelgröße 2,6 pm, im Säulenofen auf 40°C temperiert.

Laufmittel A: 25 mM Na-Phosphat, pH 6,0 Laufmittel B:Methanol

Die Trennung erfolgte im Gradientenmodus: 0 - 25 min, 10% Laufmittel B auf 60% Laufmittel B, gefolgt von 2 min 60% Laufmittel B auf 100% Laufmittel B, gefolgt von weiteren 2 min 100% Laufmittel B, bei einer Flußrate von 0,5 ml/min. Retentionszeit von L-Cysteinsäure: 3,2 min. Retentionszeit von L-Cysteinsulfinsäure : 4,1 min. Retentionszeit von Taurin: 14,8 min. Retentionszeit von Hypotaurin: 15,7 min.

Beispiel 2: Oxidation von Hypotaurin und Cysteinsulfinsäure mit Glucoseoxidase (GOX)

A) Oxidation von Cysteinsulfinsäure zu Cysteinsäure mit GOX:

Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne GOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg L-Cysteinsulfinsäure x H2O (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 9,5 ml 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 gelöst und 0,5 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers betrug die GOX-Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne GOX (Vergleichsansatz) erhielt 50 mΐ 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Die Ansätze wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler). Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert.

Der Gehalt an L-Cysteinsulfinsäure und L-Cysteinsäure im Ansatz mit GOX und im Ansatz ohne GOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 3 zusammengefasst.

Tabelle 3: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von L- Cysteinsulfinsäure zu L-Cysteinsäure durch GOX in Gegenwart von Glucose

+ 5 U/ml GOX ohne GOX -Cystein- L-Cystein- L-Cystein- L-Cystein- lfinsäure säure lfinsäure säure

[mg/L] [mg/L] [mg/L] [mg/L]

1322,7 0,0 1146,3 0,0 3,0 1279,3 1171,3 0,0

B) Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit GOX :

Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit und ohne GOX, untersucht. In zwei 100 ml Erlenmeyerkolben wurden jeweils 12 mg Hypotaurin (Sigma- Aldrich) eingewogen, in 9,5 ml 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 gelöst und 0,5 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden in einem Ansatz 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 5 U/ml. Der Ansatz ohne GOX (Vergleichsansatz) erhielt 50 mΐ 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Die Ansätze wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler) . Zu Beginn und 5 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert.

Der Gehalt an Hypotaurin und Taurin im Ansatz mit GOX und im Ansatz ohne GOX zu Beginn (0 h) und nach 5 h Reaktionsdauer ist in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von

Hypotaurin zu Taurin durch GOX in Gegenwart von Glucose

Beispiel 3: Präparative Oxidation von Hypotaurin zu Taurin mit GOX

Die Reaktion wurde in zwei parallel durchgeführten Ansätzen, d.h. mit unterschiedlicher Dosierung des Enzyms GOX, untersucht, wobei die Konzentration des zu oxidierenden Substrats Hypotaurin jeweils 20 g/L betrug.

In Ansatz 1 wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben 200 mg Hypotaurin (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 6,95 ml 100 mM Na- Acetat, pH 5,5 gelöst und 3 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden 50 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 5 U/ml.

In Ansatz 2 wurde in einem 100 ml Erlenmeyerkolben 200 mg Hypotaurin (Sigma-Aldrich) eingewogen, in 6,5 ml 100 mM Na- Acetat, pH 5,5 gelöst und 3 ml einer 200 g/L Glucose Lösung im gleichen Puffer zugegeben. Zum Start der Reaktion wurden 500 mΐ kommerziell erhältlicher GOX aus Aspergillus niger (Sigma- Aldrich) zugegeben, gelöst in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5. Nach den Angaben des Herstellers zur Enzymaktivität betrug die GOX- Aktivität im Ansatz 50 U/ml.

Die Ansätze 1 und 2 wurden bei 30°C und 140 rpm geschüttelt (Infors Truhenschüttler).3 h, 6 h und 24 h nach Start der Reaktion wurden jeweils 1 ml der Ansätze entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und die Überstände durch HPLC wie oben beschrieben analysiert. Der zeitliche Verlauf der Reaktionen ist in Tabelle 5 zusammengefasst.

Tabelle 5: Zeitlicher Verlauf der Oxidation von Hypotaurin zu Taurin durch GOX in Gegenwart von Glucose

Beispiel 4: Herstellung der Hypotaurin ProduktionsStämme E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs Cystein Dioxygenase CDOrn:

CDOrn: Die Aminosäuresequenz der Cystein-Dioxygenase aus Rattus norvegicus ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: AAH70509.1 offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet und synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics). Diese mit CDOrn bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 2.

Cysteinsulfinsäure Decarboxylase CSADhs:

CSADhs: Die Aminosäuresequenz der Cysteinsulfinsäure- Decarboxylase (CSADhs) aus Homo sapiens ist in der NCBI (National Center for Biotechnology Information) Datenbank unter der Sequence ID: XP_016861786.1 offenbart. Aus der Aminosäuresequenz wurde eine für die Expression in E. coli codon-optimierte DNS-Sequenz (öffentlich zugängliche Eurofins Genomics GENEius Software) abgeleitet. Diese mit CSADhs bezeichnete DNS-Sequenz ist in SEQ ID NO: 3, nt 1 bis 1509 offenbart, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 4. Die DNS-Sequenz des E. coli rrnB-Terminators (SEQ ID NO:3, nt 1510 bis 1842) wurde mit nt 1509 verknüpft.

Die DNS-Sequenz des rrnB-Terminators ist offenbart in Orosz et al., Eur. J. Biochem. (1991) 201: 653 -659. Die in SEQ ID NO:3 offenbarte DNS, bestehend aus der CSADhs cds und dem rrnB- Terminator wurde synthetisch hergestellt (Eurofins Genomics) und erhielt die Bezeichnung CSADhs-rrnB.

Herstellung des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs:

- Vektor pCys (Fig. 1) bezeichnet das Plasmid pACYC184-cysEX- GAPDH-ORF306-serA317, ein Derivat des in EP 0885 962 Bl offenbarten Plasmids pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306. Das Plasmid pACYCl84-cysEX-GAPDH-ORF3 06 enthält neben dem Replikationsursprung und einem Tetracyclin-Resistenzgen (Ausgangsvektor pACYC184) das cysEX-Allel, das für eine Serin-O-Acetyl-Transferase mit einer verminderten Feedback- Hemmung durch Cystein codiert sowie das Effluxgen ydeD (ORF306), dessen Expression durch den konstitutiven GAPDH Promotor gesteuert wird.

Um pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306-serA317 zu erhalten, wurde in pACYC184-cysEX-GAPDH-ORF306 das serA317 Genfragment codierend für die N-terminalen 317 Aminosäuren des SerA Proteins aus E. coli und offenbart in Bell et al., Eur. J. Biochem. (2002) 269: 4176-4184 (darin bezeichnet als „NSD:317") hinter das ydeD (ORF306) Efflux Gen kloniert. SerA317 codiert für eine gegen Serin Feedback-resistente Variante der 3- Phosphoglycerat Dehydrogenase. Die Expression von serA317 wird gesteuert durch den serA-Promotor.

Mit pCys transformierte E. coli Zellen produzieren infolge einer deregulierten Biosynthese Cystein, das Ausgangsprodukt für die Folgeprodukte Cysteinsulfinsäure und Hypotaurin.

- Vektor pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2): pCys wurde mit Seal und PpuMI geschnitten. Das dabei freigesetzte 6,1 kb Vektorfragment wurde nach präparativer Agarose-Gelelektrophorese isoliert (QIAquick ^® Gel Extraction Kit, Qiagen).

Die CDOrn-DNS wurde aus der synthetischen DNS SEQ ID NO: 1 (CDOrn) durch PCR („Phusion™ High-Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern cdorn-lf (SEQ ID NO: 5) und csadhs-2r (SEQ ID NO: 6) amplifiziert und als 0,6 kb großes Fragment isoliert.

Primer cdorn-lf umfasste, beginnend vom 5'-Ende, 28 nt überlappend mit dem durch Scal-Verdau erhaltenen 3'-Ende des 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragments (nt 1 bis 28 in SEQ ID NO: 5), eine Ribosomenbindestelle (RBS) (nt 31 bis 36 in SEQ ID NO: 5) sowie die ersten 22 nt der CDOrn eds (SEQ ID NO 5, nt 44 bis 65). Primer csadhs-2r umfasste, in revers-complementärer Form, beginnend vom 5'-Ende, 22 nt überlappend mit dem Start der CSADhs cds (SEQ ID NO: 6, nt 1 bis 22), gefolgt von einer Ribosomenbindestelle (SEQ ID NO: 6, nt 30 bis 35) sowie die letzten 20 nt der CDOrn cds (SEQ ID NO: 6, nt 38 bis 57).

- CSADhs-rrnB-DNS: Das DNS-Fragment wurde aus der synthetischen

DNS SEQ ID NO: 3 (CSADhs-rrnB) durch PCR („Phusion™ High-

Fidelity" DNS Polymerase, Thermo Scientific™) mit den Primern csadhs-3f (SEQ ID NO: 7) und glf-2r (SEQ ID NO: 8) amplifiziert und als 1,8 kb großes Fragment isoliert.

Primer csadhs-3f umfasste, beginnend vom 5'-Ende, 20 nt überlappend mit dem 3'-Ende der CDOrn cds (nt 1 bis 20 in SEQ ID NO: 7), eine Ribosomenbindestelle (nt 23 bis 28 in SEQ ID NO: 7) sowie die ersten 22 nt der CSADhs cds (SEQ ID NO 7, nt 36 bis 57).

Primer glf-2r umfasste, in revers-complementärer Form, beginnend vom 5'-Ende, 33 nt überlappend mit dem durch PpuMI- Verdau erhaltenen 5'-Ende des 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragments (nt 1 bis 33 in SEQ ID NO: 8), gefolgt von den letzten 22 nt des rrnB-Terminators (SEQ ID NO: 8, nt 34 bis 55).

- Vektor pCys-CDOrn-CSADhs: Das 6,1 kb pCys Scal/PpuMI Vektorfragment, das 0,6 kb CDOrn PCR-Produkt (CDOrn-DNS) und das 1,8 kb CSADhs-rrnB PCR-Produkt (CSADhs-rrnB-DNS) wurden mit dem NEBuilder ^® Klonierkit (NEB New England Biolabs) nach den Angaben des Herstellers ligiert.

Anschließend wurden E. coli NEB ^® 1O-beta-Zellen (NEB New England Biolabs) mit dem Ligationsansatz transformiert. Klone aus der Transformation wurden auf LBtet selektiert. LBtet enthielt 10 g/L Trypton (GIBCO™), 5 g/L Hefeextrakt (BD Biosciences), 5 g/L NaCl, 15 g/L Agar und 15 mg/L Tetracyclin (Sigma-Aldrich). Ein Einzelklon aus der Transformation wurde analysiert durch Anzucht in LBtet-Flüssigmedium (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl und 15 mg/L Tetracyclin) und Isolierung des Vektors aus dem Zellpellet der Anzucht. Der korrekte 8,5 kb Vektor erhielt die Bezeichnung pCys-CDOrn-CSADhs (Fig. 2).

- Stamm E. coli W3110:

Verwendet wurde der Stamm Escherichia coli K12 W3110 (käuflich erhältlich unter der Stammnummer DSM 5911 bei der DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

- Stamm E. coli W3110-ppsA-MHI:

Verwendet wurde der Stamm E. coli K12 W3110-ppsA-MHI. E. coli K12 W3110-ppsA-MHI ist gekennzeichnet durch das mutierte ppsA-Gen ppsA-MHI (SEQ ID NO: 9), kodierend für ein Protein mit der Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 10 und der Enzymaktivität einer PEP-Synthase (in der KEGG-Datenbank mit der Nummer EC 2.7.9.2 bezeichnete Enzymklasse). E. coli K12 W3110-ppsA-MHI wurde hergestellt durch Verwendung der dem Fachmann bekannten Kombination aus Lambda-Red Rekombination und einem Gegenselektions-Screening zur genetischen Modifikation (siehe z.B. Sun et al., Appl. Env. Microbiol. (2008) 74: 4241-4245). Um das ppsA WT-Gen von E. coli K12 W3110 gegen ppsA-MHI auszutauschen wurden folgende Schritte durchgeführt:

1) E. coli K12 W3110 wurde mit dem Plasmid pKD46 (Fig. 3, offenbart in der „GenBank" Gendatenbank unter der Zugangsnummer AY048746.1) transformiert und der Stamm E. coli W3110 x pKD46 isoliert (Ampicillin Selektion).

2) Vom Plasmid pKan-sacB (Fig. 4) wurde die 3,2 kb Kan-sacB- Kassette durch PCR mit den Primern pps-9f (SEQ ID NO: 11, bindet an der als „pr-f" bezeichneten Stelle in Fig. 4) und pps-10r (SEQ ID NO: 12, bindet an der als „pr-r" bezeichneten Stelle in Fig. 4) isoliert. Das Plasmid pKan- sacB enthält Expressionskassetten sowohl für das Kanamycin (Kan) Resistenz Gen wie für das sacB Gen, codierend für das Enzym Levansucrase. Das E. coli Kanamycin Resistenzgen (Kan), kodierend für eine Aminoglycosid- Phosphotransferase, ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer SH02_03400. Das B. subtilis sacB- Gen ist offenbart in der NCBI Datenbank unter der Zugangsnummer 936413.

Primer pps-9f enthält die ersten 30 nt des ppsA-WT-Gens (identisch mit SEQ ID NO: 9, nt 1 bis 30) und daran angeschlossen 20 nt der als „pr-f" bezeichneten Stelle in Fig. 4. Primer pps-lOr enthält die letzten 30 nt des ppsA- WT-Gens, in revers komplementärer Form (identisch mit SEQ ID NO: 9, nt 2350 - 2379) und daran angeschlossen 20 nt der als „pr-r" bezeichneten Stelle in Fig. 4.

3) E. coli W3110 x pKD46 wurde mit der 3,2 kb Kan-sacB- Kassette transformiert und Kanamycin-resistente Klone isoliert.

4) Die Klone wurden auf LBSC-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar und 15 mg/L Kanamycin) überimpft. Klone mit integriertem sacB-Gen produzierten aus der Saccharose toxisches Levan, was zur Wachstumshemmung führte (Saccharose-sensitiv). Ein Kanamycin-resistenter und Saccharose-sensitiver Klon wurde ausgewählt und als W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46 bezeichnet.

5) W3110-ppsA::Kan-sacB x pKD46 wurde mit DNS des ppsA-MHI- Gens (SEQ ID NO: 9, synthetisch hergestellt, Fa. Eurofins Genomics) transformiert und Klone auf LBS-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 7% Saccharose, 1,5% Agar) ohne Kanamycin selektiert. Auf LBS-Platten konnten nur Klone wachsen, die kein aktives sacB-Gen mehr enthielten. Diese Klone wurden auf LBkan-Platten (10 g/L Trypton, 5 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 1,5 % Agar, 15 mg/L Kanamycin) überimpft um solche Klone zu selektieren, die auch kein aktives Kan-Gen mehr enthielten und deren Wachstum in Gegenwart von Kanamycin gehemmt wurde.

6) Ein Klon mit positivem Wachstum in Gegenwart von Saccharose und negativem Wachstum in Gegenwart von Kanamycin wurde ausgewählt, das ppsA-MHI-Gen aus genomischer DNS des Stammes durch PCR isoliert und durch DNS-Sequenzierung (Eurofins Genomics) bestätigt, dass das ppsA-MHI Gen mit der DNS-Sequenz wie in SEQ ID NO: 9 offenbart integriert worden war, kodierend für ein Protein entsprechend der Sequenz aus SEQ ID NO: 10. Der Stamm, nach Entfernung des Plasmids pKD46 durch Inkubation bei 42°C erhielt die Bezeichnung E. coli W3110-ppsA-MHI.

- ProduktionsStämme: Plasmid-DNS des Vektors pCys-CDOrn-CSADhs wurde in die Stämme E. coli K12 W3110 und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI transformiert. Zum Vergleich wurden E. coli K12 W3110 und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI mit dem Vektor pCys transformiert. Transformanten wurden auf LBtet selektiert. Jeweils ein Klon wurde isoliert. Die Stämme erhielten die Bezeichnung E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110 x pCys bzw. analog E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys. E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs wurden als Produktionsstämme zur Herstellung von Hypotaurin verwendet.

Beispiel 5: Produktion von Hypotaurin im Schüttelkolben

Von den Stämmen E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs, E. coli K12 W3110 x pCys, E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn- CSADhs und E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys wurde in LBtet- Flüssigmedium jeweils eine Vorkultur hergestellt (Anzucht bei 37°C und 120 rpm über Nacht).

Hauptkultur: 0,5 ml der Vorkultur wurden in einen 300 ml Erlenmeyerkolben (mit Schikane) mit 30 ml SM1-Ac-Medium, darüber hinaus enthaltend 15 g/L Glucose, 2 g/L Na2S203 x 5 H2O, 0,1 g/L L-Isoleucin, 0,1 g/L D,L-Methionin, 0,1 g/L L- Threonin, 5 mg/L Vitamin Bl und 15 mg/L Tetracyclin, überführt.

Zusammensetzung des SM1-Ac-Mediums: 12 g/L K ₂ HPO ₄ , 3 g/L KH ₂ PO ₄ , 5 g/L NH ₄ -Acetat, 0,3 g/L MgS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 0,015 g/L CaCl ₂ x 2 H ₂ 0, 0,002 g/L FeS0 ₄ x 7 H ₂ 0, 1 g/L Na ₃ Citrat x 2 H ₂ 0, 0,1 g/L NaCl; 1 ml/L Spurenelementlösung.

Zusammensetzung der Spurenelementlösung: 0,15 g/L Na ₂ Mo0 ₄ x 2 H ₂ 0, 2,5 g/L H3BO3, 0,7 g/L CoCl ₂ x 6 H ₂ 0, 0,25 g/L CuS0 ₄ x 5 H ₂ 0, 1,6 g/L MnCl ₂ x 4 H ₂ 0, 0,3 g/L ZnS0 ₄ x 7 H ₂ 0.

Die Hauptkultur wurde für 24 h bei 30°C und 140 rpm in einem Truhenschüttler (Infors) inkubiert. Nach 24 h wurden 1 ml Proben entnommen und die Zelldichte OD _ö oo/nil (optische Dichte der Hauptkultur, photometrisch gemessen bei 600 nm) gemessen mit einem Genesys™ 10S UV-Vis Spektralphotometer der Fa. Thermo-Scientific™, sowie der Gehalt an Hypotaurin und Taurin durch HPLC bestimmt. Der durch HPLC bestimmte Gehalt an Hypotaurin im Kulturüberstand betrug für E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs (Zelldichte OD _ö oo/nil der Kultur: 5,3/ml)

157,3 mg/L. Der Taurin-Gehalt im Kulturüberstand betrug 52,8 mg/L.

Für E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs (Zelldichte ODeoo/nil der Kultur: 7,1/ml) betrug der durch HPLC bestimmte Gehalt an Hypotaurin im Kulturüberstand 1059,2 mg/L und an Taurin 304,1 mg/L.

Für beide Vergleichsstämme E. coli K12 W3110 x pCys (Zelldichte OD _ö oo/nil der Kultur: 6,1/ml) und E. coli K12 W3110- ppsA-MHI x pCys (Zelldichte OD _ö oo/nil der Kultur: 7,5/ml) konnte weder Hypotaurin noch Taurin nachgewiesen werden.

Beispiel 6: Oxidation von Hypotaurin aus der

Schüttelkolbenanzucht zu Taurin

Je 10 ml der Ansätze aus der Schüttelkolbenanzucht von E. coli W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs und E. coli W3110-ppsA-MHI x pCys- CDOrn-CSADhs (Beispiel 5) wurden 10 min bei 4000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Megafuge ^® 1.0 R), 9,4 ml des jeweiligen Überstands in einen 100 ml Erlenmeyerkolben überführt und mit 0,7 M NaOH auf pH 5,5 eingestellt. 0,5 ml einer Lösung von 200 g/L Glucose in H ₂ 0 (Endkonzentration 10 g/L im Ansatz) und 100 mΐ einer 1 U/mI Stammlösung von GOX aus Aspergillus niger (Sigma-Aldrich) in 100 mM Na-Acetat, pH 5,5 wurden zugegeben (Endkonzentration 10 U/ml) und die Ansätze (10 ml Volumen) in einem Truhenschüttler (Infors) bei 30°C und 140 rpm inkubiert. Zu Beginn und 2 h nach Start der Inkubation wurden jeweils 1 ml des Ansatzes entnommen, 5 min bei 80°C inkubiert, 5 min bei 13000 rpm zentrifugiert (Heraeus™ Fresco™ 21 Zentrifuge) und der Überstand durch HPLC analysiert.

Wie in Tabelle 6 zusammengefasst, wurde das in der Schüttelkolbenkultur enthaltene Hypotaurin (Beispiel 5) von 157,3 mg/L (Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs) und 1059,2 mg/L (Stamm W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs) vollständig verbraucht und es entstand Taurin in einer Konzentration von 212,8 mg/L, bzw. 1355,6 mg/L. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Molekulargewichte (109,2 g/Mol für Hypotaurin, 125,2 g/Mol für Taurin) wurde die molare Ausbeute bestimmt. Wie in Tabelle 6 angegeben, betrug für den Stamm W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs der Gehalt an Hypotaurin (1,4 mM) und Taurin (0,4 mM) zu Beginn der Reaktion zusammen 1,8 mM. 2 h nach Start der Reaktion betrug der Gehalt an Taurin 1,7 mM und Hypotaurin war nicht mehr nachweisbar. Die molare Ausbeute an Taurin aus der enzymatischen Oxidation eines Hypotaurin/Taurin Produktgemisches, d.h. bezogen auf den Gesamteinsatz an Hypotaurin und Taurin (1,4+0,4=1,8 mM) aus der Schüttelkolbenanzucht betrug 94,4 %. Für den Stamm W3110- ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs betrug der Gehalt an Hypotaurin (9,7 mM) und Taurin (2,4 mM) zu Beginn der Reaktion zusammen 12,1 mM. 2 h nach Start der Reaktion betrug der Gehalt an Taurin 10,8 mM und Hypotaurin war nicht mehr nachweisbar. Die molare Ausbeute an Taurin aus der enzymatischen Oxidation eines Hypotaurin/Taurin Produktgemisches, d.h. bezogen auf den Gesamteinsatz an Hypotaurin und Taurin (9,7+2,4=12,1 mM) aus der Schüttelkolbenanzucht betrug 89,3 %. Tabelle 6: Oxidation von Hypotaurin aus der

Schüttelkolbenanzucht des Stammes E. coli K12 W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs bzw. des Stammes E. coli K12 W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs zu Taurin nach 2 h Inkubation mit GOX in Gegenwart von Glucose

W3110 x pCys-CDOrn-CSADhs:

Taurin mg/L mM

0 h 157,3 1,4 52,8 0,4

2 h 0,0 0,0 212,8 1,7

W3110-ppsA-MHI x pCys-CDOrn-CSADhs

Taurin mg/L mM

0 h 1059,2 9,7 304,1 2,4 2 h 0,0 0,0 1355,6 10,8