DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant une biomasse de microorganismes, ledit procédé de préparation comprenant la récupération des phytotoxines d’un jus de fermentation obtenu à partir de la culture de microorganismes producteurs desdites phytotoxines

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les procédés de récupération des biomasses et des composés tels que les phytotoxines compris dans ces biomasses et/ou les milieux de culture sont bien connus de l’homme du métier (W02004/034790, Gijsbertsen-Abrahamse et al., Journal of Membrane science, 2006, 276 (1 -2), pages 252-259, W02020/058750, US2012/053344, Marcati et al., Algal Research 2014, 5, pages 258-263). Ces procédés consistent généralement en une centrifugation du milieu de culture ou en une (micro)filtration, permettant aussi la purification de la biomasse.

Les microorganismes, et plus particulièrement les algues et microalgues, sont aujourd’hui largement cultivées pour leur propriété à produire des biomasses riches en lipides, protéines, glucides, etc. En parallèle à la multiplication des cellules, les microorganismes sécrètent des molécules d’intérêt dont les phytotoxines. Ces phytotoxines, présentes principalement dans le milieu de culture, et plus précisément dans le jus de fermentation, sont généralement éliminées lors de la récupération et de la purification de la biomasse.

Or les phytotoxines sécrétées par les microorganismes présentent des propriétés biologiques intéressantes selon leur nature, et peuvent être utilisées dans divers domaines tels que l’industrie agricole ou pharmaceutique (W02004/052097 et US2007/166266). Les phytotoxines isolées peuvent par ailleurs être employées pour ajuster les concentrations des lots de biomasse produits. En effet, la qualité et la concentration des composés, dont les phytotoxines, présents dans les biomasses varient en fonction des conditions de culture. Enfin, dans le cadre d’un enjeu environnemental, il est intéressant de pouvoir récupérer les phytotoxines, notamment les phytotoxines nuisibles pour l’environnement, et limiter ainsi leur propagation dans la nature.

Les inventeurs ont ainsi développé un procédé de récupération des phytotoxines d’un jus de fermentation obtenu à partir de la culture de microorganismes. EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant une biomasse de microorganismes, ledit procédé de préparation comprenant l’ajout de phytotoxines en tant qu’additif à ladite biomasse, caractérisé en ce que les phytotoxines sont obtenues par un procédé comprenant les étapes de : a. filtration sur membrane d’un jus de fermentation de la biomasse de manière à retenir les phytotoxines dans le rétentat, ladite biomasse étant obtenue à partir d’une culture de microorganismes producteurs de phytotoxines, b. récupération d’un rétentat comprenant lesdites phytotoxines, et c. récupération d’un premier perméat appauvri en phytotoxines, ledit perméat ayant une teneur en phytotoxines inférieure à celle du jus de fermentation, suivi le cas échéant par au moins un cycle supplémentaire de filtration sur membrane du rétentat obtenu en étape (c) du cycle précédent, avec la récupération d’au moins un deuxième rétentat comprenant lesdites phytotoxines et d’au moins un deuxième perméat appauvri en phytotoxines ayant une teneur en phytotoxines inférieure à celle du premier perméat.

L’obtention des phytotoxines selon l’invention peut ainsi comprendre m cycles supplémentaires de filtration sur membrane, et la récupération de m+1 rétentats comprenant les phytotoxine et de m perméats appauvris en phytotoxines, m étant un entier égal ou supérieur à 1 .

Les différents cycles de filtration sur membrane peuvent être réalisés sur les mêmes membranes de filtration ou sur des membranes différentes. Il en est de même pour les cycles de filtration, chacun d’entre eux pouvant comprendre des membranes similaires ou différentes.

Dans le cadre de la présente invention, la concentration finale en phytotoxines obtenue dans le perméat récupéré après le dernier cycle de filtration peut être déterminée par l’équation : dans laquelle À est le nombre de cycles m+1 , X est le facteur de concentration de la membrane et R est le taux de rejet moléculaire de la membrane.

Les phytotoxines sont des molécules avec un poids moléculaire compris entre 300 et 3500 Da.

Enfin, l’invention concerne l’utilisation du perméat issu du procédé en tant qu’aliment dans un procédé de culture de microorganismes.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 représente un mode de réalisation de l’invention.

La figure 2 représente le nombre de cycle de filtration n en fonction de la concentration en phytotoxines (cylindrospermopsine) du rétentat.

La figure 3 représente l’évolution de la concentration en phytotoxines (cylindrospermopsine) dans le rétentat en fonction du nombre de cycle de filtration sur membrane.

La figure 4 représente le rendement en phytotoxines récupérées à chaque étape de filtration sur membrane en fonction du type de membrane.

La figure 5 représente l’évolution de la filtration sur un filtre de 1000 Daltons de la toxine maitotoxine (C164H258O68S2) d’une taille de 3380 daltons par LC-MS/MS.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de préparation d’une composition comprenant une biomasse de microorganismes, ledit procédé de préparation comprenant l’ajout de phytotoxines en tant qu’additif à ladite biomasse, caractérisé en ce que les phytotoxines sont obtenues par un procédé comprenant les étapes de : a. filtration sur membrane d’un jus de fermentation de la biomasse de manière à retenir les phytotoxines dans le rétentat, ladite biomasse étant obtenue à partir d’une culture de microorganismes producteurs de phytotoxines, b. récupération d’un rétentat comprenant lesdites phytotoxines, et c. récupération d’un premier perméat appauvri en phytotoxines, ledit perméat ayant une teneur en phytotoxines inférieure à celle du jus de fermentation, suivi le cas échéant par au moins un cycle supplémentaire de filtration sur membrane du rétentat obtenu en étape (c) du cycle précédent, avec la récupération d’au moins un deuxième rétentat comprenant lesdites phytotoxines et d’au moins un deuxième perméat appauvri en phytotoxines ayant une teneur en phytotoxines inférieure à celle du premier perméat.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par phytotoxines les molécules ou les substances chimiques sécrétées par les microorganismes lors de leur culture, c’est-à-dire en parallèle de la formation d’une biomasse desdits microorganismes. Le terme « phytotoxine » regroupe ainsi les biotoxines produites par des plantes, des champignons (appelées aussi mycotoxines), et des algues (aussi appelées phycotoxines). Dans le cadre de la présente invention, les phytotoxines sont avantageusement des phycotoxines. Des exemples de phycotoxines sont l’acide domoïque, l’acide okadaïque, les saxitoxines, les brévetoxines ou encore les ciguatoxines.

Dans le cadre de la présente invention, on entend par « biomasse » un ensemble de cellules de microorganismes (i.e. plusieurs milliers de cellules et plus) produites en cultivant lesdits microorganismes sur un milieu de culture et séparées de ce milieu de culture à la fin de la culture après récolte. Par effet de leurs conditions de culture, les cellules de microorganismes dans la biomasse ont toutes substantiellement la même composition. La biomasse de microorganismes est une composition qui comprend des cellules de microorganismes cultivés avec de l’eau et éventuellement des traces de nutriments et autres éléments présents dans le milieu de culture.

Dans le cadre de la présente demande, la biomasse est une biomasse de microalgues. La biomasse de microalgues peut être une biomasse brute, une biomasse lysée, une biomasse homogénéisée ou une biomasse séchée.

Dans le cadre de la présente demande, le terme “biomasse brute” désigne une biomasse obtenue après récolte, sans autre modification telle qu’une lysé cellulaire ou une homogénéisation. La biomasse brute comprend au moins 70% d’eau, et jusqu’à 90% d’eau, préférentiellement de 80 à 85% d’eau. La biomasse brute comprend aussi la biomasse brute lavée après la récolte afin d’éliminer certains nutriments et autres éléments présents dans le milieu de culture.

Une “biomasse lysée”, dans le cadre de la présente demande, signifie une biomasse de microalgues dans laquelle au moins 50% des cellules sont lysées, préférentiellement au moins 70%, plus préférentiellement au moins 80%, 85%, 90%, 95%, jusqu’à 100% des cellules sont lysées. Dans ce but, la lyse est faite par un humain selon des méthodes connues, telles que la lyse mécanique, chimique ou enzymatique, bien connues de de l’homme du métier (WO2015/095688, WO201 1/153246, US6750048 and WO201 5/095694, WO2018/178334, W02020/144330, W02020/053375, CN106749633, CN102433015, CN1 117973, Michelon & al. 2016). La biomasse brute peut comprendre des cellules lysées en raison de l’étape de récolte. Cependant, le ratio de cellules lysées dans la biomasse brute est généralement très faible, inférieure à 50%, la récolte étant effectuée pour éviter des dommages importants de la biomasse. À l’exception des matières ajoutées pour la lyse de la biomasse, la biomasse lysée ne contient que de la biomasse d’algues à l’état transformé. Une “biomasse sèche” dans le cadre de la présente demande, signifie que la biomasse comprend moins de 10% d’eau, préférentiellement de 1 à 10% d’eau, plus préférentiellement de 2 à 7%. La biomasse sèche est une biomasse obtenue après une étape de séchage effectuée dans des conditions définies par un être humain ou un ordinateur sous le contrôle d’un être humain.

Dans le cadre de la présente demande, le terme « culture de microalgues » désigne une méthode de culture industrielle contrôlée par l’homme et comprenant l’ensemencement d’un milieu de culture choisit par ledit humain avec des cellules de ladite microalgue, permettant aux cellules de se multiplier et de croître jusqu’à une certaine densité cellulaire élevée dans le milieu de culture. Pour éviter tout doute, la « culture de microalgues » selon l’invention ne signifie pas la récolte de microalgues trouvées dans la nature.

Dans un mode de réalisation, la biomasse de microalgues peut être une biomasse brute, une biomasse lysée, une biomasse homogénéisée ou une biomasse séchée.

La « cultures de microalgues » comprend une étape a) de croissance des cellules et d’accumulation des métabolites, et une étape b) de récolte de la biomasse en séparant l’ensemble des cellules de microalgues formant le milieu de culture. La croissance des cellules et l’accumulation peuvent être une seule étape où les conditions de croissance permettent l’accumulation des métabolites. Dans un autre mode de réalisation, la croissance des cellules et l’accumulation peuvent être effectuées en deux étapes successives, où l’étape a1 ) permet la croissance des cellules à une certaine densité, et est suivie de l’étape a2) de maturation où les métabolites sont accumulés dans les cellules sans affecter sensiblement la densité cellulaire dans le milieu de culture. Dans certains modes de réalisation, l’étape a1 ) de la croissance permet également un certain niveau d’accumulation de métabolites renforcée par l’étape de maturation a2). Dans certains modes de réalisation, l’étape a2) de maturation permet également un certain niveau d’amélioration de la densité cellulaire.

Selon l’invention, les phytotoxines sont des métabolites.

Le terme “milieu de culture” dans la cadre de la présente demande désigne une composition aqueuse comprenant les nutriments nécessaires à la croissance des microalgues. Le milieu de culture comprend une source d’azote, une source de phosphore, des sels, et/ou des vitamines, et/ou des oligoéléments et d’autres nutriments bien connus de l’homme du métier. Pour les cultures hétérotrophes ou mixotrophes, le milieu de culture comprend également une source de carbone organique métabolisé par les microalgues, tandis que pour les cultures autotrophes, une source de carbone minéral telle que le CO2 est présente dans le milieu de culture.

La source de carbone peut être une source de carbone organique pour une culture en mode hétérotrophe ou mixotrophe. Une “source de carbone organique” dans la cadre de la présente demande, désigne une molécule aliphatique, en particulier un polyol, un acide organique ou un carbohydrate. Des exemples de telles sources de carbone complexes sont le glycérol, le glucose, le fructose, le xylose, le saccharose, les dérivés de la cellulose, l’acide lactique et les sels, l’amidon, les dérivés de l’amidon, et leurs mélanges, et tout produit complexe comprenant au moins une de ces molécules.

La source de carbone peut être le dioxyde de carbone pour une culture en mode autotrophe où la lumière fournit de l’énergie aux cellules pour incorporer le carbone pendant la photosynthèse. Ce dioxyde de carbone est généralement fourni aux cellules dans toute la culture sous une forme gazeuse ou pré-dissoute.

Les méthodes de culture des microorganismes sont bien connues de l’homme du métier, qu’elles soient en mode hétérotrophe, autotrophe ou mixotrophe.

Les microorganismes selon l’invention sont cultivés dans des réacteurs biologiques, des réacteurs au sein desquels se développent des phénomènes biologiques, tels qu’une croissance de cultures ou microorganismes pures ou d’un consortium de microorganismes.

Les phytotoxines produites par les microorganismes se trouvent principalement dans le jus de fermentation obtenu lors de la culture cellulaire. Le terme « fermentation » désigne ainsi l’opération qui permet de produire la biomasse et/ou les produits de bioconversion par la culture de microorganismes.

Dans le cadre de l’invention, le terme « jus de fermentation », aussi appelé bouillon de culture, fait référence à la phase liquide comprise dans le réacteur biologique. Le jus de fermentation comprend ainsi, entre autres, de l’eau, des nutriments et des composés sécrétés et/ou produits par les microorganismes.

Le jus de fermentation et la biomasse sont séparés selon les méthodes usuelles de séparation. On citera en particulier la centrifugation (centrifugeuse à assiettes ou sédicanteur), et la filtration (filtre plaque, filtre presse, filtration tangentielle céramique ou organique). Ces techniques sont bien connues de l’homme du métier qui saura déterminer, en fonction de la nature et des caractéristiques de la biomasse et du jus de fermentation, la méthode la plus appropriée.

Dans un mode de réalisation, le procédé de récupération des phytotoxines d’un jus de fermentation obtenu à partir de la culture des microorganismes producteurs desdites phytotoxines est ainsi précédé d’une étape de séparation de la biomasse et du jus de fermentation.

Le jus de fermentation peut aussi être obtenu à partir d’un moût de fermentation obtenu par un procédé de fermentation desdits microorganismes dans un milieu de culture comprenant un milieu de culture aqueux et des nutriments nécessaires à la croissance desdits microorganismes.

On entend par « moût de fermentation » le mélange liquide/solide produit par les microorganismes. Dans ce cas, le moût de fermentation est séparé de la biomasse de microorganismes selon des méthodes bien connues de l’homme du métier, avant de procéder à l’extraction du jus de fermentation.

Une fois le jus de fermentation séparé, les phytotoxines sont extraites selon le procédé défini dans la présente demande. Le procédé de récupération des phytotoxines du jus de fermentation de la biomasse produite comprend au moins un cycle de filtration sur membrane, ce cycle de filtration comprenant les étapes suivantes :

(a) filtration sur membrane su jus de fermentation de la biomasse de manière à retenir les phytotoxines dans le rétentat,

(b) récupération du rétentat comprenant lesdites phytotoxines, et

(c) récupération du perméat appauvri en phytotoxines, ledit perméat ayant une teneur en phytotoxines inférieure à celle du jus de fermentation.

On entend par « rétentat » l’ensemble des molécules et/ou particules qui sont retenues lors du processus de filtration sur membrane. Au contraire, on entend par « perméat » ou « filtrat » les molécules et/ou particules qui ont traversé la membrane. Dans le cadre de l’invention, les phytotoxines sont principalement récupérées dans le rétentat.

Le cycle de filtration peut comprendre un ou plusieurs cycle(s) supplémentaire(s) de filtration sur membrane du rétentat obtenu à l’étape (c).

Dans un mode de réalisation, le procédé comprend au moins un cycle de filtration sur membrane du rétentat obtenu à l’étape (c), conduisant alors à la récupération d’au moins un deuxième rétentat comprenant lesdites phytotoxines et d’un deuxième perméat appauvri en phytotoxines ayant une teneur en phytotoxines inférieur à celle du premier perméat.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend plus de un cycle de filtration sur membrane supplémentaire. De manière générale, le procédé peut comprendre m cycles supplémentaires de filtration sur membrane, m étant un entier compris entre 1 et 10. Dans un mode de réalisation, m est compris entre 1 et 10, plus particulièrement m est choisi parmi les valeurs de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 et 10. Dans un mode de réalisation préféré, m a pour valeur 1 , 2 ou 3. Dans un autre mode de réalisation préféré, m vaut 1 ou 2.

Le procédé selon l’invention comprenant m cycle supplémentaires de filtration sur membrane conduit à la récupération de m+1 rétentats comprenant les phytotoxines et m perméats appauvris en phytotoxines.

Les cycles de filtration sur membrane sont réalisés avec une seule et même membrane ou sur une nouvelle membrane similaire ou différente. On entend par « membrane identique ou différente » des membranes dont les caractéristiques intrinsèques sont identiques ou différentes.

Dans un mode de réalisation, chaque cycle de filtration du procédé selon l’invention est réalisé sur la même membrane de filtration. Le perméat obtenu de la filtration sur membrane est ainsi de nouveau filtré avec cette première membrane dans le cycle de filtration supplémentaire.

Dans un autre mode de réalisation, chaque cycle de filtration est réalisé sur une nouvelle membrane, étant entendu que celle-ci peut présenter des caractéristiques intrinsèques similaires ou différentes de la membrane du cycle de filtration précédent.

Le nombre de cycle de filtration sur membrane supplémentaire m ou le nombre de cycle de filtration sur membrane total n sont déterminés en fonction de plusieurs paramètres, dont la teneur en phytotoxines du jus de fermentation, le facteur de concentration de la membrane de filtration et la concentration finale en phytotoxines désirée dans le perméat récupéré après le dernier cycle de filtration.

Les membranes se caractérisent par leurs propriétés intrinsèques dont la taille des pores, le seuil de coupure, la sélectivité et la perméabilité. L’homme du métier saura déterminer le type de membrane à utiliser selon les paramètres du procédé, comme le nombre d’étapes de filtration le facteur de concentration, la concentration en phytotoxines désirée dans le perméat final, etc.

Dans le cadre de la présente invention, les membranes sont des membranes dont le seuil de coupure est inférieur à la masse molaire des phytotoxines filtrées. L’homme du métier saura déterminer la valeur des seuils de coupure, et par conséquent les membranes appropriées à utiliser.

Le seuil de coupure peut aller d’environ 100 à 1500 Da, en particulier d’environ 100 Da à environ 1000 Da, voire d’environ 100 Da à environ 700 Da, notamment 100 Da, 200 Da, 300 Da, 400 Da, 500 Da ou 600 Da.

Dans un mode de réalisation, les membranes ont ainsi des pores dont le diamètre est compris entre 0,6 et 0,7 nm. En parallèle, le seuil de coupure de poids moléculaire des membranes est compris environ 100 et 300 Da. Des exemples particuliers de membranes sont les membranes utilisées en osmose inverse. De telles membranes sont les membranes SEPA CF II commercialisées par Ge Osmonics et SW C4 commercialisées par Hydranautics.

La concentration finale en phytotoxines dans le perméat récupéré après le dernier cycle de filtration sur membrane, en fonction du nombre de cycle m+1 , peut être déterminée par l’équation suivante : dans laquelle À est le nombre de cycles m+1 , X est le facteur de concentration de la membrane et R est le taux de rejet moléculaire de la membrane, et les valeurs de X et R étant connus.

Il est aussi possible de déterminer le rendement global nk d’un nombre de passage n dans une membrane selon la formule suivante :

Dans le cas où un seul cycle de filtration est utilisé, le rendement nk est calculé selon la formule :

De manière avantageuse, le perméat récupéré a une teneur en phytotoxines inférieure à celle du jus de fermentation. Dans un mode de réalisation, le perméat a une teneur en phytotoxines inférieure à 10% en poids par rapport au poids total de la biomasse, voire inférieure à 8%, voire même inférieure à 7%, préférentiellement inférieure à 6%. Dans un autre mode de réalisation, la teneur en phytotoxines est comprise entre 0 et 5% en poids par rapport au poids total de la biomasse. Préférentiellement, la teneur en phytotoxines est comprise entre 0 et 4%, préférentiellement entre 0 et 3%, et plus préférentiellement entre 0 et 2%. Dans un autre mode de réalisation préféré, la teneur en phytotoxines est inférieure à 1 % en poids par rapport au poids total de la biomasse. Dans le cadre de la présente invention, la limite de 0% en poids par rapport au poids total de la biomasse correspond à la limite de détection des phytotoxines présentes dans le perméat.

Les m+1 rétentats comprenant les phytotoxines récupérées du premier cycle de filtration sur membrane et les rétentats des m cycles supplémentaires de filtration sur membrane sont récupérés et éventuellement rassemblés.

Un mode de réalisation du procédé de récupération des phytotoxines d’un jus de fermentation obtenu à partir de microorganismes est représenté en Figure 1. Après la culture des microorganismes dans le réacteur biologique (1 ), le jus de fermentation (2) et la biomasse (3) sont séparés. La biomasse (3) est récupérée, éventuellement traitée et/ou transformée selon son devenir. En parallèle, le jus de fermentation (4) est purifié par filtration sur membrane (5). Le rétentat (7) est isolé, tandis que le perméat (6) peut être isolé ou subir un nouveau cycle de filtration sur membrane m, conduisant à l’obtention du rétentat m+1 et du perméat m. Le perméat ainsi obtenu est réintroduit dans le réacteur biologique (1 ).

Les microorganismes et les microorganismes cultivés sont bien connus de l’homme du métier. Il s’agit notamment de bactéries, levures, ou encore de protistes, et plus particulièrement des algues et des microalgues. Selon un mode préféré de réalisation, les microorganismes cultivés sont des protistes.

Par protiste, on entend tous les microorganismes unicellulaires eucaryotes. Les microalgues (Chlorophytes telles que Chlorella, Senedesmus, Tetraselmis, Haematococcus ; Charophytes, chrysophytes dont les diatomées ; Nannochloropsis ; Euglenophytes telle que Euglena, Phacus ; Rodophytes dont Galdieria, etc), les champignons unicellulaires (Thrautochytrides tels que Schizochytrium, Aurantiochytrium, etc), les cyanobactéries (Anabaena, Nostoc, Microcistis, Arthrospira, Spirulina, etc) ou les flagellés hétérotrophes (Crypthecodinium etc.) font partie du groupe des protistes.

Dans un mode de réalisation, les microorganismes selon l’invention sont des algues et des microalgues appartenant préférentiellement aux classes des Chiorophytes, des Rodophytes, des Thraustochytrides, des Diatomées et des Dinoflagellés.

Lorsque les microalgues sont des diatomées, elles pourront être choisies parmi les genres suivants : Nitzschia, Navicula, Gyrosigma, Phaeodactylum, Thalassiosira, etc.

Lorsque les algues ou microalgues sont des Dinoflagellés, elles pourront être choisies parmi les espèces : Alexandrium, Fragilidinium, Coolia, Ostreopsis, Fukuyoa, Gambierdiscus, Goniodoma, Pyrocystis, Pyrodinium, Pyrophacus, Ceratium, Tripos, Lingulodinium, Amylax, Gonyaulax verior Gonyaulax, Ceratocorys, Protoceratium, Amphisolenia, Dinophysis, Histioneis Ornithocercus, Phalachroma, Triposolenia, Sinophysis, Pseudophalacroma, Ansanella, Asulcocephalium, Baldinia, Biecheleria, Biecheleriopsis, Borghiella, Cystodinium, Leiocephalium, Pelagodinium, Phytodinium, Piscinoodinium, Polarella, Protodinium, Symbiodinium, Woloszynskia, Amyloodinium, Cryptoperidiniopsis, Paulsenella, Pfiesteria, Pernambugia, Dubosquodinium, Naiadinium, Scrippsiella, Theleodinium Apocalathium Crypthecodinium Stoeckeria, Chimonodinium, Thoracosphaera, Aduncodinium glandula, Tintinnophagus acutus, Azadinium, Amphidoma, Azadinium dexteroporum, Azadinium polongum, Azadinium concinnum, Azadinium caudatum, Durinskia, Galeidinium, Kryptoperidinium, Unruhdinium, Blixaea, Ensiculifera, Pentapharsodinium, Clade Monovela: Amphidiniopsis, Archaeperidinium, Herdmania, Islandinium, Protoperidinium americanum, P. fusiforme, P. fukuyoi, P. monovelum, P. parthenopes, Peridinium clade: Peridinium willei, P. volzii, P. cinctum, P. gatunense, P. bipes, P. limbatum, Protoperidinium sensu stricto: Protoperidinium abei, P. bipes, P. conicum, P. crassipes, P. divergens, P. denticulatum, P . elegans, P. excentricum, P. leonis, P. pallidum, P. pellucidum, P. pentagonum, P. punctulatum, P. thorianum, P. thulesense, Kolkwitziella, Diplopsalioideae III and Oceanica clade: Diplopsalopsis, Niea, Qia, Gotoius, Protoperidinium claudicans, Protoperidinium depressum, Diplopsalis caspica, D. lenticula, Preperidinium meunier/', Heterocapsa, Blepharocysta, Podolampas, Roscoffia, Prorocentrum dentatum, P. donghaiense, P. emarginatum, P. fukuyoi, P. mexicanum, P. micans, P. minimum, P. rhathymum, P. shikoense, P. texanum, P. triestinum, P. tsawwassenense, Prorocentrum belizeanum, P. bimaculatum, P. concavum, P. consutum, P. foraminosum, P. maculosum, P. levis, P. lima, Prorocentrum glenanicum, P. panamense, P. pseudopanamense, Plagiodinium, Prorocentrum cassubicum, Akashiwo, Chytriodinium, Dissodinium, Erythropsidinium, Gymnodinium, Gymnoxanthella, Gyrodiniellum, Lepidodinium, Nematodinium, Nusuttodinium, Paragymnodinium, Pellucidodinium, Pheopolykrikos, Polykrikos, Proterythropsis, Spiniferodinium, Warnowia, Brachidinium, Karenia, Karlodinium, Takayama, Gyrodinium, Amphidinium, Amphidinium mootonorum, A. herdmanii, A. longum, A. carterae, Torodinium, Kapelodinium, Esoptrodinium, Jadwigia, Tovellia, Blastodinium navicula, B. mangini, B. galatheanum, Blastodinium spinulosum, B. crassum, B. pruvoti, B. inornatum, Blastodinium contortum, Blastodinium oviforme, Ptychodiscus noctiluca, Ailadinium, Amphidiniella, Bysmatrum, Glenoaulax, Glenodiniopsis, Gloeodinium, Hemidinium, Heterodinium, Madanidinium, Oodinium, Palatinus, Parvodinium, Peridinium sociale, Peridiniopsis borgei, Pileidinium, Pseudadenoides, Rufusiella, Sabulodinium, Stylodinium, Thecadinium, Zooxanthella, Ankistrodinium, Apicoporus, Balechina, Bispinodinium, Ceratoperidinium, Margalefidinium, Cucumeridinium, Levanderina, Moestrupia, Testudodinium, et Togula.

Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, les protistes sont choisis parmi les genres Chlorella, Galdieria, Euglena, les cyanobactéries, les diatomées et les dinoflagellés dont notamment le genre Gambierdiscus.

Les phytotoxines sécrétées par les microorganismes sont de petites molécules bien connues de l’homme du métier.

Dans le cadre de la présente invention, les phytotoxines sont des molécules sécrétées par les microorganismes cultivés et dont le poids moléculaire est compris entre 300 et 3500 Da, notamment entre 300 et 3000 Da. Dans un autre mode de réalisation, les phytotoxines selon l’invention ont un poids moléculaire compris entre 500 et 3500 Da, entre 300 et 2900 Da, voir entre 500 et 2800 Da, voire même entre 500 et 2500 Da.

Des exemples de phytotoxines, mais sans s’y limiter, sont les composés appartenant aux familles des microcystines, des brevetoxines, des saxitoxines, des anatoxines a, des acides okadaïques, des ciguatoxines, des amphidinols, des cylindrospermopsines, des imines cycliques, telles que les gymnodimines, les spirolides, les pinatoxines, les ptéraitoxines, les prorocentrolides et les spiroprorocentrolides, les ovatoxines, les palytoxines et des anabaenopeptines. Parmi les phytotoxines, on peut notamment citer l’acide kanoïque, la ciguatera, la karlotoxine, la palytoxine, la tetrodotoxine, la yessotoxine, le gambierol, l’amphidinolide, le dinophysis, , les ostreocines, les gonyautoxines, la maitotoxine ou la scaritoxine. L’invention concerne également l’utilisation des phytotoxines obtenues selon le procédé de l’invention. Les phytotoxines présentes dans les rétentats pourront être purifiées par des méthodes connues de l’homme du métier. Les phytotoxines ainsi isolées et purifiées pourront être utilisées dans l’industrie agricole, comme pesticides, ou dans l’industrie pharmaceutique ou cosmétique en tant que composés biologiquement actifs. Une autre application des phytotoxines, voire des rétentats riches en phytotoxines, est leur utilisation en tant qu’additif dans une biomasse de microorganismes. En effet, les biomasses récoltées ont leur composition qui varie selon les conditions de culture, et l’ajout de phytotoxines est parfois nécessaire pour obtenir une standardisation de la composition des lots de biomasse. Selon l’invention, on entend par « standardisation » la reproduction des caractéristiques de la biomasse selon des valeurs standard prédéterminées, et plus particulièrement de la composition de la biomasse, par rapport à une norme ou à des caractéristiques définies. Les normes ou caractéristiques prédéfinies peuvent être des valeurs standards déterminées par l’homme du métier en fonction d’une application particulière de la biomasse standardisée obtenue. Il peut également s’agir de répondre à des normes ou des cahiers des charges officiels, comme par exemple la liste de régulation EC 1107/2009 sur l’usage de biopesticides de l’Union Européenne ou le cahier des charges Ecophyto II+ de l’ANSES (Agence Nationale de Sécurité Sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail) en France, ou toute autre règlement officiel relatif à l’emploi des phytotoxines. La standardisation permet également une industrialisation et un contrôle des produits industriels ainsi obtenus en vue de leur commercialisation.

L’invention concerne aussi l’utilisation du ou des perméats obtenu(s) selon le procédé de l’invention. A l’issue du procédé, les perméats comprenant de faibles quantités de phytotoxines sont utilisés comme milieu de culture, notamment dans un réacteur biologique. Il est entendu que selon la composition de ces rétentats, d’autres éléments peuvent être ajoutés afin d’obtenir un milieu de culture approprié aux microorganismes. Dans un mode de réalisation, le n ^ième perméat obtenu après n cycles de filtration sur membrane est réintroduit dans le réacteur biologique. Ce système fermé permet ainsi de recycler les perméats obtenus. Dans un autre mode de réalisation, les perméats sont isolés, éventuellement combinés, avant d’être utilisés comme milieu de culture. Ces perméats pourront aussi être stockés pour des utilisations ultérieures. EXEMPLES

Exemple 1

L’objectif est de recycler le perméat contenant encore des molécules actives, le perméat va être utilisé comme feed durant un nombre de boucle n jusqu’à l’extraction totale de la concentration massique du feed initiale.

Par conséquent le résultat de la concentration après un premier tour de membrane dépendra de la concentration du perméat, d’où C _kW la concentration du feed après lambda tour.

Pour obtenir des lots les plus concentrés possible entre chaque tour dans les membranes, il faut tenir compte des spécificités de chacune des phytotoxines.

Dans le cas de la cylindrospermopsine, il faut privilégier une taille de membrane inférieure à 415 Da et avec un facteur de concentration élevé.

Il est intéressant d’avoir des membranes avec des facteurs de concentration différents afin de minimiser le nombre de tours dans la membrane mais également pour récupérer un rétentat le plus concentré assurant par ailleurs l’optimisation du rendement à chaque tour n dans la membrane.

La Figure 2 représente le nombre de tour n de filtration en fonction de la concentration en phytotoxines (cylindrospermopsine) du rétentat. Les facteurs de concentration notés ck ont les valeurs suivantes : ck1 = 5, ck2=2,5, ck3=1 ,6 et ck4=1 ,25.

Lorsque le facteur de concentration est supérieur ou égale à 5 (ck1), chaque lot de rétentats est plus concentré après chaque passage dans les membranes, assurant ainsi des possibilités de lots beaucoup plus variés.

Cette méthode assure également l’augmentation de la concentration de chaque lot de rétentat à chaque passage (Figure 3). Les facteurs de concentration notés ck ont les valeurs suivantes : ck1 = 5, ck2=2.5, ck3=1 .6 et ck4=1 .25.

Le choix du facteur de concentration de la membrane va aussi influer sur l’efficacité globale du système. Selon le type de lot que l’on souhaite produire il faudra adapter le facteur de concentration de la membrane. Par exemple avec le facteur de concentration de 1 ,6 (ck3) l’évolution des concentrations des rétentats restent constantes. Mais avec un facteur de concentration plus élevé tel que 5 (ck1 ), la concentration rétentat ne fera qu’augmenter à chaque passage, permettant alors une plus grande variété de concentration pour rétablissement de plusieurs lots.

Les rendements sont calculés avec la formule suivante :

Exemple 2 : Standardisation de différents lots de biomasse en phytotoxine

Une biomasse de Gambierdiscus excentricus, connue pour produire une puissante toxine : la maitotoxine, est cultivée dans un photobioréacteur de 2.5 L, sous éclairage artificiel de longueur d’onde entre 400 et 460 nm et entre 620 et 700 nm et d’intensité de 350 pmol/m ² /s, pendant 5 jours jusqu’à obtenir une matière sèche de 1 g/i.

Le bouillon de culture de la biomasse est ensuite récupéré et filtré sur une membrane de 300 kiloDaltons pour séparer la biomasse. Le perméat restant contenant la phytotoxine passe ensuite via un filtre de 1 kiloDaltons, une fois. Les 1000 litres de rétentat vont diminuer et la phytotoxine va se concentrer dans le rétentat restant qui va ensuite être récupéré puis analysé par Chromatographie Liquide couplé à une Spectrométrie de Masse en Tandem (LC-MS/MS). L’évolution de la filtration (filtre 1000 Daltons) de la toxine maitotoxine (C164H258O68S2) d’une taille de 3380 Daltons via LC-MS/MS est suivie et présentée en Figure 5.

Le rétentat obtenu après 10 minutes de filtration comprend finalement une plus importante concentration en maitotoxine que le rétentat initial. Il peut alors être réparti dans différents lots de biomasse en fonction des concentrations en maitotoxine de chaque lot pour atteindre une concentration égale dans chacun des lots.