CAM PO DE LA INVENCIÓN

La invención se enmarca en el marco de la ciencia y tecnología de materiales al servicio de la sociedad. Específicamente, la presente invención provee un material de silicona funcionalizada con nanopartículas de cobre recubiertas con PEG con actividad antimicrobiana y antibiopelícula, de modo que permite reducir la carga bacteriana y el desarrollo de biopelículas o biofilms de bacterias patógenas en la superficie de los productos o dispositivos elaborados con el material de acuerdo con la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los microorganismos se acumulan de forma natural en una gran variedad de superficies, donde forman comunidades sedentarias y sésiles. Estas superficies incluyen tuberías domésticas e industriales, materiales biocompatibles, tales como lentes de contacto, o aparatos médicos, tales como implantes o catéteres urinarios, así como también en tejidos de plantas y animales, entre muchas otras superficies. La acumulación de estos agregados de microorganismos en forma mono- o polimicrobiana se conoce como biopelículas o biofilms y puede estar compuesto de distintas comunidades bacterianas y fúngicas.

Por otro lado, los materiales en base a silicona se utilizan cada vez con mayor frecuencia en diversas industrias, pues tienen excelente resistencia al calor, propiedades dieléctricas, repelencia al agua, estructura flexible, además de ser biocompatibles. En el caso de la cocina, por ejemplo, es posible usar silicona de grado alimenticio en moldes para horneado, en recubrimientos para moldes y en utensilios. En el caso de la industria farmacéutica, es posible utilizar dispositivos médicos elaborados de silicona para administrar medicamentos con liberación controlada, es así como las siliconas de grado farmacéutico se pueden usar en dispositivos moldeados como anillos intravaginales (IVR) o dispositivos intrauterinos (DIU) y en implantes medicados, como las endoprótesis vasculares (stents). Otro uso frecuente de la silicona en la industria biomédica es la fabricación de dispositivos tubulares como las cánulas, sondas y catéteres.

HOJAS DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Teniendo en cuenta la versatilidad de los nuevos usos de la silicona y a que se trata de una superficie que entra en contacto con alimentos, fármacos y el propio cuerpo, se hace necesario contar con un material que evite la formación de biopelículas tras el uso sostenido de los artículos y/o dispositivos elaborados con dicho material.

En particular, en el caso de los dispositivos de uso médico o clínico, las infecciones asociadas a la atención de salud (IAAS) aumentan la morbilidad, mortalidad y los costos en salud. Entre ellas, la infección del tracto urinario asociada a catéter (CAUTI) es una de las más prevalentes, donde el uso de catéter urinario permanente (usado por más de 24 h) es una de las principales causas de bacteriuria y bacteremia. Estas infecciones siguen sin ser controladas a pesar del mejoramiento de prácticas clínicas y el desarrollo de dispositivos médicos con propiedades antibacterianas. Por lo tanto, estas infecciones son un campo de investigación vigente que requiere nuevas estrategias de control y prevención.

El material ideal para la fabricación de un catéter urinario debe ser biocompatible, radiopaco, resistente a la incrustación y colonización de microorganismos, causante de baja incomodidad, durable y asequible a un precio razonable. No obstante, no existe en el mercado ningún catéter urinario que cumpla todos estos requisitos. Los materiales más utilizados en la fabricación de estos dispositivos son el látex, la silicona, el poliuretano (PU) y el policloruro de vinilo (PVC). Los catéteres de látex y de PVC son más económicos, pero pueden presentar incrustación rápida y mayor incidencia en la generación de alergias. Los catéteres de PU tienen una buena biocompatibilidad, pero su mayor rigidez en comparación con la silicona genera incomodidad en algunos pacientes. Actualmente, el uso del PU está más extendido en la fabricación de catéteres venosos centrales que en catéteres urinarios. En contraste, la silicona es más adecuada para el sondaje permanente al tener alta biocompatibilidad, ausencia de respuestas alérgicas, buena estabilidad química y térmica y además una larga vida útil (90 días). La principal desventaja de la silicona es su mayor costo en relación con los otros materiales, y que podría ser colonizada por microorganismos.

Actualmente existen una variedad de catéteres urinarios que han sido diseñados con el objetivo de reducir el riesgo de infección. Entre estos están los catéteres impregnados con antibióticos (nitrofural, minociclina y rifampicina), oxido de plata y aleaciones de plata. Sin embargo, estos catéteres tienen poco efecto sobre la adherencia de uropatógenos y en ensayos clínicos han sido efectivos en reducir la incidencia de bacteriuria asintomática pero no de CAUTI. Estudios más recientes han evaluado el uso de nanopartículas de cobre (NPCu) y plata (NpAg) para desarrollar materiales antimicrobianos que puedan ser usados en dispositivos médicos. Por ejemplo, Sehmi et al. (2015), embebieron NPCu en poliuretano y silicona y mostraron que estos polímeros tienen efecto antimicrobiano in vitro contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. De igual manera, Bailo et al., desarrollaron catéteres impregnados con NPCu y NpAg que tenían actividad antimicrobiana in vitro pero fallaron en prevenir la formación de biopelícula ¡n vivo.

Estado Del Arte

En el arte previo se conocen diversas soluciones que abordan el control o prevención del crecimiento microbiano y formación de biopelículas de organismos patógenos en materiales de silicona y dispositivos de uso médico.

En la patente US7993390B2 se proporciona un dispositivo médico implantable o insertable resistente al crecimiento microbiano y a la formación de biopelículas, tanto en el dispositivo como en su entorno. Los dispositivos descritos incluyen una región de polímero de matriz biocompatible, un agente antimicrobiano y/o un inhibidor de la formación de biopelícula. Dentro de las alternativas elaboradas se muestra un stent ureteral de polímero donde el agente bioactivo es triclosán. Si bien se trata del mismo problema técnico, la solución empleada es diferente, ya que emplean triclosán como compuesto activo inhibidor de formación de biopelícula.

Sehmi, Sandeep K., et al. (2015) emplea nanopartículas de cobre de 2,5 nm como compuesto antimicrobiano en materiales de silicona y poliuretano de grado médico para uso intrahospitalario. No obstante, se habla de encapsulamiento por hinchazón y contracción, por lo que, en el caso de la silicona y considerando el tamaño inferior de las nanopartículas de cobre, no se trata del mismo tipo de material. Además, la característica deseada es reducir la contaminación microbiana en superficies que se manipulan con frecuencia dentro y alrededor de las salas del hospital, tales como barandillas de la cama, mesas, placas de empuje, etc. No se aborda el problema de evitar o reducir la formación de biopelícula en el material elaborado.

Iqbal, Zohora, et al. (2018) describe en efecto de la esterilización en superficies de silicona modificadas. Se enfoca en la estabilidad de los biomateriales de dispositivos médicos considerando todas las etapas de preparación para la cirugía, incluida la esterilización, por lo que se explora el efecto de cinco métodos de esterilización estándar (autoclave, calor seco, peróxido de hidrógeno, óxido de etileno gaseoso y haz de electrones) en tres revestimientos superficiales: PEG, pSBMA y pMPC. Los datos mostrados sugieren que los tratamientos en autoclave y EtO son adecuados para el PEG- silano. Regmi, Amrit, et al. (2019) describe la formación de nanopartículas de cobre, elaboradas con dos concentraciones diferentes de precursores de cobre mediante el método de coprecipitación utilizando NaBH ₄ como agente reductor y (PEGeooo) como estabilizador. En el documento se evalúa la actividad antibacteriana de estas nanopartículas. Se indica que la actividad antimicrobiana incrementa en función de la concentración de nanopartículas, basado en pruebas in vitro en placas, pero no analiza el efecto sobre biopelículas.

En resumen, aunque existen productos orientados a la prevención de crecimiento microbiano en catéteres de uso médico, estos no son demandados por los establecimientos hospitalarios públicos de alta complejidad, debido a su mayor costo y a la baja efectividad observada en ensayos clínicos para reducir la incidencia de CAUTI. Por lo tanto, en la actualidad existe la necesidad de un catéter comercial con actividad antibiopelícula que prevenga ese tipo de infecciones, lo que es particularmente relevante para los pacientes inmunodeprimidos y en estado crítico, ya que son los grupos de mayor riesgo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Metodología para la síntesis del material de nanopartículas de cobre pegiladas embebidas en silicona.

Figura 2. Espectros UV-Vis en experimentos cinéticos de la liberación de iones cobre, (a) Elaboración curva de calibrado con distintas concentraciones y (b) diferentes tiempos de exposición en muestras del material con una concentración de NPCu de 2,2 ± 0,10 pM.

Figura 3. A: Determinación de la actividad antimicrobiana frente a E. coli ATCC 25922 a 2 tiempos de incubación, se muestra el % de reducción en control (silicona sin tratamiento), PCS (NPCu.PEG ₂ ooo) y CS (NPCu). B: Determinación de las concentraciones de NPCu-PEG ₂ ooo que confieren actividad antimicrobiana al material, en donde se analizaron 4 concentraciones distintas de nanopartículas: 1. 2,2 ± 0,10 pM, 2. 5,6 ± 0,28 pM , 3. 12,1 ± 0,89 pM, y 4. 13,8 ± 0,81 pM.

Figura 4. Determinación de la actividad antibiopelícula frente a E. coli y K. pneumoniae. Se evaluó la formación de biopelícula sobre los films Cl, C2 y silicona sin tratar (control) en un sistema de flujo continuo tras 24 h de incubación a 37 -C. La biopelícula formada se derminó utilizando el método de tinción con cristal violeta eluido, el cual fue cuantificado mediante absorbancia a ODsgsnm- Análisis estadísticos fueron realizados con la prueba de Mann-Whitney. Se muestra para cada film el valor de significancia estadística.

Figura 5. M ¡orografías electrónicas de barrido representativas de implantes de silicona (A-B) y Material Cl (B-C) extraídos de vejigas murinas infectadas con E. coli a las 96 h post infección. Las figuras D y E corresponden a implantes en ratones no infectados con E. coli. Las magnificaciones corresponden a 16000X (A, C y E)y 30.000X(B, D, y F).

Figura 6. Evaluación carga bacteriana. Se cuantifico la infección en tracto urinario asociada a catéter (CAUTI) a las 96 horas. Hembras C57/BI6 de 8-10 semanas fueron inoculadas con catéteres sin tratamiento (silicona) y catéteres C2 e infectadas con = 1 x 107 CFU de E. Coli. Posteriormente se cuantificaron las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) en homogenizados de vejiga y riñones.

Figura 7. Ensayo de viabilidad celular. Se cuantifico la fluorescencia emitida a 590 nm (exc. 530nm) por la resazurina luego de 24 h de exposición de células humanas HepG2 a Cl y C2 y silicona sin tratar (Si). Como control se incubaron las células solo con medio DMEM, 10% suero bovino fetal 1% antibióticos. No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos utilizando la prueba de Mann-Whitney.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención corresponde a un material a base de silicona y nanopartículas de cobre (NPCu) recubiertas con polietilenglicol (PEG) que exhibe actividad antimicrobiana y antibiopelícula, es decir, que permite reducir la carga bacteriana y la formación de biopelícula. Las propiedades antiadherentes del PEG y la actividad antimicrobiana del cobre, actúan de manera sinérgica, generando resistencia a la adsorción de proteínas y a la adhesión de bacterias, y al mismo tiempo eliminan la carga bacteria, lo que resulta en una reducción significativa en la formación de biopelícula. En el caso de usos médicos, el material reduce el crecimiento de microorganismos y desarrollo de biopelículas, y por lo tanto el riesgo de infección.

En modelo murino de infección urinaria asociada a catéter (CAUTI) se determinó que la implantación intravesical de un catéter de silicona y nanopartículas de cobre (NPCu) recubiertas con polietilenglicol (PEG) mostró una carga bacteriana en vejiga y riñón comparado con un catéter de silicona. Adicionalmente se observó a la microscopía electrónica de barrido una menor formación de biopelícula en el catéter de silicona y nanopartículas de cobre (NPCu) recubiertas con polietilenglicol (PEG) comparado con el catéter de silicona. Ambos catéteres produjeron un grado de inflamación leve al ser comparados con una vejiga normal.

Se provee un material de silicona funcionalizada con nanopartículas de cobre recubiertas con PEG (pegiladas) con actividad antimicrobiana y antibiopelícula, que comprende:

Silicona de superficie activada y recubierta con una solución polietilenglicol, en donde el polietilenglicol se selecciona de entre PEG silano, APTA o N-silano. El PEG-silano se selecciona preferentemente de PEGe g silano, PEGg 12 silano, PEG2124silano, y el N-silano es N-6 silano; y Nanopartículas de cobre (NPCu; con un diámetro de entre 80-100 nm) con polietilenglicol.

La silicona es biocompatible, estable química y térmicamente, presentando una larga vida útil. La silicona es activada químicamente y luego funcionalizada con una solución de polietilenglicol (proceso de pegilado).

Las partículas de cobre, y especialmente las nanopartículas de este metal, tienen una potente actividad antimicrobiana. Se ha demostrado que las NPCu inducen la degradación de DNA plasmídico de una manera dosis dependiente en bacterias Gram positivo y Gram negativo. Otros estudios han mostrado que un menor tamaño de las partículas de cobre favorece la actividad antimicrobiana debido a su mayor habilidad para ingresar al citoplasma bacteriano, lo que resulta en un aumento del estrés oxidativo intracelular. No obstante, esta misma propiedad debe tenerse en cuenta para evitar efectos adversos como citotoxicidad y genotoxicidad en el humano. El material desarrollado tiene NPCu de diámetro medio de 80- 100 nm, y demostró ser biocompatible e inocuo, al ser evaluado in vitro en una línea celular humana.

Una ventaja adicional del uso de NPCu como agente antimicrobiano en comparación con los antibióticos es la menor generación de resistencia.

El PEG es un poliéter con fórmula H-(O-CH2-CH2)n-OH que es preparado mediante la polimerización del óxido de etileno y está disponible comercialmente en un amplio rango de masas moleculares desde 300 g/mol hasta 10.000.000 g/mol. Por otro lado, la pegilación se refiere al proceso de unión covalente y no covalente o amalgamación de cadenas poliméricas de PEG a moléculas y macroestructuras. Es importante mencionar que las características biológicas y farmacológicas de un material pegilado dependerán directamente del tamaño y del peso molecular del PEG utilizado. En el desarrollo de la invención, se evaluaron pesos entre 600 a 4000 g/mol. Las NPCu se elaboraron a partir de un precursor sulfato de cobre (CuSO4’5H ₂ O), ácido ascórbico (AA, 0,01 M) como agente reductor y PEG de entre 600 a 4000 g/mol como agente estabilizante.

Las NPCu pegiladas obtenidas son incubadas con la silicona recubierta con polietilenglicol, obteniendo de este modo, el material de silicona con actividad antimicrobiana y antibiopelícula de acuerdo con la invención.

Proceso De Elaboración Del Material De La Invención

Los filmes de silicona a emplear deben estar limpios y su superficie es activada, lavada y secada, previo a la funcionalización con una solución de polietilenglicol (proceso de pegilado). El exceso de solución se remueve y el material es lavado y secado (Fig. 1).

Activación. La primera etapa contempla proveer el material de silicona y activar la superficie. Para esto, los filmes de silicona se limpiaron antes de su uso. La activación de la superficie de silicona se llevó a cabo mediante tratamiento con HCI, H2SO4/H2O2 (1:1) o una mezcla de solventes (H2O /HCI/ H2O2) durante 10 a 15 h a temperatura ambiente, lo que genera una superficie hidrófila recubierta de grupos silanoles (Si-OH). Posteriormente, el material se lava, se somete a sonicación, se seca con nitrógeno y se sumergieron inmediatamente en la solución de polietilenglicol respectiva.

Funcionalización. La funcionalización se realiza sumergiendo la silicona en una solución de polietilenglicol, preferentemente en una proporción de 1:5:5 a 1:10:10 de PEG-silano, ácido acético (0,1 M) y alcohol isopropílico respectivamente, durante 10 -15 h a temperatura ambiente.

Posteriormente, los filmes se lavan en etanol y agua destilada y luego se elimina el exceso de material no funcionalizado. Los filmes se secaron con nitrógeno y se almacenaron secos en condiciones ambientales. El material seco se almacena a temperatura ambiente.

Estabilización. Se elaboran las nanopartículas de cobre pegiladas, para lo cual se adiciona CUSO4-5H ₂ O, ácido ascórbico y solución de PEG.

Se mezcla el sulfato de cobre con PEG, el sulfato de cobre utilizado fue CuSO4’5H ₂ O (0,01 M).

Se prepara una solución de ácido ascórbico en agua y NaOH, y luego se agregan sobre la solución de cobre y PEG, agitando constantemente. Después de agitar, se separa el precipitado, preferentemente mediante centrifugado, redispersando las nanopartículas en agua. Opcionalmente, se repiten los pasos de centrifugado y redispersión en agua hasta eliminar el exceso de PEG.

La superficie de silicona previamente funcionalizada con polietilenglicol fue incubada con las NPCu sintetizadas por un periodo de 10-15 h para promover la interacción química entre las cadenas de polietilenglicol presentes en la superficie de la silicona con las NPCu.

La concentración óptima de las NPCu durante la incubación se selecciona de entre: 2 a 14 pM; preferentemente se selecciona de entre: 2,2 ± 0,10 pM, 2. 5,6 ± 0,28 pM , 3. 12,1 ± 0,89 pM, y 4. 13,8 ± 0,81 pM. De este modo se obtiene el material de la invención de silicona funcionalizada con nanopartículas de cobre recubiertas con PEG (pegiladas); con actividad que permite reducir la formación de biopelícula.

Ventajas

El material de acuerdo con la invención se diferencia de otras alternativas en que además de conferir al material una potente actividad antimicrobiana otorgada por la presencia de nanopartículas de cobre, logra prevenir la adsorción de proteínas sobre su superficie, lo que su a vez contribuye a la prevención o reducción de la formación de biopelícula. Un beneficio adicional es que el uso de cobre como componente activo disminuye la probabilidad de generar resistencia antimicrobiana. Además, los materiales elaborados de acuerdo con la invención no son citotóxicos. La concentración de los componentes de la invención es tal que es la mínima que permite obtener la actividad antimicrobiana y prevenir o reducir la formación de biopelícula en el material de silicona.

El material demuestra una disminución de la carga bacteriana ¡n vivo, por ejemplo, al analizar vejigas y riñones en los ensayos a las 96 h post-infección. La disminución del recuento bacteriano es indicador del efecto antibacteriano del material de acuerdo con la invención, al obtener valores de unidades formadoras de colonia (UFC) menor a las reportadas en el uso de silicona tradicional.

El material también demostró su actividad antibiopelícula o capacidad para reducir la colonización bacteriana y la formación de una capa de bacterias en la superficie el material al ser evaluado en un sistema de flujo continuo, con fluidos que contienen bacterias y de composición similar a la orina. Campo De Aplicación

Si bien el problema abordado inicialmente fue el desarrollo de catéteres urinarios que eviten la formación de biopelícula, el material de acuerdo a la invención permite elaborar diversos productos en donde se pueda emplear silicona sometida al mismo tipo de curado.

Así, es posible usar el material en uso farmacéutico, médico y alimentos, entre otros. Dentro de los dispositivos de uso médico se encuentran los descritos en la Tabla 1 y, en general, cualquier dispositivo que se pueda elaborar o recubrir con silicona de grado médico.

Tabla 1: Ejemplo de dispositivos que podrían elaborarse con el material de la invención.

• Catéter urinario de silicona • Mascarilla laríngea de silicona

• Sonda Foley • Mascara para anestesia de silicona

• Catéter venoso central • Ambú (resucitador manual) de

• Catéter venoso central tunelizado silicona

• Catéter venoso central Hickman • Bolsas de silicona

• Catéter subcutáneo • Mascarillas de oxigeno de silicona

• Catéter venoso periférico • Parches de silicona

• Catéter intravenoso periférico (vía • Recolectores de silicona venosa) • Sondas de aspiración de silicona

• Catéter percutáneo de inserción • Sondas nasogástricas de silicona periférica • Sondas de alimentación de silicona

• Catéter pig tail • Drenajes de silicona: Jackson, Blake,

• Línea arterial de silicona plano, hemosuc/hemovac

• Sondas de irrigación continua • Filtros de ventilador mecánico de

• Catéter de hemodiálisis silicona

• Tubos de silicona • Swan-Ganz de silicona

• Mangueras de silicona • Conservadores de alientos de silicona

• Stent ureteral de silicona • Bolsas de nutrición parenteral de

• Mascarillas de silicona silicona

• Mascarillas de ventilador de silicona • Bolsas de sueros y hemoderivados de

• Implantes de silicona silicona

• Prótesis de silicona: todas • Bajadas de suero de silicona

• Copas menstruales de silicona • Válvulas de silicona

• Tubos endotraqueales de silicona En el caso de utensilios de cocina, también es posible usar el material de silicona funcionalizada con nanopartículas de cobre de acuerdo con la invención, pues al ser inocua para los alimentos, es segura para su uso en la cocina.

En el caso de la industria farmacéutica, muchos pacientes no toman sus medicamentos según lo prescrito y necesitan dispositivos médicos elaborados de silicona para administrar medicamentos con liberación controlada. El material de silicona funcionalizada con nanopartículas cobre, de acuerdo con la invención, permite obtener nuevos materiales de silicona con grado farmacéutico que presenten actividad antibacteriana y antibiopelícula.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Elaboración del material a base de silicona y nanopartículas de cobre pegiladas para la fabricación de catéteres

Materiales Y Reactivos:

Los filmes de silicona (diámetro 20 mm, espesor 0,024") fueron suministrados por Interstate IPS (USA). Se usó agua desionizada para enjuagar las superficies de PDMS y preparar soluciones acuosas. 2- [metoxi(polietilenenoxi)-6-9-propil]trimetoxisilano, 3-aminopropiltrimetoxisilano, N-(6- aminohexil)aminopropiltrimetoxisilano fueron adquiridos desde Gelest SA (USA). Peróxido de hidrógeno, sulfato de cobre (II), hidróxido de sodio, L-ácido ascórbico, polietilenglicol (PM g/mol: 2000, 3000, 4000) fueron adquiridos desde Sigma-Aldrich.

Se elaboraron seis materiales para las pruebas de prototipo (ver Tabla 2).

Tabla 2: Formulaciones prototipo

PEG silanoe-g: 2-[metoxi(polietilenoxy)6 ₉ propil]trimetoxisilano; APTA: 3-aminopropiltrimetoxisilano;

N-6 amino: N-(6-aminohexil)aminopropiltrimetoxisilano Los filmes de silicona se limpiaron mediante sonicación en etanol/agua (1:1, v/v) durante 10 min antes de su uso. La activación de la superficie de silicona se llevó a cabo mediante tratamiento con HCI (30%) durante 12 h a temperatura ambiente. Las muestras se lavaron 3 veces en agua, se sonicaron en agua durante 10 min, se secaron con nitrógeno y se sumergieron inmediatamente en la solución de PEG- silano respectiva. La funcionalización se realizó mediante una solución de 1:5:5 de PEG-silano, ácido acético 0,1 M y alcohol isopropílico respectivamente, durante 12 h a temperatura ambiente. Posteriormente, los filmes se lavaron dos veces en etanol y dos veces en agua y luego se sonicaron en agua durante 2 min para eliminar el exceso de material no funcionalizado. Los filmes se secaron con nitrógeno y se almacenaron secos en condiciones ambientales.

Las NPCu se obtuvieron por medio de una síntesis química, utilizando como precursor sulfato de cobre (CuSO ₄ *5H ₂ O), ácido ascórbico (AA - 0,01 M) como agente reductor y PEG de diferentes tamaños (2000-3000-4000 g/mol) como agente estabilizante.

Se preparó un conjunto de soluciones mezclando 4,0 mL de CuSO ₄ ’5H ₂ O (0,01 M) con 16,0 mL de PEG ₂ ooo a diversas concentraciones. Se preparó una solución madre de PEG ₂ ooo con una concentración de 0,5 M y se diluyeron varios volúmenes de esta solución madre (8, 4, 2 mL) a 16 mL con agua, y fueron estas soluciones más diluidas las que se agregaron a la solución de cobre. En balones separados, se diluyeron 0,5 mL de ácido ascórbico 0,1 M en 10 mL de agua y 3,0 mL de NaOH 0,5 M en 10 mL de agua. A continuación, se mezclan las soluciones de ácido ascórbico y el hidróxido de sodio, y luego se agregan sobre la solución de cobre sobre agitación. La solución completa se mantuvo en agitación durante otros 30 minutos.

Después de agitar, las soluciones se centrifugaron a 6000 rpm durante 30 minutos. Los precipitados se recogieron y se redispersaron en agua. Las NPCu obtenidas se centrifugaron a la misma velocidad durante otros 15 minutos, dos veces, para eliminar el exceso de PEG.

La superficie de silicona previamente funcionalizada con PEG-silano fue incubada con NPCu sintetizadas por un periodo de 12 h para la obtención de la interacción química entre las cadenas de PEG-silano presentes en la superficie de la silicona con las NPCu.

Posteriormente se hizo la caracterización fisicoquímica de los materiales prototipo, esto es relevante para la utilización de este material en la fabricación de dispositivos médicos.

En la Fig. 2 se muestra la liberación de iones cobre de la nanoformulación de NPCu 2,2 ± 0,10 pM, donde la liberación de cobre se determinó por medio del mecanismo de disolución-desorción, evidenciada en el experimento tipo pseudo-isoterma de adsorción, que permite obtener la concentración máxima de cobre liberado. Se observan que la máxima liberación de cobre se obtiene en las 72 horas, donde en promedio se libera como máximo 0,074 pM y como mínimo 0,045 pM de NPCu.

Ejemplo 2: Evaluación de la capacidad antimicrobiana. Selección de la mejor alternativa de PEG-silano y concentración de NPCu.

Se realizó la evaluación de capacidad antimicrobiana con la formulación del material Filme /PEG ₆ g silano/PEG2000 +NPCu) con un tamaño NPCu: 94,3 ± 1,2 nm). Posteriormente, se determinaron las menores concentraciones necesarias de NPCu, obteniéndose las condiciones Cly C2 (ver Tabla 3):

Tabla 3: Características del material evaluado

Actividad Antimicrobiana

Se determinó la actividad antimicrobiana frente a E. coli ATCC 25922 a 2 tiempos de incubación, en dos tipos de muestras. En la Figura 3A se aprecia el efecto del uso de silicona funcionalizada, en donde el material PCS (NPCU.PEG2000) logra reducir el 100% de la carga bacteriana incluso a 1 hora de incubación a 37-C, versus el material CS (NPCu) que logra la reducción tras 2 horas.

Se evaluó además la actividad antimicrobiana de cuatro filmes con distintas concentraciones de NPCu frente a un aislado clínico de infección urinaria: E. coli ATCC 25922. La Figura 3B muestra que dos de las concentraciones analizadas logran reducir el 100% de la carga bacteriana.

Adicionalmente, la formulación C1 fue evaluada frente a su capacidad de disminuir la bacteriuria y evitar la bacteriemia en un modelo murino de infección urinaria asociada a catéteres (UFC = 1 x 107 de E. coli), observándose que las biopelículas de E. coli no se producen ¡n vivo en el material C1 durante el curso de la infección.

Ejemplo 3: Ensayos de actividad antibacteriana frente a E. coli, K. pneumoniae, E. faecalis y P. aeruginosa en diferentes tiempos de incubación.

En la tabla siguiente se comparan los porcentajes de reducción de la carga bacteriana obtenidos para los materiales C1 (NPCu 2,2 ± 0,10 pM) y C2 (NPCu 5,6 ± 0,28 pM) en cada tiempo de incubación y frente a las cuatro bacterias utilizadas. En general, los dos films mostraron actividades antibacterianas similares, obteniendo una mayor reducción de la carga bacteriana a las 6h de incubación. Para ambos materiales los porcentajes de reducción frente a E. coli y K. pneumoniae fueron mayores al 90% en todos los tiempos evaluados y frente a E. coli la reducción en algunos casos fue incluso del 100%. Lo anterior es particularmente importante desde el punto de vista epidemiológico dado que E. coli y K. pneumoniae son los agentes etiológicos de CAUTI más importantes en Chile, USA y Europa. En el caso de E. faecalis y P. aeruginosa el porcentaje de reducción alcanzó en algunos casos valores superiores al 80%.

Estos resultados demuestran la influencia de la química de la superficie en la interacción con las bacterias, que a su vez tiene un efecto significativo sobre la eficacia antimicrobiana de las superficies de NPCu. En ese sentido, el aumento de la liberación de iones cobre en el área de contacto de bacterias/superficie en el material de la invención conduce a una mayor eficiencia en la eliminación de bacterias.

Tabla 4: Reducción de la carga bacteriana en diferentes tiempos de incubación*.

Bacteria Tiempo %Reducción % Reducción

Promedio Promedio

C1 C2

2h 94.6 100

E. coli 3h 94.3 100

4h 96.2 100

6h 100 100

2h 75.2 75.1

K. pneumoniae 3h 97.5 75.2

4h 87.1 74.8

6h 99.8 93.2

2h 69.4 45.0

E. faecalis 3h 59.5 76.6

4h 55.8 48.8

6h 77.1 80.9

2h 69.0 71.4

P. aeruginosa 3h 66.7 85.0

4h 68.3 71.4

6h 95.8 83.6

* Reducción respecto al número de bacterias recuperadas en los films de silicona controles. Se muestra el promedio de dos ensayos realizados en duplicado.

Tal como muestra la Tabla 4, los films de material Cl y C2 reducen la carga bacteriana de E. coli, K. pneumoniae, E. faecalis y P. aeruginosa en comparación con los films de silicona. Ejemplo 4: In vitro - Sistema de flujo continuo para evaluar la formación de biopelícula

Se procedió a determinar la capacidad de formación de biopelículas en el material prototipo C1 (MPCu 2,2 ± 0,10 pM) y C2 (NPCu 5,6 ± 0,28 pM) en un sistema de flujo continuo, utilizando la cepa E. coli uropatogénica ATCC 25922 y K. pneumoniae ATCC 700603.

Sistema de flujo continuo: Se cargó un preinóculo a 37°C de 10 mL de LB con K. pneumoniae, o de LB suplementado con Amp para E. coli ATCC 25922 (transformada con el plásmido pDiGc). Al día siguiente, los films (Cl, C2, control Si) fueron esterilizados por 30 min (15 min por lado) con radiación UV bajo campana. También se esterilizó todo el sistema de flujo continuo por separado. Los films estériles se colocaron en duplicado en 4 cámaras del sistema (2 films en cada una) en condiciones de esterilidad. Se fijó un flujo continuo de 3.3 mL/min por 24 h a 37°C.

Cuantificación de biopelícula: Transcurrida la incubación por 24 h a 37 °C, los films se lavaron con 4 mL de PBS y luego se fijaron con metanol 70% por 7 min (7). Posteriormente, se extrajo el metanol, los films se dejaron secar y se incubaron con cristal violeta al 0.5% por 15 min. Luego se realizaron 3x10 mL lavados con agua destilada. Para cuantificar la tinción, los films se sumergieron en 1 mL de ácido acético 33%, se aplicó vortex por 20 s, y se cuantificó a ODsgs nm de la solución. Los ensayos se realizaron en duplicado para cada prototipo.

Análisis estadísticos: Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para determinar diferencias significativas en la formación de biopelículas de E. coli o K. pneumoniae en los films Cl o C2 en comparación con los films controles (silicona).

Resultados: El tiempo de evaluación para la formación de biopelícula fue de 24 h en medio AUM. Como se esperaba, las bacterias evaluadas formaron una biopelícula sobre la superficie de silicona control. Es de destacar que K. pneumoniae generó una biopelícula 6 veces mayor en comparación con E. coli, lo que es similar a lo reportado en otros estudios en que se evaluó la producción de biopelícula en estas bacterias. Notablemente, los films Cl y C2 redujeron significativamente (p < 0.05) la formación de biopelícula, tanto para E. coli como para K. pneumoniae (Figura 4). En particular, para Cl, la reducción de biopelícula frente a E. coli y K. pneumoniae fue de 5.2 y 2.7 veces, respectivamente. De manera similar, para C2, la reducción en la formación de biopelícula frente a E. coli y K. pneumoniae fue de 7.9 y 2.8 veces, respectivamente.

No se observó diferencias estadísticas en la reducción de la formación de biopelícula entre Cl y C2. Por lo tanto, los films Cl y C2 reducen significativamente la formación de biopelículas generadas por E. coli ATCC 25922 y K. pneumoniae ATCC 700603 en comparación con los films de silicona. Ejemplo 5: In vivo - Experimentos en modelo murino de CAUTI (infección del tracto urinario asociada a catéter)

Ratonas hembras C57BL/6 de 26-35 g de peso, 8-10 semanas de edad fueron divididos en 2 grupos, grupo C1 y grupo control (5 animales/grupo). Se colocó una pieza de tubo de polietileno de 7 mm (PE10 BD cat N- 427400) en una aguja de metal estéril 30Gxl/2 (0.3 mm x 13 mm BD Precision Glide) seguida por un segmento de 5 mm de material prototipo C1 o el control. La aguja se colocó en la abertura uretral y el tubo se desplazó sobre la aguja hasta que el segmento de material de la invención o el control se depositó en el interior de la vejiga. La aguja y el tubo de 7 mm fueron posteriormente removidos.

Las ratonas fueron infectados inmediatamente después de la inserción del segmento de silicona, en donde se les administró el inoculo en 50 pL de PBS IX a una velocidad de 10 pL /s, usando una jeringa de tuberculina. El número de UFC presente en el inoculo correspondió a ~ l x 107 UFC de E. coli.

Evaluación Formación De Biopelícula.

Los dispositivos (C1 y silicona) recuperados desde las vejigas se fijaron en glutaraldehído al 2,5% y se prepararon para microscopía electrónica de barrido (SEM), para evaluar la formación de biopelícula.

Los implantes controles (Silicona) de las ratonas infectadas estaban recubiertas de bacterias en el lumen que se observan incrustadas en lo que parece ser una matriz extracelular (Figura 5a y b) a diferencia del implante C1 en el que se observan bacterias en ausencia de biopelícula (Figura 5c y d). Las ratonas con ambos implantes, pero no infectadas no presentaron bacterias en los implantes, aunque si es posible pensar que los implantes pueden estar recubiertos con factores del hospedero presentes en la orina (Figura 5 e y f).

Evaluación Carga Bacteriana

Las ratonas fueron eutanasiadas a las 96 horas post infección y posteriormente las vejigas y riñones fueron removidos, homogenizados y diluidos en PBS y plaqueados en medios agar LB/ampicilina en diluciones 10 ¹ a 10 ⁸ . La carga bacteriana fue determinada después de una incubación por 24 a 48 h. a 37° C y fue expresada como UFC total por órgano. Análisis estadísticos: Se utilizó la prueba T de student para determinar diferencias significativas en el número de unidades formadoras de colonia (UFC) de E. coli en homogenizados de vejiga y riñón de ratones con catéter C1 en comparación con los controles (catéter de silicona).

Resultados: En los animales con implantes Cl, la bacteria E. coli alcanzo un título promedio de 1,05 x 10 ³ UFC/ml a las 96 horas en las vejigas, lo que fue significativamente menor (P =0.432) que los títulos bacterianos (2xl0 ³ UFC/ml) recuperados de las vejigas de los animales con implante control (Figura 6a). Se observo un resultado similar para los riñones, donde los ratones con implante Cl alcanzaron un promedio de l,3x 10 ³ UFC/ml lo que fue significativamente menor (P =0.499) que los títulos bacterianos (2xl0 ³ UFC/ml) recuperados de los riñones de los animales con implante control (Figura 6b).

Evaluación inflamación. Para los análisis histológicos, las vejigas se fijaron en formaldehido tamponado durante 2 horas y se deshidrataron en etanol al 70% durante la noche a 4°C. A continuación, se incrustaron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para microscopía óptica.

Resultados: La implantación de los catéteres en la vejiga y la infección con E. coli provocaron cambios histológicos en la vejiga a nivel de epitelio, submucosa y muscular. Los cambios correspondieron a un grado leve (1 de 3). Aunque no existen diferencias significativas en los grados de inflamación entre los En los animales con implantes Cl y control, se observó que en los animales control una cistitis linfocítica a neutrofílica leve, perivascular, crónica activa, con leve edema y leves cambios epiteliales, comparada con la cistitis linfocítica leve, perivascular, crónica observada en los animales con implante Cl .

Ejemplo 6: Evaluación in vitro de citotoxicidad del material en células Hep-G2:

Se utilizó para los ensayos la línea celular HepG2 de carcinoma hepatocelular (pasaje 19). Las células fueron incubadas en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibiótico (penicilina y estreptomicina). Los cultivos se mantuvieron a 37°C con una atmósfera humedecida con 5% de CO2.

Para las mediciones se utilizó el kit "In vitro toxicology assay, Resazurin based" (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany; Cat No. TOX8-1KT).

En la Fig. 7 se pueden observar los resultados de la cuantificación de la fluorescencia emitida por la resazurina, la cual da cuenta de metabolismo celular activo. Los resultados observados demostraron que la hipótesis alternativa para un p<0.05 se rechaza y las medias de cada condición experimental son similares, por lo tanto, no hay diferencia significativa en las células que fueron expuestas al medio con el material Cl o C2 en comparación al control sin films o con films de silicona sin modificar (Si). Por lo tanto los materiales elaborados de acuerdo a la invención no son citotóxicos para las células eucariontes en las condiciones estudiadas.

Ejemplo 7: Propiedades del material sometido a condiciones de uso.

Evaluación de las propiedades físicas, antimicrobianas y antibiopelícula en material sometido a esterilización por radiación UV y autoclave.

Las muestras fueron sometidas en la fase in vitro a procesos de esterilización por irradiación UV. Como resultado los materiales mostraron capacidad antimicrobiana.