Die Erfindung betrifft ein Interferenzreflexionsmikroskop sowie ein Verfahren zum Analysieren einer Probe mittels eines solchen Interferenzreflexionsmikroskops.

Mikroskope werden grundsätzlich für unterschiedliche Arten der Untersuchung oder Beobachtung von Proben eingesetzt. Eine mögliche Ausführung eines Mikroskops ist ein Interferenzreflexionsmikroskop, welches typischerweise eine Probe mit einem Anregungslicht beleuchtet und reflektiertes Licht zur Auswertung heranzieht. Dabei können aufgrund von Interferenzeffekten Informationsgehalte im Licht entstehen, welche beispielsweise eine photometrische Massenspektrometrie von Molekülen erlauben.

Eine beispielhafte Implementierung ist in Young et al., Science 360, 423-427 (2018) sowie dem zugehörigen Begleitmaterial offenbart. In dieser Implementierung wird ein Central Obstruction Filter verwendet, um Speckle-Muster zu unterdrücken.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Interferenzreflexionsmikroskop bereitzustellen, welches im Vergleich zu bekannten Ausführungen alternativ oder besser ausgeführt ist. Es ist des Weiteren eine Aufgabe der Erfindung, ein zugehöriges Verfahren zum Analysieren einer Probe bereitzustellen.

Dies wird erfindungsgemäß durch ein Interferenzreflexionsmikroskop und ein Verfahren gemäß den jeweiligen Hauptansprüchen erreicht. Vorteilhafte Ausgestaltungen können beispielsweise den jeweiligen Unteransprüchen entnommen werden. Der Inhalt der Ansprüche wird durch ausdrückliche Inbezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.

Die Erfindung betrifft ein Interferenzreflexionsmikroskop. Das Interferenzreflexionsmikroskop weist eine Lichtquelle, eine Beleuchtungsoptik, eine Probenanordnung, eine Detektionsoptik und einen Detektor auf. Die Beleuchtungsoptik richtet Licht der Lichtquelle als Anregungslicht auf die Probenanordnung. Die Detektionsoptik richtet von der Probenanordnung reflektiertes Licht auf den Detektor. Zweckmäßig ist vorgesehen, dass die Lichtquelle räumlich kohärent ist. Ebenfalls ist zweckmäßig vorgesehen, dass die Lichtquelle zeitlich inkohärent ist.

Bei einem solchen Interferenzreflexionsmikroskop ergibt sich durch die Ausführung der Lichtquelle der Vorteil, dass durch die zeitliche Inkohärenz der Lichtquelle die Entstehung von Speckle-Mustern im reflektierten Licht verhindert werden kann. Derartige Muster entstehen typischerweise als Interferenzphänomene aufgrund von unvermeidlichen Rauigkeiten, Verunreinigungen oder chemischer Heterogenität einer Oberfläche der Probenanordnung und/oder der Beleuchtungs- oder Detektionsoptik. Bei bekannten Ausführungen stören sie typischerweise in erheblicher Weise die Auswertung, weshalb sie mittels starker Filter im Strahlengang herausgefiltert werden. Derartige Filter erlauben zwar eine bessere Auswertung ohne erhebliche Störeinflüsse durch die Speckle-Muster, jedoch geht dadurch auch ein erheblicher Teil des von der Probe zurückreflektierten Lichts verloren. Dies bedeutet wiederum, dass bei bekannten Ausführungen erheblich mehr Strahlungsdichte verwendet werden muss, um auch nach einem Filter noch eine ausreichende Lichtintensität zum Auswerten zu haben. Derart hohe Lichtleistungen können insbesondere bei der Untersuchung von organischen Molekülen dazu führen, dass diese ausbleichen oder zerstört werden. Bei der hier vorliegenden Ausführung eines Interferenzreflexionsmikroskops ist es dagegen möglich, die Leistungsdichte an einer Probe deutlich zu verringern, was wiederum eine längere Belichtungsdauer ohne Beschädigung von Molekülen erlaubt.

Unter einem Interferenzreflexionsmikroskop wird grundsätzlich ein Mikroskop verstanden, bei welchem eine Probe beleuchtet wird und bei welchem reflektiertes und/oder gestreutes Licht aufgefangen und ausgewertet wird, insbesondere in einer Richtung, welche einem beleuchtenden Licht zumindest in etwa entgegengesetzt ist. Dieses Licht enthält grundsätzlich Informationen, welche aufgrund von Interferenzeffekten entstehen. Derartige Interferenzeffekte können insbesondere aufgrund von Grenzflächenübergängen beispielsweise zwischen Glas und Flüssigkeit oder zwischen Flüssigkeit und Probe oder aufgrund von Abständen zwischen Probe und Glas auftreten. Anstelle eines Glases kann beispielsweise auch ein transparenter Kunststoff verwendet werden. Als Probe kann beispielsweise ein Molekül, insbesondere ein organisches Molekül und insbesondere ein Molekül mit einer Masse von beispielsweise mehreren kDa (Kilodalton) verwendet werden. Auch mehrere solcher Moleküle können verwendet werden.

Charakteristisch ist bei einem Interferenzreflexionsmikroskop, dass die Interferenz an der Probe oder zumindest in unmittelbarer Nachbarschaft zur Probe, beispielsweise in einer Entfernung von höchstens 100 nm, höchstens 1 m, höchstens 10 pm, höchstens 100 pm oder höchstens 1 mm zur Probe, beispielsweise an einer Grenzfläche zwischen Glas und Flüssigkeit oder zwischen Flüssigkeit und Probe auftritt. Damit grenzt sich ein Interferenzreflexionsmikroskop ab von Ausführungen von Mikroskopen, welche einen separaten Pfad aufweisen, in welchen Licht aus einem Hauptlichtstrahl eingekoppelt wird, welches dann mit einem von der Probe reflektierten Licht interferiert. Derartige separate Pfade sind bei Interferenzreflexionsmikroskopen typischerweise nicht vorhanden.

Die Lichtquelle dient der Erzeugung des Anregungslichts. Die Beleuchtungsoptik richtet das Anregungslicht auf die Probenanordnung. Hierfür kann beispielsweise eine Köhler- Anordnung verwendet werden. Bei der Probenanordnung kann es sich insbesondere um eine Anordnung handeln, welche die Probe halten und/oder bereitstellen kann. Beispielsweise kann es sich bei der Probenanordnung um ein Gefäß handeln, in welchem eine Flüssigkeit aufnehmbar ist, wobei sich in der Flüssigkeit eines oder mehrere Moleküle befinden können. Derartige Moleküle können als Probe bezeichnet werden. Sie können insbesondere mittels des Interferenzreflexionsmikroskops untersucht werden. Alternativ kann eine Probenanordnung beispielsweise auch die Probe selbst darstellen. In diesem Fall kann eine solche Probe wie beispielsweise ein festes Objekt direkt untersucht werden.

Die Detektionsoptik leitet das von der Probenanordnung reflektierte und/oder gestreute Licht zum Detektor. Dieser erzeugt typischerweise ein Signal, welches anzeigend ist für eine Intensität oder Intensitäten des auf den Detektor auftreffenden Lichts.

Beispielsweise kann der Detektor ein zweidimensionaler Detektor sein, welcher in Pixel unterteilt ist. Dies erlaubt die Aufnahme eines zweidimensionalen Bilds, welches in geeigneter Weise ausgewertet werden kann. Bezüglich des Aufbaus der Optiken und der sonstigen Komponenten des Interferenzreflexionsmikroskops sei insbesondere auch auf die weiter unten erfolgte Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit Bezug auf die beiliegende Zeichnung verwiesen.

Insbesondere kann die Lichtquelle dadurch zeitlich inkohärent sein, dass ein Wert einer Kohärenzlänge höchstens 100 pm, höchstens 75 pm oder höchstens 50 pm beträgt. Die Kohärenzlänge kann dabei insbesondere anhand des Spektrums der Lichtquelle definiert sein. Insbesondere kann die Kohärenzlänge als die maximale Wellenlänge zum Quadrat geteilt durch die Halbwertsbreite im Spektrum der Lichtquelle definiert sein. Eine derartige Definition hat sich als sinnvolle Definition einer Kohärenzlänge zur Beurteilung der zeitlichen Kohärenz oder Inkohärenz erwiesen. Bei den angegebenen Werten kann von einer zeitlich inkohärenten Lichtquelle gesprochen werden. Die Werte haben sich für die hier vorliegende Anwendung als besonders vorteilhaft erwiesen. Auch bei zeitlich inkohärenten Lichtquellen ist die Kohärenzlänge typischerweise nicht exakt Null, sondern beträgt beispielsweise mindestens eine Wellenlänge.

Eine Halbwertsbreite kann insbesondere als diejenige Breite im Spektrum definiert werden, welche zwei Punkte verbindet, bei welchen die Intensität von einem Maximum aus gesehen jeweils die Hälfte im Vergleich zum Maximum beträgt.

Insbesondere kann es sich bei der Lichtquelle um eine Superlumineszenz-Leuchtdiode bzw. um eine Superlumineszenzdiode handeln. Derartige Superlumineszenz- Leuchtdioden erzeugen räumlich kohärentes und zeitlich inkohärentes Licht, welches sich für die hier vorliegende Anwendung aus den bereits genannten Gründen als vorteilhaft herausgestellt hat. Grundsätzlich ist jedoch auch die Verwendung anderer Lichtquellen möglich, sofern diese die geforderten Eigenschaften haben.

Typischerweise ist die Lichtquelle keine Laserlichtquelle. Laserlichtquellen sind typischerweise optische Verstärker mit resonanter Rückkopplung, die Licht basierend auf stimulierter Emission erzeugen. Laserlichtquellen sind für die hier relevante Anwendung typischerweise nicht geeignet. Insbesondere kann die Lichtquelle dadurch räumlich kohärent sein, dass ein Wert einer Fläche, über welche das ausgestrahlte Licht eine feste Phasenbeziehung hat, mindestens 1 pm ² , mindestens 5 pm ² , mindestens 10 pm ² , mindestens 100 pm ² , mindestens 250 pm ² und/oder eine gesamte abstrahlende Fläche der Lichtquelle beträgt. Dies hat sich als sinnvolle Definition einer Kohärenzfläche zur Definition einer räumlich kohärenten Lichtquelle erwiesen. Bei den angegebenen Werten kann von einer räumlich kohärenten Lichtquelle ausgegangen werden, welche die hier erforderlichen Leistungen erbringt und die notwendige Lichtleistungsdichte zur Beleuchtung der Probe ermöglicht.

Es sei verstanden, dass die gegebenen Definitionen von zeitlicher Inkohärenz bzw. räumlicher Kohärenz auch als Alternative für die im Anspruch 1 der Anmeldung verwendeten Formulierungen verstanden werden können.

Vorzugsweise ist vorgesehen, dass im Strahlengang von der Probenanordnung durch die Detektionsoptik zum Detektor kein abschwächender Filter vorhanden ist. Unter einem abschwächenden Filter wird dabei insbesondere ein Element verstanden, dessen Aufgabe darin besteht, den Lichtstrahl abzuschwächen, insbesondere erheblich abzuschwächen, beispielsweise um mindestens eine, zwei oder drei Größenordnungen abzuschwächen. Andere optische Elemente wie beispielsweise Linsen, welche technisch bedingt niemals eine 100%ige Transmission haben, oder Strahlteiler, welche den Zweck verfolgen, einen Strahl aufzuteilen und somit naturgemäß nur einen Teil des einfallenden Lichts in eine bestimmte Richtung durchlassen, werden dagegen nicht als abschwächende Filter verstanden. Durch den Verzicht auf einen abschwächenden Filter kann in vorteilhafter Weise erreicht werden, dass ein erheblich höherer Anteil des reflektierten Lichts auf den Detektor trifft und somit eine niedrigere Leistungsdichte bei der Anregung verwendet werden kann. Dies ermöglicht längere Belichtungszeiten ohne Beschädigung von Proben.

Insbesondere kann im Strahlengang von der Probenanordnung durch die Detektionsoptik zum Detektor mindestens 10 %, mindestens 25 %, mindestens 50 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % des von der Probenanordnung reflektierten Lichts zum Detektor gelangen. Derartige Werte können typischerweise erreicht werden, wenn beispielsweise auf einen abschwächenden Filter in diesem Strahlengang verzichtet wird. Durch die hohe Transmission von der Probenanordnung zum Detektor können die bereits beschriebenen positiven Effekte erreicht werden. Die genannten Werte sind beispielsweise auch dann realistisch, wenn sich in diesem Strahlengang von der Probenanordnung zum Detektor ein Strahlteiler befindet, welcher einen Teil des Lichts unweigerlich nicht zum Detektor durchlässt, sondern in eine andere Richtung umlenkt.

Sofern hierin ein Anteil von Licht erwähnt wird, kann es sich insbesondere um die Leistung des Lichts handeln, welche beispielsweise mindestens zum angegebenen Anteil durchgelassen wird.

Gemäß einer Ausführung weist das Interferenzreflexionsmikroskop einen Strahlteiler auf. Die Beleuchtungsoptik kann insbesondere das Licht der Lichtquelle auf den Strahlteiler richten und der Strahlteiler kann insbesondere das Licht zumindest teilweise auf die Probenanordnung richten. Der Strahlteiler kann insbesondere das von der Probenanordnung reflektierte Licht zumindest teilweise auf die Detektionsoptik richten. Ein solcher Strahlteiler ermöglicht einen einfachen und zweckmäßigen Aufbau eines Interferenzreflexionsmikroskops, da eine Überlagerung von Anregungslichtstrahl und reflektiertem Licht durch den Strahlteiler ermöglicht wird.

Die Lichtquelle und/oder die Beleuchtungsoptik können insbesondere das Licht der Lichtquelle polarisiert auf den Strahlteiler richten. Insbesondere kann es sich dabei um eine lineare Polarisation handeln. Der Strahlteiler kann insbesondere derart polarisationssensitiv sein, dass er das polarisierte Licht der Lichtquelle zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Probenanordnung richtet. Durch die Verwendung eines polarisationssensitiven Strahlteilers und eines polarisierten Lichts der Lichtquelle kann somit insbesondere erreicht werden, dass ein höherer Anteil als bei Verwendung eines zu 50 % reflektierenden und transmittierenden Strahlteilers auf die Probenanordnung trifft. Dadurch geht weniger Licht der Lichtquelle aufgrund der Aufteilung im Strahlteiler verloren.

Insbesondere kann das reflektierte Licht von der Probenanordnung polarisiert auf den Strahlteiler auftreffen. Der Strahlteiler kann insbesondere derart polarisationssensitiv sein, dass er das polarisierte, von der Probenanordnung reflektierte Licht zu mindestens 70 %, mindestens 80 % oder mindestens 90 % auf die Detektionsoptik richtet. Dadurch kann auch im Strahlengang von der Probenanordnung zum Detektor eine polarisationssensitive Ausführung des Strahlteilers dafür sorgen, dass weniger Licht vom Strahlteiler in eine Richtung geleitet wird, in welcher es nicht verwendet werden kann, und ein höherer Anteil des Lichts zum Detektor durchgeleitet wird. Die Polarisation des von der Probenanordnung reflektierten, auf den Strahlteiler auftreffenden Lichts kann insbesondere quer, also beispielsweise mit einem Winkel von 90° oder mit einem Winkel zwischen 85° und 95°, zur Polarisation des von der Lichtquelle auf den Strahlteiler auftreffenden Lichts ausgerichtet sein. Dies kann beispielsweise durch ein X/4-Blättchen zwischen Strahlteiler und Probenanordnung erreicht werden.

Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Beleuchtungsoptik zwischen Lichtquelle und Strahlteiler und die Detektionsoptik zwischen Strahlteiler und Detektor vollständig getrennt voneinander ausgeführt sind. Unter einer vollständig getrennten Ausführung kann insbesondere verstanden werden, dass die jeweiligen optischen Komponenten wie Spiegel, Linsen oder Blenden nur für eine der beiden Optiken verwendet werden. Eine gemeinsame Montage auf einem optischen Tisch oder in einer Halterung steht dem nicht entgegen. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Beleuchtungsoptik vollständig getrennt zur Detektionsoptik ausgeführt ist.

Insbesondere kann vorgesehen sein, dass ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik zwischen Lichtquelle und Strahlteiler und ein Strahlengang in der Detektionsoptik zwischen Strahlteiler und Detektor vollständig getrennt voneinander sind. Dies kann insbesondere bedeuten, dass sich die Strahlen im genannten Bereich nicht überschneiden und nicht ein Strahl in der einen Optik aus einem Strahl der anderen Optik erzeugt wird. Typischerweise ist der Strahlteiler das erste optische Element nach der Lichtquelle bzw. das letzte optische Element vor dem Detektor, welches sowohl vom Stahl der Anregungsoptik wie auch vom Strahl der Detektionsoptik getroffen wird. Es kann auch vorgesehen sein, dass ein Strahlengang in der Beleuchtungsoptik und ein Strahlengang in der Detektionsoptik vollständig getrennt voneinander sind.

Das Interferenzreflexionsmikroskop kann insbesondere ein Objektiv aufweisen. Dieses kann insbesondere optisch unmittelbar vor der Probenanordnung angeordnet sein. Insbesondere kann es zwischen Strahlteiler und Probenanordnung angeordnet sein. Mittels eines solchen Objektivs kann das Licht gezielt auf die Probenanordnung gerichtet und strukturiert werden. Ebenso kann reflektiertes Licht gezielt eingefangen werden.

Das Objektiv kann beispielsweise das Anregungslicht in Richtung auf die Probenanordnung kollimieren. In diesem Fall wird die Probenanordnung mit einem Anregungslicht beleuchtet, dessen Durchmesser zumindest über den hier relevanten Bereich konstant bleibt. Alternativ ist es auch möglich, dass das Objektiv das Anregungslicht auf die Probenanordnung fokussiert.

Insbesondere kann die Beleuchtungsoptik das Anregungslicht fokussieren. Dabei kann insbesondere ein Fokus im Strahlengang zwischen Beleuchtungsoptik und Objektiv angeordnet sein. Insbesondere kann der Fokus in einer hinteren konjugierten Ebene des Objektivs angeordnet sein. Typischerweise weitet sich dann nach diesem Fokus der Strahl wieder auf, bevor er auf das Objektiv trifft und im Objektiv derart verarbeitet wird, wie er auf die Probenanordnung treffen soll.

Die Beleuchtungsoptik und/oder der Strahlteiler können insbesondere das Anregungslicht derart auf das Objektiv richten, dass es parallel zu einer optischen Achse des Objektivs einfällt. Die optische Achse kann dabei insbesondere eine Symmetrieachse des Objektivs sein. Sie kann insbesondere in einem Querschnitt mittig im Objektiv angeordnet sein. Durch einen parallelen Einfall des Lichts auf das Objektiv kann insbesondere erreicht werden, dass der Strahl auch wieder parallel zu dieser optischen Achse auf dem Objektiv austritt. Es sei verstanden, dass mit „parallel“ hier auch „identisch“ mit umfasst wird. Das Anregungslicht kann also auch derart auf das Objektiv einfallen, dass ein Mittelpunkt des Anregungslichts auf der optischen Achse des Objektivs zum Liegen kommt.

Die Beleuchtungsoptik und/oder der Strahlteiler können gemäß einer Ausführung das Anregungslicht derart auf das Objektiv richten, dass ein Mittelpunkt des Anregungslichts benachbart zur optischen Achse des Objektivs einfällt. Er fällt also nicht mit der optischen Achse zusammen. Es kann auch davon gesprochen werden, dass der Mittelpunkt des Anregungslichts zur optischen Achse des Objektivs beabstandet ist, also einen nichtverschwindenden Abstand hat. Dadurch kann eine asymmetrische Beleuchtung des Objektivs erreicht werden. Das Anregungslicht kann insbesondere schräg zur optischen Achse des Objektivs aus dem Objektiv austreten. Dadurch wird eine Beleuchtung der Probenanordnung schräg zur optischen Achse ermöglicht. Insbesondere kann das Anregungslicht schräg auf eine Oberfläche der Probenanordnung auftreffen, an der Probenanordnung reflektiert werden und zum Objektiv zurückreflektiert werden. Auch ein solcher zurückreflektierter Strahl ist dann typischerweise schräg zur Oberfläche der Probenanordnung. Er ist dann typischerweise auch schräg zu einer optischen Achse des Objektivs.

Es kann vorgesehen sein, dass das Anregungslicht mit einem Winkel von mindestens 0°, größer als 0°, mindestens 1 °, mindestens 5°, mindestens 10°, mindestens 20° oder mindestens 40° auf die Oberfläche der Probenanordnung auftrifft. Es kann vorgesehen sein, dass das Anregungslicht mit einem Winkel von höchstens 1 °, höchstens 5°, höchstens 10°, höchstens 20°, höchstens 40° oder höchstens 80° auf die Oberfläche der Probenanordnung auftrifft. Aus jedem unteren Wert kann mit jedem größeren oberen Wert ein geeignetes Intervall gebildet werden. Als Referenz zur Definition des Winkels dient dabei typsicherweise eine Normale auf der Oberfläche. Der Winkel ist somit typischerweise zur Oberflächennormalen angegeben. Ein Winkel von 0° entspricht somit einem nicht schrägen Einfall. Das Anregungslicht kann auch im Brewsterwinkel auf die Oberfläche der Probenanordnung auftreffen. Damit können unerwünschte Reflexionen bestmöglich vermieden werden. Der Brewsterwinkel hängt von den verwendeten Materialien ab, insbesondere vom Material der Probenanordnung, welches typischerweise ein Glas ist. Er kann jedoch einfach berechnet werden, wobei die zugehörige Formel bekannt ist.

Gemäß einer Ausführung kann vorgesehen sein, dass das an der Probenanordnung reflektierte Licht auf das Objektiv an einer anderen Stelle des Objektivs auftrifft als diejenige Stelle, an welcher das Anregungslicht aus dem Objektiv zur Probenanordnung hin austritt.

Die eben beschriebenen Ausführungen ermöglichen eine schräge Beleuchtung der Probenanordnung. Dadurch kann insbesondere erreicht werden, dass in dem von der Probenanordnung reflektierten Licht weniger Anteil an unmittelbar reflektiertem Anregungslicht und mehr Anteil an Licht enthalten ist, welches mit der Probe interagiert hat. Dadurch kann der Informationsgehalt im detektierten Licht weiter erhöht werden.

Das Anregungslicht kann gemäß einer Ausführung parallel zur optischen Achse aus dem Objektiv austreten und/oder es kann quer zu einer Oberfläche der Probenanordnung auf diese Oberfläche auftreffen. Das Licht kann beispielsweise entgegengesetzt zum Anregungslicht, also mit einem Versatz von exakt oder zumindest in etwa 180°, zurückreflektiert werden, beispielsweise mit einem Winkel von mindestens 170° und/oder höchstens 190°.

Das Objektiv kann insbesondere eine numerische Apertur von mindestens 1 ,1 , mindestens 1 ,2, mindestens 1 ,3 oder mindestens 1 ,4 aufweisen. Derartige numerische Aperturen haben sich für typische Interferenzreflexionsmikroskope als vorteilhaft erwiesen.

Die Probenanordnung kann beispielsweise ein Gefäß für eine Flüssigkeit aufweisen, wobei das Gefäß mindestens insoweit optisch transparent ist, dass das auf die Probenanordnung gerichtete Licht eindringt und innerhalb der Flüssigkeit reflektiertes Licht ausdringen kann. Dadurch kann beispielsweise innerhalb einer solchen Flüssigkeit eine Probe in Form von einem Molekül oder mehreren Molekülen vorhanden sein, wobei derartige Moleküle beobachtet werden können. Das Gefäß kann beispielsweise aus Glas oder aus einem transparenten Kunststoff ausgebildet sein. Die Flüssigkeit kann beispielsweise statisch vorhanden sein, oder sie kann im Rahmen eines Durchflusses durch das Gefäß geleitet werden.

Gemäß einer Ausführung weist die Lichtquelle ein Substrat sowie einen im Vergleich zum Substrat schrägen Wellenleiter auf. Der schräge Wellenleiter kann beispielsweise zwei parallele Außenflächen haben, welche im Vergleich zu einer Oberfläche des Substrats schräggestellt sind. Dadurch kann räumlich inkohärentes Licht erzeugt werden.

Beispielsweise kann der Wellenleiter an zwei entgegengesetzten Seiten antireflektiv beschichtet sein. Dies verhindert die Ausbildung von Moden im Wellenleiter, welche zu zeitlich kohärentem Licht führen würden. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass die Lichtquelle keinen Resonator aufweist. Auch dadurch kann die Ausbildung von Moden verhindert werden, welche zu zeitlich kohärentem Licht führen würden.

Insbesondere kann es sich bei der Lichtquelle nicht um eine Laserlichtquelle handeln. Laserlicht ist typischerweise zeitlich und räumlich kohärent, so dass es für die hier vorgesehene Anwendung nicht geeignet ist.

Eine Lichtleistung der Lichtquelle kann beispielsweise höchstens 10 mW, höchstens 20 mW, höchstens 100 mW oder höchstens 1.000 mW betragen. Derartige Lichtleistungen können für typische Anwendungen verwendet werden, auch andere Lichtleistungen sind jedoch möglich.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführung weist die Lichtquelle eine abstrahlende Fläche von höchstens 1 pm ² , höchstens 5 pm ² , höchstens 10 pm ² , höchstens 50 pm ² , höchstens 100 pm ² , höchstens 500 pm ² oder höchstens 1.000 pm ² auf. Derartige Größen von abstrahlenden Flächen der Lichtquelle haben sich für die hier vorliegende Ausführung als vorteilhaft herausgestellt.

Die Lichtquelle kann insbesondere die Probe mit einer Leistungsdichte von höchstens 1.000 kW/cm ² , höchstens 500 kW/cm ² , höchstens 100 kW/cm ² , höchstens 50 kW/cm ² , höchstens 10 kW/cm ² , höchstens 2 kW/cm ² , höchstens 1 kWcm ² oder höchstens 0,5 kW/cm ² beleuchten. Derartige niedrige Leistungsdichten an der Probe können mit der hier vorgesehenen Ausführung verwendet werden, da auf einen Filter im Strahlengang zum Detektor wie bereits erwähnt verzichtet werden kann. Anders ausgedrückt kann eine besonders hohe Transmission von der Probenanordnung zum Detektor verwendet werden, was die Verwendung derart kleiner Leistungsdichten ermöglicht. Die kleinen Leistungsdichten wiederum erzeugen den Vorteil, dass eine längere Belichtungszeit möglich ist. Die Leistungsdichte wird insbesondere an der Probe angegeben.

Insbesondere kann der Detektor eine 2D-Kamera oder eine 1 D-Kamera sein. Er kann beispielsweise als CCD-Detektor und/oder als CMOS-Kamera ausgeführt sein.

Derartige Ausführungen haben sich für typische Anwendungen als vorteilhaft herausgestellt. Typischerweise ist der Detektor zweidimensional ausgeführt, so dass in vorteilhafter Weise ein zweidimensionales Muster oder Interferenzmuster erkannt werden kann. Dies kann beispielsweise für eine fotografische Massenspektrometrie verwendet werden. Je nach Anwendung ist jedoch auch eine eindimensionale Ausführung des Detektors ausreichend. Typischerweise weist der Detektor mehrere Pixel auf, welche jeweils eine Lichtintensität messen.

Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Analysieren einer Probe mittels eines Interferenzreflexionsmikroskops. Insbesondere kann es sich dabei um ein Interferenzreflexionsmikroskop wie hierin beschrieben handeln. Bezüglich des Interferenzreflexionsmikroskops kann auf alle hierin beschriebenen Ausführungen und Varianten zurückgegriffen werden. Das Verfahren weist insbesondere folgende Schritte auf:

Einbringen der Probe in die Probenanordnung oder als Probenanordnung, und Beleuchten der Probe mittels der Lichtquelle, dabei Aufnehmen mindestens eines Bilds mittels des Detektors.

Ein solches Verfahren ermöglicht eine vorteilhafte Analyse einer Probe unter Verwendung des hierin beschriebenen Interferenzreflexionsmikroskops. Die dabei bereits beschriebenen Vorteile können auch beim Verfahren erreicht werden.

Insbesondere können mehrere Bilder mittels des Detektors aufgenommen werden. Nach Aufnahme eines jeweiligen Bilds kann insbesondere ein Differenzbild zwischen diesem Bild und einem vorher aufgenommenen Bild oder einem gemittelten Bild erzeugt werden. Ein gemitteltes Bild kann beispielsweise als Mittelwert oder Median über mehrere vorher aufgenommene Bilder erzeugt werden. Bei einem Mittelwert wird dabei typischerweise für jedes Pixel ein Mittelwert über Intensitätswerte der zu mittelnden Bilder erzeugt, insbesondere bei jeweils den gleichen Pixeln. Anders ausgedrückt kann für jedes Pixel ein Mittelwert über jeweilige Intensitätswerte oder sonstige gemessene Werte gebildet werden. Es kann sich um einen arithmetischen Mittelwert oder um einen geometrischen Mittelwert handeln. Bei einem Median wird typischerweise kein mathematischer Mittelwert erzeugt, sondern es wird ein Wert ermittelt, bei welchem bei der Hälfte der zu mittelnden Bilder der jeweilige Intensitätswert bei dem jeweiligen Pixel darunter und bei der anderen Hälfte darüber ist. Derartige gemittelte Bilder können insbesondere dazu verwendet werden, um eine Basis zum Vergleich mit einem jeweils aufgenommenen Bild darzustellen. Bei derart gemittelten Bildern werden Rauscheffekte ausgemittelt. Dies kann sowohl durch Mittelwertbildung wie auch durch Medianbildung erfolgen. Durch die Erzeugung von Differenzbildern wird insbesondere erreicht, dass eine Veränderung im Vergleich zu vorherigen Bildern erkannt wird. Dadurch können beispielsweise neu auf einer Oberfläche landende Moleküle erkannt werden. Diese können vermessen werden und es kann beispielsweise anschließend beobachtet werden, wenn diese sich wieder von der Oberfläche entfernen.

Die Probe kann beispielsweise ein Molekül sein oder kann mehrere Moleküle aufweisen. Insbesondere kann es sich dabei um organische Moleküle handeln, welche in einer Lösung gelöst sein können. Das Molekül oder die Moleküle können beispielsweise eine Masse von jeweils mindestens 2 kDa, mindestens 3 kDa oder mindestens 10 kDa aufweisen. Derartige Moleküle können insbesondere vorteilhaft mittels des hierin beschriebenen Verfahrens und/oder mittels des hierin beschriebenen Interferenzreflexionsmikroskops analysiert werden.

Insbesondere kann eine Masse eines Moleküls oder mehrerer Moleküle basierend auf einem oder mehreren Bildern oder Differenzbildern bestimmt werden. Hierfür kann beispielsweise eine automatisierte Bildauswertung verwendet werden. Diese kann beispielsweise auf künstlicher Intelligenz, neuronalen Netzen und/oder maschinellem Lernen basieren. Durch die hierin beschriebenen Vorteile der hierin beschriebenen Ausführung ist eine längere und zerstörungsfreie Beleuchtung möglich.

Insbesondere können mehrere Bilder hintereinander mittels des Detektors aufgenommen werden. Aus diesen Bildern kann ein Video erstellt werden. Ein solches Video ist typischerweise eine Aneinanderreihung von mehreren hintereinander aufgenommenen Bildern. Dadurch können beispielsweise Moleküle beim Landen auf einer Oberfläche und/oder beim Entfernen von einer Oberfläche beobachtet werden. Auch kann eine Änderung von Orientierungen von Molekülen beobachtet werden.

Das Beleuchten der Probe und/oder das Aufnehmen von einem oder mehreren Bildern kann beispielsweise über einen zusammenhängenden Zeitraum von mindestens einer Minute, mindestens zwei Minuten, mindestens fünf Minuten, mindestens zehn Minuten oder mindestens zwanzig Minuten erfolgen. Derartige Zeiträume sind typischerweise mittels der hierin beschriebenen Ausführung möglich, da die Leistungsdichte der Beleuchtung der Probe im Vergleich zu bekannten Ausführungen deutlich reduziert werden kann. Insbesondere können die bereits beschriebenen Leistungsdichten oder sonstigen Daten der Lichtquelle oder des Interferenzreflexionsmikroskops hierfür verwendet werden.

Insbesondere können die hierin beschriebenen Ausführungen für simultane Lokalisationsmessungen und/oder Massenphotometrie verwendet werden. Beispielsweise können sie für die Untersuchung von Biomolekülen wie Proteine oder Nanopartikel verwendet werden. Bei den hierin beschriebenen Ausführungen kann beispielsweise auf einen Marker verzichtet werden, welcher ansonsten typischerweise bei Nanopartikeln oder Proteinen verwendet wird. Beispielsweise kann eine Einzelmoleküldetektion, eine Molekulargewichtsbestimmung oder eine sonstige Auswertung durchgeführt werden.

Die Lichtquelle kann insbesondere linear polarisiert sein. Dies kann wie weiter oben bereits erläutert verwendet werden, insbesondere in Verbindung mit einem polarisationssensitiven Strahlteiler.

Eine räumliche Kohärenz erlaubt es typischerweise, Licht wie einen Laser zu kollimieren und zu fokussieren. Die zeitliche Inkohärenz verhindert Speckle-Muster. Eine Polarisation ermöglicht eine effiziente Nutzung der Lichtleistung. Hierfür kann beispielsweise auf einen polarisationssensitiven Strahlteiler zurückgegriffen werden, wie weiter oben beschrieben. Das Anregungslicht kann beispielsweise eine Wellenlänge von 450 nm aufweisen. Auch jede andere Wellenlänge, welche für die jeweiligen Zwecke geeignet ist, kann beispielsweise verwendet werden. Das Licht kann beispielsweise mit mehreren Linsen kollim iert, fokussiert bzw. aufgeweitet und an beispielsweise zwei Iriden abgeschnitten werden, bevor es auf eine Probe hinter einem Objektiv fällt. Eine geeignete Verwendung von Verzögerungsplatten (X/2 bzw. A/4) sowie ein Polarisationsstrahlteiler können den Verlust an Lichtleistung vermindern. Das einfallende Licht kann an Probenglasoberflächen und/oder Biomolekülen oder Nanopartikeln reflektiert werden, es interferiert und gelangt über den Detektionspfad zum Detektor bzw. zur Kamera. Beispielsweise können Bildraten mit mehr als 100 Bildern pro Sekunde, mehr als 500 Bildern pro Sekunde, mehr als 1.000 Bildern pro Sekunde, mehr als 2.000 Bildern pro Sekunde und/oder bis zu 2.000 Bildern pro Sekunde, bis zu 5.000 Bildern pro Sekunde, oder bis zu 10.000 Bildern pro Sekunde aufgenommen werden. Derartige Aufnahmen können anschließend zum Teil gemittelt werden, um differenzielle Bilder zu erstellen. Der Bildkontrast ist typischerweise proportional zum Molekulargewicht der Probe. Somit können beispielsweise Moleküle oder Partikel mit einem Molekulargewicht von einigen MDa bis zu den angegebenen Werten detektiert und lokalisiert werden. Wenn die Moleküle sich bewegen, können sie über mehrere Minuten verfolgt werden, da nur eine sehr geringe Lichtleistung benötigt wird, die keine Lichtschäden verursacht. Aufgrund des gemessenen Hintergrundrauschens kann mit den hierin beschriebenen Ausführungen bis zu einem Molekulargewicht von wenigen kDa gemessen werden.

Beispielsweise können eine Analyse von Proteinen, eine Molekulargewichtsbestimmung, eine Proteinkomplexbildung, eine Oligomerisation, eine biomolekulare Interaktion oder Wechselwirkung, eine Makromolekülzusammensetzung, ein Single-Particle-Tracking oder eine Einzelmoleküllokalisation mit den hierin beschriebenen Ausführungen realisiert werden.

Es ist auch möglich, eine zeitlich inkohärente Lichtquelle dadurch zu definieren, dass die Kohärenzlänge, welche beispielsweise wie weiter oben angegeben ermittelt werden kann, kleiner ist als ein Abstand zwischen der Lichtquelle und der nächsten optischen Grenzfläche. Eine solche optische Grenzfläche kann beispielsweise durch eine Linse gegeben sein. Typische Kohärenzlängen von Lasern, welche in der Mikroskopie verwendet werden, liegen dagegen in der Größenordnung von Metern. Die hier verwendeten zeitlich inkohärenten Lichtquellen haben somit typischerweise eine Kohärenzlänge, welche um beispielsweise mindestens vier bis sechs Größenordnungen kleiner ist. Insbesondere handelt es sich bei der hier verwendeten Lichtquelle nicht um einen Laser.

Bei einer normalen Leuchtdiode ist typischerweise eine emittierende Fläche von der Größenordnung einiger Quadratmillimeter oder größer. Bei einer Superlumineszenz- Leuchtdiode bzw. allgemeiner bei einer hier verwendeten Lichtquelle sind typische abstrahlende Flächen in der Größenordnung von einigen Quadratmikrometern, also etwa sechs Größenordnungen kleiner. Bei ähnlichem Abstrahlwinkel ist die abgestrahlte Lichtleistung einer Leuchtdiode also etwa 100-mal größer als bei Superlumineszenz- Leuchtdioden, beispielsweise 500 mW bei Leuchtdioden im Vergleich zu 5 mW bei Superlumineszenz-Leuchtdioden. Dementsprechend ist die Leistungsdichte bei einer Superlumineszenz-Leuchtdiode typischerweise etwa vier Größenordnungen höher im Vergleich zu einer einfachen Leuchtdiode. Gleichzeitig ist sie jedoch deutlich geringer als bei einem Laser.

Eine räumliche Kohärenz kann beispielsweise auch dadurch definiert werden, dass eine Lichtquelle die gleiche Phase unabhängig von einer Position auf einer Abstrahlfläche hat.

Weitere Merkmale und Vorteile wird der Fachmann dem nachfolgend mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung beschriebenen Ausführungsbeispiel entnehmen. Dabei zeigen: Fig. 1 : ein Interferenzreflexionsmikroskop, und

Fig. 2: eine Darstellung eines Kontrasts in Abhängigkeit von einer Molekularmasse.

Fig. 1 zeigt ein Interferenzreflexionsmikroskop IRM gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Das Interferenzreflexionsmikroskop IRM weist eine Lichtquelle LI auf. Diese sendet Licht aus, welches als Anregungslicht verwendet wird und strichpunktiert dargestellt ist. Dieses Licht trifft zunächst auf eine erste Linse L1 und eine nachfolgende zweite Linse L2. Die erste Linse L1 kollim iert das Licht, die zweite Linse L2 fokussiert es auf eine Irisblende, welche auch als Apertur-Iris AI bezeichnet wird. Dadurch werden störende Komponenten des Lichts ausgeblendet. Nachfolgend im Strahlengang befindet sich eine dritte Linse L3, welche das Licht wiederum kollimiert. Nachfolgend befindet sich ein X/2-Plättchen, durch welches eine Polarisation des Lichts so eingestellt werden kann, dass die Polarisation mit Bezug auf den nachfolgend beschriebenen Strahlteiler optimiert ist. Nach dem X/2-Plättchen befinden sich eine Feld-Iris Fl zum Formen des Lichtstrahls sowie ein erster Spiegel M1 und ein zweiter Spiegel M2, welche das Licht auf eine vierte Linse L4 um lenken. Diese vierte Linse L4 fokussiert das Licht, welches nachfolgend auf einen Strahlteiler ST trifft. Der transmittierte Teil durchläuft dann ein X/4-Plättchen, wodurch aus der zunächst linearen Polarisation eine zirkulare Polarisation wird. Durch einen dritten Spiegel M3 wird das Licht umgelenkt auf ein Objektiv 0, wobei ein Fokus des durch die vierte Linse L4 fokussierten Lichts vor dem Objektiv 0 liegt. Der Fokus liegt insbesondere in einer hinteren konjugierten Ebene des Objektivs 0. Das Objektiv 0 kollim iert das Licht und leitet es auf eine Probenanordnung PA. Die Probenanordnung PA ist vorliegend in Form einer durchsichtigen Platte mit einer aufgebrachten Probe realisiert. Auch andere Lösungen sind hier möglich, beispielsweise ein Reservoir für eine Flüssigkeit. An der Probenanordnung PA wird das Anregungslicht reflektiert, und es wird ferner eine Komponente des Anregungslichts durch Interaktion mit Grenzflächen, insbesondere zu einer Probe wie beispielsweise einem organischen Molekül, reflektiert. Dadurch entstehen Interferenzmuster, welche im zurückreflektierten Licht enthalten sind. Das zurückreflektierte Licht ist durch einen umgebenden Strahl in Fig. 1 gestrichelt dargestellt. Dieses wird zunächst über den dritten Spiegel M3 zu dem X/4-Plättchen geleitet und trifft dann auf den Strahlteiler ST.

Der Strahlteiler ST ist so ausgebildet, dass er einen sehr hohen Anteil des mit der Polarisation des Anregungslichts eintreffenden Lichts in Richtung auf das Objektiv 0 hindurchlässt, und ist ferner dazu ausgebildet, Licht mit derjenigen Polarisation, welche das reflektierte Licht nach zweimaligem Durchgang durch das X/4-Plättchen hat, überwiegend auf einen vierten Spiegel M4 zu leiten. Dadurch kann eine Polarisationsabhängigkeit des Strahlteilers ST ausgenutzt werden, um möglichst viel vom gewünschten Licht auf die gewünschten Elemente zu lenken. Jeweils nicht benutzte Komponenten des Lichts werden auf einen Strahlblockierer SB geleitet.

Der vierte Spiegel M4 leitet das Licht durch eine Bertrand-Linse LB, die zur Kontrolle in den Strahlengang eingefügt werden kann, sich zur Bildaufnahme jedoch normalerweise nicht im Strahlengang befindet, und anschließend durch eine fünfte Linse L5. Dabei wird das Licht erneut fokussiert und trifft dann auf eine sechste Linse L6, welches es wiederum kollimiert und auf eine siebte Linse L7 leitet. Diese fokussiert das Licht auf einen Detektor D. Der Detektor D nimmt ein zweidimensionales Bild des eintreffenden Lichts auf und ermöglicht somit eine Auswertung. Ein zweidimensionales Bild kann beispielsweise ein Interferenzmuster enthalten, welches einen Hinweis auf die Größe eines in der Probenanordnung PA befindlichen Moleküls gibt. Es können insbesondere mehrere Bilder hintereinander aufgenommen werden, um ein Video zu erstellen, oder um beispielsweise jeweilige Differenzen zwischen Bildern zu erstellen, welche eine bessere Verfolgung von Änderungen ermöglichen. Auf die diesbezüglich weiter oben bereits gegebenen Ausführungen sei verwiesen. Die ersten bis vierten Linsen L1 , L2, L3, L4, die Apertur-Iris AI, das X/2-Plättchen, die Feld-Iris Fl sowie die ersten und zweiten Spiegel M1 , M2, bilden zusammen eine Beleuchtungsoptik BO. Der vierte Spiegel M4, die Bertrand-Linse LB sowie die fünften bis siebten Linsen L5 bis L7 bilden zusammen eine Detektionsoptik DO.

Die Lichtquelle LI ist vorliegend eine räumlich kohärente, zeitlich nicht kohärente Lichtquelle in Form einer Superlumineszenz-Leuchtdiode. Durch die zeitliche Nichtkohärenz ist es möglich, das Entstehen von Speckle-Mustern an der Probenanordnung PA wirkungsvoll zu verhindern. Dadurch gelangt ein Licht zum Detektor D, welches derartige störenden Speckle-Muster nicht enthält, und es kann somit auf im Stand der Technik bekannte Filter, welche das Licht vor dem Detektor D abschwächen, um dieses Speckle-Muster auszublenden, verzichtet werden. Dies erlaubt wiederum die Verwendung einer Lichtquelle LI mit im Vergleich zu bekannten Ausführungen deutlich verringerter Leistungsdichte, so dass eine längere Bestrahlung auch von empfindlichen Proben möglich ist, ohne diese zu zerstören.

Fig. 2 zeigt ein Diagramm, welches bei unterschiedlichen Molekülen die Molekülmasse in kDa sowie den mittels der hier beschriebenen, experimentell umgesetzten Ausführung eines Interferenzreflexionsmikroskops erzielbaren Kontrast darstellt. Dabei sind unterschiedliche Moleküle angegeben, wobei ersichtlich ist, dass der Kontrast mit der Molekülmasse ansteigt. Im Vergleich zu bekannten Ausführungen können jedoch grundsätzlich bessere Kontraste erzielt werden.

Die Kontraste wurden mit einer Leistungsdichte des Lichts von weniger als 0,5 kW/cm ² erreicht. Mit dieser Leistungsdichte resultiert zum Beispiel bei einer Molekülmasse von 100 kDa ein Kontrast von 1 ,1 %. Im Vergleich dazu werden bei der Implementierung, welche in Young et al., Science 360, 423-427 (2018) offenbart ist, bei einer Molekülmasse von 100 kDa Kontraste von nur 0,7 % mit einer Leistungsdichte von 420 kW/cm ² erreicht. Die hierin beschriebene Implementierung ermöglich somit erheblich geringere Leistungsdichten und gleichzeitig sogar einen besseren Kontrast.

Erwähnte Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens können in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden. Sie können jedoch auch in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden, soweit dies technisch sinnvoll ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer seiner Ausführungen, beispielsweise mit einer bestimmten Zusammenstellung von Schritten, in der Weise ausgeführt werden, dass keine weiteren Schritte ausgeführt werden. Es können jedoch grundsätzlich auch weitere Schritte ausgeführt werden, auch solche welche nicht erwähnt sind.

Es sei darauf hingewiesen, dass in den Ansprüchen und in der Beschreibung Merkmale in Kombination beschrieben sein können, beispielsweise um das Verständnis zu erleichtern, obwohl diese auch separat voneinander verwendet werden können. Der Fachmann erkennt, dass solche Merkmale auch unabhängig voneinander mit anderen Merkmalen oder Merkmalskombinationen kombiniert werden können.

Rückbezüge in Unteransprüchen können bevorzugte Kombinationen der jeweiligen Merkmale kennzeichnen, schließen jedoch andere Merkmalskombinationen nicht aus.

Bezugszeichenliste

LI Lichtquelle

L Linsen

AI Apertur-Iris

Fl Feld-Iris

BO Beleuchtungsoptik

DO Detektionsoptik

M Spiegel

ST Strahlteiler

0 Objektiv

PA Probenanordnung

SB Strahlblockierer

LB Bertrand-Linse

D Detektor

IRM Interferenzreflexionsmikroskop