Verbesserte gewebeoestützte Elektrophoreseαele aus Aqarose

Die Erfindung betrifft verbesserte gewebegestützte Elektrophoresegele aus Agarose.

Bei der isoelektrischen Fokussierung werden für die antikonvektive Stabilisierung derzeit überwiegend Polyacrylamidgele eingesetzt. Agarose ist eine Alternative mit einer Reihe von Vorteilen.

1) Die Gelierung durch Abkühlen einer gelösten Agarose ist einfacher, reproduzierbarer und unbedenklicher als eine Polymerisation unter Mitwirkung freier Radikale. Die Herstellung von Agarosegelen schaltet gesundheitliche Risiken aus, die auf die neurotoxischen und/oder krebserregenden Eigenschaften der Reagenzien zurückgehen, die für die Polymerisation von Polyacrylamidgelen erforderlich sind. Agarosegele enthalten keine Restmengen der toxischen Reagenzien oder restliche freie Radikale, die z.B.auf die aufzutrennenden Proteine einen nachteiligen Einfluß haben können.

2) Agarosegele sind Polyacrylamidgelen deutlich überlegen aufgrund ihrer geringeren Restriktivität, ^' so daß in diesen Gelen auch Moleküle bis zu einer Größe von mehreren Millionen Dalton getrennt werden können. Die Trennung einiger hochmolekularer Proteine ist von großer praktischer Bedeutung.

3) Agarosegele sind vielseitiger als Polyacrylamidgele bei der Anwendung immunologischer Nachweisverfahren, z.B. der Immunfixation, bei der Enzymvisualisierung und beim Proteinblotting.

Trotz dieser Vorteile hat in den letzten Jahren die isoelektrische Fokussierung in Agarosegelen keine größere Verbreitung gefunden. Die zögernde Aufnahme der isoelektrischen Fokussierung in Agarose für

Routineanwendungen geht auf eine störende Eigenschaft dieses Geles zurück, nämlich die Bildung von Exsudaten. Sogar die besten im Handel erhältlichen "Null-Elektroendosmose"-Agarosen, die speziell für die isoelektrische Fokussierung entwickelt wurden, neigen zur Bildung von Flüssigkeits-Exsudaten auf der Geloberfläche. Das Ausmaß dieser Exsudate hängt von verschiedenen Versuchsparametern ab, wie z.B. Eigenschaften der Agarose, Luftfeuchtigkeit, Konstruktion der Elektrophoresekammer, elektrische Feldstärke, Volt x Stunden (Vh) Produkt, pH Bereich der Trägerampholyte. Die Exsudation stört erheblich die isoelektrische Fokussierung in Agarose, die deshalb häufig weder unter Gleichgewichts-Bedingungen durchgeführt werden kann, noch eine hohe elektrische Feldstärke zuläßt, die für eine verbesserte Auflösung von Vorteil wäre. Diese Nachteile der Agarosegele lassen sich zum Teil beheben, wenn vor Beginn der isoelektrischen Fokussierung die Geloberfläche mit Filterpapier getrocknet wird, um aus dem Gel einen Teil der flüssigen Phase zu entfernen. Während der isoelektrischen Fokussierung können in regelmäßigen Abständen die Exsudaten ebenfalls mit Filterpapier entfernt werden. Beide Maßnahmen können zu guten Trennergebnissen führen, sind aber in der Routine umständlich.

Es wurde nun gefunden, daß die Eigenschaften von Agarosegelen bei der isoelektrischen Fokussierung entscheidend verbessert werden können, wenn die Agarosegele, anstatt der bisher üblichen 10 - 15 % höhere Konzentrationen von Polyolen enthalten. Erfindungsgemäß beträgt die Konzentration der Polyole zwischen 20 (bevorzugt 25) und 80 % (g/v = Gewicht/Volumen; [g/ml]).

Der bevorzugte Bereich liegt zwischen 25 und 60 % g/v; besonders bevorzugt ist der Bereich größer 30 % g/v. Ganz besonders bevorzugt ist der Bereich ab 40 bzw. 45 Gew.-%. Die beanspruchten Konzentrationen errechnen sich aus dem Gewicht des Polyols bezogen auf das Gesamtvolumen des noch nicht gelierten Gels (g/ml) . Geeignet sind solche Polyole, die gut wasserlöslich sind, d.h. in dem beanspruchten Bereich mit Wasser mischbar bzw. in Wasser löslich sind.

Geeignete Polyole sind beispielsweise verzweigte oder unverzweigte aliphatische Polyole mit 2 bis 8, bevorzugt 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und mindestens zwei Hydroxygruppen. Geeignet sind weiterhin Monosaccharide vom Strukturtyp der Pentosen und Hexosen sowie Oligosaccharide, insbesondere Disaccharide, wie z.B. Saccharose und deren Derivate. Zu den wichtigsten Pentosen bzw. Hexosen gehören Xylose, Glucose, Fructose. Geeignet sind zudem Zuckeralkohole, wie z.B. Sorbit und Xylit.

Von verschiedenen Polyolen haben sich besonders bewährt: Glycerin (30 - 70 %, bevor ^z ugt 35 - 70 % g/v), Ethylenglykol (40-60 % g/v), Propyl^nglykol (40 - 60 % g/v), Saccharose (30 - 50 % g/v), Sorbit (30 - 50 % g/v), Dextran (20 - 30 % g/v) sowie Kombinationen dieser Polyole mit hoher Konzentration der Einzelkomponenten. Besonders bevorzugt sind Agarosegele, die 30 bis 60 % (g/v) bevorzugt zwischen 40 (45) bis 60 Gew.-% Glycerin enthalten.

Verglichen mit herkömmlichen Agarosegelen haben Gele, mit dem oben angeführten hohen, durchschnittlich 30 bis 60 % g/v - bevorzugt zwischen 40 (45) bis 60 Gew.-% - Polyolgehalt folgende vorteilhafte Eigenschaften:

Die Geloberfläche zeigt keine Exsudate, auch nicht unter besonders ungünstigen Trennbedingungen, wie z.B. hohe Luftfeuchtigkeit, lange Trennzeiten, hohe elektrische Feldstärken, großer Temperturunterschied zwischen Gel und Oberfläche der Kühlplatte der Trennkammer. Gele mit hohem Polyolgehalt können bei der isoelektrischen Fokussierung mit extrem hohen Feldstärken, z.B. 500 - 1000 V/cm, ohne lokale Überhitzung belastet werden. Bei hohen Polyolkonzentrationen - insbesondere bei hohen Glycerinkonzentrationen - mit einem Gehalt von mehr als oder gleich 30 % g/v kann überraschenderweise auf die sonst üblicherweise notwendige Kühlung der Elektrophoresekammer mit Hilfe eines Kryostaten verzichtet werden.

Aufgrund der hohen Viskosität ist es vorteilhaft, die Trennung bei Temperaturen zwischen 15 und 25°C (Raumtemperatur) (üblich sind 2 - 15°C) durchzuführen, d.h. es ist ausreichend, die Elektrophoresekammer mit Hilfe eines Thermostaten zu kühlen. Bei den herkömmlichen Gelen beobachtet man aufgrund von Unterschieden in der Leitf higkeit der Elektrolyte ein Austrocknen der Gele und bei fortgesetztem Stromdurchgang Verbrennungslinien, die in der Regel zu einem Abbruch des Versuchs führen. Die Anwendung hoher Feldstärken ist bei einigen Elektrophoresetechniken anzustreben, weil dadurch die Auflösung verbessert werden kann. Ein hoher Salzgehalt der Proben, wie er z.B. in einigen Körperflüssigkeiten oder nach vorangegangener Fraktionierung vorkommt, stört in Agarosegelen mit hohem Polyolgehalt weniger als in herkömmlichen Gelen. Ein hoher Polyolgehalt im Gel ermöglicht nicht nur die Anwendung hoher Feldstärken und damit eine bessere Auflösung während der Trennung.

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^■ Auch nach dem Abschalten des elektrischen Feldes wird durch die erhöhte Viskosität die Diffussion der aufgetrennten Komponenten vermindert, was dazu beiträgt, daß bei den anschließenden Visualisierungsschritten, wie z.B. Anfärbung der Proteine oder spezifische Enzymvisualisierung, die Trennschärfe erhalten bleibt. Auf diese Weise kann man vermeiden, daß sich die im Gel nur mit geringem Abstand, z.B. Bruchteilen eines Millimeters, getrennten Komponenten durch Diffusion überlagern.

In ultradünnen Gelen wirkt ein hoher Polyolgehalt stabilisierend und man erhält regelmäßigere Trennmuster als in den herkömmlichen Gelen. Die Herstellung ultradünner Gele mit hohem Polyolgehalt ist einfacher als bei geringer Polyolkonzentration, weil insbesondere in den ultradünnen Gelen der unerwünschte Einschluß von Luftblasen dank der hohen Dichte der

Polymerisationslösung vermieden werden kann. Gele mit hohem Polyolgehalt lassen sich besser lagern als herkömmliche Gele, weil sie weniger zum Austrocknen neigen und auch bakteriologisch stabiler sind. Glycerin in hoher Konzentration hat eine bakterizide Wirkung, so daß sich bei längerer Lagerung ein Zusatz anderer Konservierungsstoffe, die manchmal den Trennvorgang stören können, erübrigt.

Aus der Literatur ist bekannt, daß Polyole in hoher Konzentration, z.B. 30-60% Glycerin, stabilisierend auf Proteine und Enzyme wirken; so werden beispielsweise empfindliche Enzyme in Lösungen hoher Glycerinkonzentrationen im Handel angeboten, um sie längere Zeit vor der Denaturierung zu schützen. Diese stabilisierende Wirkung der Polyole ist auch während der Elektrophorese besonders vorteilhaft,

weil bedingt durch lange Verweilzeiten im Trennsystem Proteine und Enzyme durch extreme pH-Werte oder im Bereich ihrer isoelektrischen Punkte leicht inaktiviert oder modifiziert werden können. Die stabilisierende Wirkung hoher Polyolkonzentrationen ist bei analytischer und präparativer Elektrophorese vorteilhaft, weil Trennartefakte (native und denaturierte Proteine können sich in ihren Ladungseigenschaften unterscheiden) vermieden werden und die Ausbeute erhöht wird. Niedermolekulare Polyole stören die präparative Elektrophorese nicht, da sie von den aufgetrennten Proteinen oder anderen hochmolekularen Substanzen leicht abgetrennt werden können.

Hohe Polyolkonzentrationen im Gel sind auch vorteilhaft bei einer der heute wichtigsten Anwendungen der Elektrophorese - dem Blotting. Beim Blotting werden die im Gel elektrophoretisch aufgetrennten Komponenten für weitere Visualisierungsschritte in eine immobilisierende Matrix, z.B. eine

Nitrocellulosemembran, übertragen. Eine dabei häufig beobachtete Schwierigkeit ist die zu starke Haftung der Membran, die ein Abziehen von der Geloberfläche erschwert oder unmöglich macht. Hohe Glycerinkonzentrationen im Gel ermöglichen durch verbesserte Gleiteigenschaften ein problemloses Abheben der Membran von der Geloberfläche. Erfindungsgemäß werden nicht nur die gebrauchsfertigen Gele beansprucht, sondern auch die entsprechend vorbereiteten Lösungen, die zur Herstellung des gebrauchsfertigen Gels lediglich auf einen geeigneten Träger aufpolymerisiert werden müssen. Solche Gelkompositionen bestehen aus den eigentlichen Monomerlösungen, z.B. wässerigen Lösungen wie Agarose, üblichen Hilfs- und Zusatzstoffen sowie erfindungsgemäße Konzentrationen an Polyolen.

Zum Gebrauch wid die vorbereitete Lösung mit einem geeigneten Katalysator versetzt und auf einen geeigneten Träger (Glasplatte, Gewebe oder Folie) aufpolymerisiert.

Erfindungsgemäß werden gewebegestützte Agarosegele mit hohem Polyolgehalt beansprucht, deren Gewebe einen haftverbessernden Überzug aufweisen. Solche Gewebe sind aus dem Stand der Technik bekannt und beispielsweise in der internationalen Patentanmeldung WO 89/03721 beschrieben, auf die hiermit inhaltlich Bezug genommen wird. Bevorzugte Gewebe sind Polyestergewebe, die mit einem Gemisch aus verdünnter Agarose und einem Polyacrylamidgel überzogen worden sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von gewebegestützten Agarosegelen, wobei die Gewebe einen haftverbessernden Überzug aufweisen.

Das Verfahren ist durch folgende Parameter charakterisiert:

1) Herstellung der Agaroselösung.

Die Agarose wird in destilliertem Wasser unter Anwendung von Wärme aufgelöst und mit der gewünschten Menge des Polyols versetzt. Falls erforderlich oder gewünscht können Zusätze, wie z.B. Trägerampholyte, zugegeben werden. Die so vorbereitete Agaroselösung wird zusammen mit dem vorbereitetem Gewebe (haftverbessernder Überzug) in einer geeigneten Vorrichtung zu dem fertigen Gel gegossen.

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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polyestergewebe, das als Haftverbesserer für Agarose einen dünnen aufpolymerisierten Überzug aus einem Gemisch aus Agarose und einem Polyacrylamidgel enthält, wobei diesem Gemisch gegebenenfalls ein Polyol, bevorzugt Glycerin, als Netzmittel zugesetzt werden kann.

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Herstellungsbeispiele

Beispiel 1

Es werden Gele mit 1,3 % Agarose, 3 % Tragerampholyten und 30 % Glycerin wie folgt hergestellt: "Null-Elektroendosmose" Agarose (1.3 g), z.B. IsoGel Agarose (FMC, Rockland ME, USA) wird langsam unter ständigem Rühren in destilliertes Wasser (50 ml) gestreut und 30 s in einem Haushalts-Mikrowellenherd bis zum vollständigen Auflösen der Agarose erhitzt. In diese Lösung wird Glycerin (28 ml eines 87 %igen Glycerins, (d = 1.22) hinzugefügt und weitere 20 s im Mikrowellenherd erhitzt. Nach Zugabe von 6.25 ml Servalyt Tr gerampholyten (Serva) wird die Lösung auf 100 ml destiliertem Wasser aufgefüllt. Die heiße Agaroselösung wird in einer vorgewärmten Vakuumflasche einige Sekunden entlüftet. Die Agaroselösung wird in eine entsprechende Vorrichtung eingebracht. Die Gelschichten können in einer Kasette, der üblichen Kapillartechnik oder Klapp-Technik hergestellt weren. Als Träger für die Agaroseschicht können Glasplatten, entsprechend vorbehandelte und im Handel erhältliche Polyesterfolien, oder Netzgewebe verwendet werden.

Beispiel 2

Vorbehandlung von Polyestergewebe

Die im Handel erhältlichen vorbehandelten Netzgewebe sind für Polyacrylamidgele entwickelt worden. Agarosegele haften auf ihnen nur unzureichend

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und für die Herstellung gewebegestützter Agarosegele müssen die Netze zusätzlich vorbehandelt werden, um die Haftung zu verbessern. Eine verbesserte Haftung erreicht man, wenn die Gewebe mit einem Gemisch aus verdünnter Agarose und einem Polyacrylamidgel überzogen werden. Das Gemisch wird auf das Gewebe aufpolymerisiert und im Mikrowellenherd eingebrannt.

Das Gemisch besteht aus 0.4 % Agarose (0.4 g), 10 % g/v Glycerin (9.4 ml eines 87 %-igen Glycerins) und einer Polymerisationslösung (16.g ml) aus 29.1 g Acrylamid und 0.9 g N,N*-Methylenbisacrylamid. Die aufgeführten Mengen werden in etwa 50 ml Wasser eingebracht, etwa 30 s im Mikrowellenherd erhitzt, mit N,N,N' ,N'-Tetramethyl- ethylendiamin und Ammoniumpersulfat als Katalysatoren versetzt, und auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt. Nach kurzem Entlüften in einer Vakuumflasche wird die heiße Lösung auf das Netzgewebe aufgetragen und mit einer Polyesterdeckfolie zum Ausschluß von Sauerstoff abgedeckt. Das Gel ist nach etwa 5 min auspolymerisiert und wird anschließend 3 min im Mikrowellenherd eingebrannt. Anstatt der Polymerisationslösung kann auch eine Lösung von 0.4 % Agarose, 10 % g/v Glycerin und 5 - 10 % g/v im Handel erhältlicher, hochmolekularer linearer Polyacrylamide verwendet werden.

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Beispiel 3

Technisches Gewebe zur Herstellung eines gewebegestützten Agarose - Elektrophoresegels.

Das Polyestergewebe (PES Monodur 60 N) wird wie in Beispiel 1 beschrieben nach dem Tauchverfahren präpariert.

1. Überzug

Zusammensetzung 8 ltr. Aceton der Lösung: 8 g Gantrez

2. Überzug

Zusammensetzung 8 g Agarose/5,6 ml Wasser der Lösung: 6 ltr. Methanol 20 ml Glycerin

Das ferig präparierte Gewebe wird wie in Beispiel 1 beschrieben in Agarose eingebracht.