MEMORIA DESCRIPTIVA

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Dentro de la gran variedad de células inmunes se encuentran los linfocitos T. Los linfocitos T comienzan su desarrollo en la medula ósea. Posteriormente se dirigen al timo, donde maduran y pasan por los procesos de selección positiva y negativa. Luego del paso por el timo, los linfocitos T inmaduros pasan a ser linfocitos T naive maduros. Cuando a los linfocitos T naive se les presenta un antígeno y reciben las señales co-estimuladoras apropiadas desde las células presentadoras de antígenos (APC), comienzan la producción de IL-2, una citoquina que actúa como factor de crecimiento y sobrevida.

Asimismo inician los procesos de proliferación y diferenciación de los linfocitos T naive. Lo anterior da lugar a los linfocitos T con funciones específicas denominados linfocitos T efectores. De la población de linfocitos T efectores una pequeña proporción se diferencia a linfocitos T de memoria. Los estados de diferenciación de los linfocitos T naive y memoria pueden reconocerse según la expresión de las ¡soformas de CD45, las que son CD45RA y CD45RO, respectivamente. Por otro lado, dentro de la población de linfocitos T es posible diferenciar entre aquellos que expresan las moléculas correceptoras CD8 y CD4 en la membrana plasmática. Los linfocitos T CD8+ son conocidos como linfocitos T citotóxicos y participan en la inmunidad adaptativa eliminando directamente células tumorales o infectadas por patógenos intracelulares. Los linfocitos T CD4+ también participan en la respuesta inmune adaptativa y se conocen como linfocitos T cooperadores (Th), que se clasifican en cuatro grupos principales de células: Thl, Th2, Thl7 y célula T reguladora (Treg). Estos grupos de linfocitos T CD4+ participan en la inmunidad adaptativa con diversas funciones mediadas a través de la liberación de citoquinas. Las células Thl producen principalmente IFNy y entregan protección contra patógenos intracelulares. Las células Th2 secretan IL-4, IL-5 e IL-13 y combaten infecciones contra parásitos helmínticos. Las células Thl7 están caracterizadas por la producción de IL-17 y se encargan de la eliminación de bacterias extracelulares. Por otra parte, los Tregs son células con función inmunosupresora. Los Tregs se encargan de mantener la tolerancia contra los antígenos propios y de regular la respuesta inmune. Los Tregs se pueden reconocer por la expresión del factor de transcripción Foxp3, que es necesario para desarrollar y mantener los Tregs, y la expresión constitutiva de CD25.

A pesar de que existen mecanismos de control de la respuesta inmune (inducción de apoptosis, expresión de moléculas inhibitorias y acción de los Tregs), hay ocasiones en que estos mecanismos fallan. Las fallas en los mecanismos de regulación de la respuesta inmune, ejercida por los linfocitos T, puede conllevar al desarrollo de autoinmunidad, o, a una indebida regulación de la magnitud de la respuesta inmune ejercida contra patógenos, lo que puede generar un exceso de inflamación. Además, durante estos procesos nocivos, y debido a la falla de los mecanismos que limitan la respuesta inmune, se puede favorecer el desarrollo de un fenotipo hiperactivo en los linfocitos T. Este fenotipo hiperactivo ha sido descrito como una mayor expresión de marcadores de activación y una mayor proliferación. Esta hiperactividad de los linfocitos T provoca el desarrollo de autoinmunidad. En humanos la desregulación de los linfocitos T CD4+ tiene un rol central en el desarrollo de patologías como la Artritis Reumatoide (AR) y el Lupus Eritematoso Sistémico (LES).

Por lo que regular la actividad de los linfocitos T CD4+ es fundamental para mantener la homeostasis fisiológica y evitar el desarrollo de enfermedades autoinmunes y de procesos inflamatorios nocivos.

En este contexto los inventores han encontrado un método que permite regular la activación y proliferación de células T CD4+ de donantes humanos en condiciones normales y patológicas donde estas células están hiperactivadas, al exponer los linfocitos T CD4+ a una composición que comprende una fracción aislada de plasma, enriquecida en mitocondrias circulantes, llamada MitoCir. Esta composición podría aplicarse en todos los casos donde los linfocitos T CD4+ se encuentren desregulados, como por ejemplo en Lupus Eritematoso Sistémico (LES); Artritis reumatoide; procesos inflamatorios agudos, Psoriasis; Síndrome antifosfolipídico; Esclerosis múltiple; Aterosclerosis; Osteoartritis; Diabetes tipo I; Síndrome de Sjogren; Miastenia gravis; Enfermedad de Crohn ; Colitis ulcerosa; Vasculitis; Vasculitis asociadas a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos; Enfermedad injerto contra huésped; Preeclamsia y/o Enfermedad celíaca DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

Figura 1. Aislado de plasma enriquecido en mitocondrias extracelulares o circulantes. Imagen de un aislado plasma enriquecido en mitocondrias obtenida por microscopía electrónica de transmisión, las puntas de flechas señalan mitocondrias extracelulares o circulantes. La muestra se obtuvo de un donante sano.

Figura 2. Efecto del aislado de plasma que contiene mitocondrias sobre la activación de linfocitos T CD4+ cultivados en condiciones de activación y diferenciación. A) Gráficos de citometría de flujo para la expresión de CD25 en linfocitos T CD4+. El análisis se realizó después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondrias aisladas desde plasma MitoCir y con mitocondrias aisladas desde plasma dañadas MitoCir D. B) Gráfico resumen de la expresión de CD25 en linfocitos T CD4+ para los experimentos realizados. C) Gráficos de citometría de flujo para la expresión de PD-1 en linfocitos T CD4+. El análisis se realizó después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondrias aisladas desde plasma MitoCir con mitocondrias aisladas desde plasma dañadas MitoCir D. D) Gráfico resumen de la expresión de PD-1 en linfocitos T CD4+ para los experimentos realizados.

Figura 3. Efecto del aislado de plasma que contiene mitocondrias sobre la proliferación de linfocitos T CD4+ cultivados en condiciones de activación y diferenciación. A) Imágenes de microscopía óptica de los clústeres formados por linfocitos T CD4+. Las imágenes se tomaron después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondrias aisladas desde plasma MitoCir con mitocondrias aisladas desde plasma dañadas MitoCir D. Escala = 500 pm. B) Gráfico resumen de la cuantificación del área de los clústeres formados por linfocitos T CD4+ para los experimentos realizados. C) Gráficos de citometría de flujo para la proliferación de linfocitos T CD4+. La proliferación se evaluó mediante la dilución de la sonda CTV. El análisis se realizó después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondrias aisladas desde plasma MitoCir y con mitocondrias aisladas desde plasma dañadas MitoCir D. D) Gráfico resumen de la proliferación de linfocitos T CD4+ teñidos con CTV para los experimentos realizados.

Figura 4. Efecto del aislado de plasma que contiene mitocondrias derivado de un donante sano sobre la activación y proliferación de linfocitos T CD4+ de paciente con LES cultivados en condiciones de activación y diferenciación. A) Gráficos de citometría de flujo para la expresión de Ki-67 en linfocitos T CD4+ de un paciente con LES. El análisis se realizó después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondrias aisladas desde plasma MitoCir y con mitocondrias aisladas desde plasma dañadas MitoCir D. B) Gráfico resumen de la expresión de Ki- 67 en linfocitos T CD4+ de un paciente con LES. C) Gráficos de citometría de flujo para la expresión de CD25 en linfocitos T CD4+ de un paciente con LES. El análisis se realizó después de 4 días de cultivo para las condiciones sin mitocondrias, con mitocondnas aisladas desde plasma MitoCir y con mitocondnas aisladas desde plasma dañadas MitoCi D. D) Gráfico resumen de la expresión de CD25 en linfocitos T CD4+ de un paciente con LES.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han evaluado la aplicación de una fracción aislada de plasma, enriquecida en mitocondrias circulantes, llamada MitoCir, para regular la activación y proliferación de células T CD4+ de donantes humanos en condiciones normales y patológicas donde estas células están hiperactivadas o desreguladas.

Los resultados mostraron que las células T CD4+ cultivadas en presencia MitoCir redujeron significativamente su activación y diferenciación. Esto se correlacionó con una reducción de la proliferación y la detención de las fases G0/G1 del ciclo celular.

De esta forma, la composición desarrollada por los inventores, MitoCir tiene un efecto inmunosupresor en las célulasT CD4+. Esta composición MitoCir permite contribuir á la homeostasis celular de los individuos con patologías en que estas células están desreguladas, y es una poderosa herramienta para la comunicación intercelular a larga distancia y el alivio de la gravedad de las enfermedades autoinmunes.

De esta forma la invención se refiere a una composición para usar en un método de tratamiento de un paciente con un desorden inmunológico de hiperactivación o desregulación de los linfocitos T CD4+ que comprende administrar una composición que comprende un aislado de plasma, enriquecido en mitocondrias extracelulares, en un sujeto con hiperactivación o desregulación de los linfocitos T CD4+. Esta composición se administra en un paciente vía parenteral, por ejemplo, intramuscular o intravenoso.

Donde el desorden inmunológico de hiperactivación o desregulación de los linfocitos T CD4+ a tratar con la composición de la invención se escoge de cualquier enfermedad o síndrome que involucre hiperactivación o desregulación de los linfocitos T CD4+ , tales como: Lupus Eritematoso Sistémico (LES); Artritis reumatoide; procesos inflamatorios agudos, Psoriasis; Síndrome antifosfolipídico; Esclerosis múltiple; Aterosclerosis; Osteoartritis; Diabetes tipo I; Síndrome de Sjógren; Miastenia gravis; Enfermedad de Crohn ; Colitis ulcerosa; Vasculitis; Vasculitis asociadas a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos; Enfermedad injerto contra huésped; Preeclamsia y/o Enfermedad celíaca.

Los resultados muestran que la sangre de individuos sanos contiene mitocondrias, las que pueden encontrarse en el interior de vesículas o como organelos libres. Estas mitocondrias circulantes mantienen el potencial de membrana y producen ATP. Al evaluar el rol biológico de las mitocondrias circulantes, en relación con el efecto que podrían tener estas mitocondrias en linfocitos T CD4+, se observó que los linfocitos T CD4+ de donantes sanos incorporan mitocondrias circulantes, y estas mitocondrias tienen un efecto inmunosupresor sobre la activación, proliferación y diferenciación sobre este tipo celular. Un resultado similar se obtuvo al usar linfocitos T CD4+ provenientes de pacientes con LES (Lupus Eritematoso Sistémico). A partir de lo resultados se puede concluir que el tratamiento con mitocondrias aisladas permite una disminución de la proliferación y activación de estos linfocitos. Los inventores demostraron que mitocondrias aisladas de plasma de individuos sanos, son bioenergéticamente competentes y tienen efectos inmunoreguladores sobre los linfocitos T CD4+ de donantes sanos y de donantes con LES, dicho hallazgo, modifica el uso tradicional energético de las mitocondrias cuando son mitoceptadas y las posiciona como reguladores de células inmune.

El método de la invención tiene especial cuidado en evitar la activación de plaquetas, dado que está descrito que éstas liberan mitocondrias cuando se activan, de este modo estamos bloqueando la liberación de mitocondrias plaquetarias, las que se reconocen por los marcadores de superficie CD42b, CD42A y/o CD41, distintivos de plaquetas, por lo que se emplea un inactivador de plaquetas prostaglandina El (PGE1) (Focus Biomolecules) a una concentración final de preferentemente 10 pM diluida en un tampón anticoagulante, tal como citrato solución A dextrosa (0,1 M citrato trisódico, 0,11 M glucosa y 0,08 M ácido cítrico).

De este modo la invención apunta a un método de obtención de una composición enriquecida en mitocondrias circulantes el que comprende las etapas de: a) agregar una composición de prostaglandina El (PGE1) en citrato trisódico 0,08 a 0,2 M , 0,8 a 0,20 M de glucosa y de 0,05 a 0,lM de ácido cítrico, para alcanzar una concentración final entre 8 a 15 pM de PGE1 a plasma sanguíneo de donantes sanos b) centrifugar 150g por 5 a 20 minutos, y recoger el sobrenadante; c) centrifugar el sobrenadante de b) a 2500 g por 20 a 60 minutos; d) concentrar el sobrenadante de c) centrifugando a 13000 g por 5 a 20 minutos al menos una vez; e) resuspender la pella de la etapa d) en una solución tampón. Donde en una realización el tampón comprende: 0,2 M sacarosa, 0,01 M TRIS, 0,001 M EGTA, IX inhibidor de proteasas. En una segunda realización el tampón comprende: EGTA 0,5 mM, MgCI2 3 mM, K-lactobionato 60 mM, taurina 20 mM, KH2PO4 10 mM, HEPES 20 mM, sacarosa 110 mM, inhibidor de proteasas IX.

De este método se obtiene una composición enriquecida en mitocondrias circulantes que comprende una alta concentración de mitocondrias circulantes y al mismo tiempo comprende una baja concentración de mitocondrias positivas para los marcadores CD42b, CD42A y/o CD41.

En una realización de la invención la composición enriquecida en mitocondrias circulantes de la de la invención sirve para preparar un medicamento útil para contrarrestar la hiperactivación de linfocitos T CD4+. Donde estos linfocitos T CD4+ están hiperactivos en procesos inflamatorios agudos o en enfermedades autoinmunes. Donde las enfermedades autoinmunes se escogen entre: Lupus Eritematoso Sistémico (LES); Artritis reumatoide; Psoriasis; Síndrome antifosfolipídico; Esclerosis múltiple; Aterosclerosis; Osteoartritis; Diabetes tipo I; Síndrome de Sjógren; Miastenia gravis; Enfermedad de Crohn ; Colitis ulcerosa; Vasculitis; Vasculitis asociadas a anticuerpos anticitoplasma de neutrófilos; Enfermedad injerto contra huésped; Preeclamsia y/o Enfermedad celíaca.

En una realización la composición de la invención sirve para preparar un medicamento para administración parenteral.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Obtención de aislado rico en mitocondrias, MitoCir. Utilizando centrifugaciones a diferentes velocidades, se obtuvo un aislado de plasma sanguíneo humano que contiene mitocondrias extracelulares, conocidas como mitocondrias circulantes, la Figura 1 muestra una fotografía de la composición obtenida, donde se aprecia la gran concentración de mitocondrias.

El aislamiento de mitocondrias desde plasma se realizó evitando la activación de plaquetas. Sangre fresca se recolectó desde donantes humanos sanos utilizando tubos de recolección de sangre con citrato de sodio 3.2% como anticoagulante (BD Vacutainer®). La sangre se centrifugó a 150g por 20 min a temperatura ambiente (TA) sin freno y sin aceleración. Se recolectó el plasma y se le añadió prostaglandina El (PGE1) (Focus Biomolecules) a una concentración final de 10 pM diluida en tampón anticoagulante citrato solución A dextrosa (0,1 M citrato trisódico, 0,11 M glucosa y 0,08 M ácido cítrico) (ACD-A) para evitar la activación de plaquetas, dado que está descrito que éstas liberan mitocondrias cuando se activan, de este modo estamos bloqueando la liberación de mitocondrias plaquetarias. El plasma se centrifugó a 150g por 10 min a 4°C sin freno y sin aceleración para remover los glóbulos rojos y leucocitos. El plasma se recolectó y centrifugó a 2500g por 30 min a 4°C sin freno y sin aceleración para remover las plaquetas y obtener el sobrenadante con mitocondrias circulantes. Las mitocondrias se concentraron a través de dos centrifugaciones sucesivas a 13000g por 10 min a 4°C lavando con tampón para aislamiento de mitocondrias (MIB) (0.2 M sacarosa, 0.01 M TRIS, 0.001 M EGTA, IX inhibidor de proteasas). El pellet obtenido luego de la última centrifugación diferencial a 13000g son las mitocondrias circulantes, MitoCir. La pella de mitocondrias circulantes se resuspendió en MIB (Mitochondrial Isolation Buffer 0.2 M sacarosa, 0.01 M TRIS, 0.001 M EGTA, IX inhibidor de proteasas)) o en tampón de respiración mitocondrial 05 (MIR05) (EGTA 0.5 mM, MgCI2 3 mM, K-lactobionato 60 mM, taurina 20 mM, KH2PO4 10 mM, HEPES 20 mM, sacarosa 110 mM, inhibidor de proteasas IX), dependiendo del experimento.

Ejemplo 2. Efecto del aislado MitoCir sobre linfocitos aislados.

Con esta preparación obtenida en el ejemplo 1 se desarrollaron experimentos in vitro en los que se depositaron mitocondrias aisladas desde plasma sanguíneo humano junto con linfocitos T CD4+ en condiciones de activación y diferenciación. Los linfocitos T CD4+ en condiciones de activación y diferenciación en presencia de MitoCir, mitocondrias aisladas de plasma, presentaron una menor activación y proliferación al compararlo con los linfocitos T CD4+ en condiciones de activación y diferenciación, pero sin MitoCir, como se muestra en la figura 2 y 3. Obtención de linfocitos

Se recolectó la sangre de donantes sanos o con LES, y las PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cell)se aislaron utilizando un gradiente de densidad Ficoll-Paque PLUS centrifugando a 400g por 30 min a TA sin freno y aceleración media. Las PBMCs se recolectaron y se lavaron con PBS-1X. Las células se resuspendieron en medio para linfocitos y se realizó el recuento celular. Luego se centrifugaron a 600g por 5 min a 4°C. Se resuspendieron en PBS-1X + 2% FBS y se tiñeron con CD4 - APC-H7 y CD8-PE a una concentración de 20x6 células/mL para ser sorteadas. Las PBMCs teñidas se lavaron con PBS-1X + 2% FBS centrifugando a 600g por 5 min a 4°C. Se resuspendieron en PBS-1X + 10% FBS filtrado y se seleccionó la población de linfocitos T CD4+(CD4+CD8-) utilizando la técnica de clasificación de células activadas por fluorescencia, para lo que usó un cell sorter BD FacsAria™ Fusion. Los linfocitos T CD4+ se centrifugaron a 700g por 5 min a 4°C y, en el caso de analizar posteriormente la proliferación celular, se tiñeron con CellTrace™ Violet (CTV) 5 pM por 20 min a 37°C previo al cultivo. Los linfocitos T CD4+ se resuspendieron en medio para linfocitos y se sembraron lxlO ⁵ células en una placa de 96 pocilios de fondo redondo con anti-CD3 (1 pg/mL), anti- CD28 (2 pg/mL), TGF-01 (10 ng/mL) e IL-2 (50 U/mL). La estimulación con anti-CD3 y anti-CD28 emula la estimulación por las APCs y permite que los linfocitos T se activen y proliferen. La citoquina TGF-01 estimula la diferenciación de los linfocitos T CD4+ a Tregs (Regulatory T cell). Se añadió 20 pg de proteína de mitocondrias circulantes a los pozos con linfocitos T CD4+. Las mitocondrias se tiñeron con MitoTracker, como se mencionó en la sección 3.8, para posteriormente visualizar las células que las incorporaron. Los linfocitos T CD4+ se incubaron a 37°C con 5% CO ₂ . Los linfocitos T CD4+ bajo condiciones de activación más TGF-01 y con mitocondrias circulantes se evaluaron al día 1 por microscopía confocal, para visualizar la internalización de mitocondrias circulantes. Los linfocitos T CD4+ se analizaron al día 4 por citometría de flujo, para evaluar el efecto de las mitocondrias circulantes. Como control se utilizó linfocitos T CD4+ cultivados con citoquinas, pero sin mitocondrias circulantes. Para corroborar que los efectos observados eran dependientes de mitocondrias viables, como control se añadieron 20 pg de proteína de mitocondrias circulantes sonicadas por 5 min a 60% de intensidad en un equipo ultrasonic cleaner y expuestas a luz UV por 30 min.

Además, se incorporó un control experimental en el que las mitocondrias aisladas desde plasma se dañaron utilizando procesos de sonicación y exposición a luz UV, MitoCir D. El análisis de los linfocitos T CD4+ se realizó mediante citometría de flujo, evaluando marcadores de activación como CD25 y PD-1 (Programmed cell death protein 1) y la dilución de una sonda específica para evaluar proliferación (CTV, CellTrace™ Violet).

Efecto sobre Linfocitos de donantes sanos.

Se evaluó el efecto de las mitocondrias circulantes sobre linfocitos T CD4+ cultivados en condiciones de activación más TGF-01 para evaluar el rol inmunoregulador de las mitocondrias circulantes Mito Cir. Se observó que existe una disminución en la activación de los linfocitos (figura 2) y proliferación (figura 3) de los linfocitos T CD4+ cultivados con Mito Cir.

Para evidenciar que los efectos observados eran por mitocondrias circulantes intactas se agregó un control experimental, en el que las mitocondrias circulantes se sonicaron y se expusieron a luz UV. Cuando se realizó el tratamiento con MitoCir D, los efectos sobre los linfocitos T CD4+ se vieron disminuidos, lo que indica que la mitocondria intacta es la que estaría ejerciendo el efecto inmunoregulador.

Considerando los resultados expuestos, se puede concluir que MitoCir presenta un efecto inmunosupresor sobre los procesos de activación y proliferación de los linfocitos T CD4+ de donantes sanos.

Efecto sobre Linfocitos de donantes con enfermedades autoinmunes.

Por otra parte, el aislado de plasma sanguíneo humano que contiene mitocondrias se evaluó sobre linfocitos T CD4+ provenientes de donantes con Lupus Eritematoso Sistémico (LES). El LES es una enfermedad donde los linfocitos T CD4+ están desregulados y presentan un fenotipo de hiperactivación que contribuye al desarrollo y daño provocado por la enfermedad. Al evaluar el efecto sobre linfocitos T CD4+ de donantes con LES se observó, al igual que en el caso de los linfocitos T CD4+ de donantes sanos, una disminución de la activación y proliferación, como se presenta en la figura 4.

Al cultivar linfocitos T CD4+ provenientes de donantes con LES, con MitoCir, en condiciones de activación más TGF-01, se evidenció un efecto similar, aunque en menor medida, que cuando se cultivó linfocitos T CD4+ de donantes sanos con MitoCir. Se observó una disminución de la activación (figura 4A y 4B) y de la proliferación (4C y 4D) de los linfocitos T CD4+ provenientes de donantes con LES. La proliferación se evaluó mediante la expresión de Ki-67, una proteína intracelular que se expresa más en células proliferativas. Mientras que la activación se midió mediante la expresión de CD25.

El efecto del aislado de plasma de la invención que contiene mitocondrias sobre los linfocitosT CD4+ de donantes con LES, muestra un resultado destacadle e interesante, dado que en estos linfocitos T CD4+ de pacientes con LES, tienen un perfil muy proliferativo y activado, lo que se regula con la composición de la invención, aislado de plasma que contiene mitocondrias derivado de un donante sano, disminuyendo la proliferación y activación.