Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Sclareolid und verwandten Verbindungen durch biokatalytische Zyklisierung einer mehrfach ungesättigten Carbonsäu- reverbindungen, insbesondere von Homofarnesylsäure und verwandten Verbindungen; ein sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ambroxid über die biokatalytische Cyclisierung von Homofarnesylsäure zu Sclareolid.

Hintergrund der Erfindung

Verbindungen mit dem Grundgerüst des Dodecahydronaphtho[2,1 -b]furans sind als

Aromachemikalien von großem wirtschaftlichem Interesse. Hier ist Verbindung (-)-2 zu nennen, das als das linksdrehende Stereoisomer des Ambroxans bekannte (3aR,5aS,9aS,9bR)- 3a,6,6,9a-Tetramethyldodecahydronaphtho-[2,1 -ö]-furan.

Ursprünglich aus dem Ambra des Pottwals gewonnen, gibt es heute vor allem zwei Routen, die Zugang zu Ambroxan erlauben. Sclareol (3), ein Inhaltsstoff des Muskatellersalbeis (Salvia sclarea) dient dabei oft als geeignetes Ausgangsmaterial für semisynthetisches Material, weil es die optische Information für Verbindung ((-)-2) bereits enthält. Dabei kann man den oxidativen Abbau mit Chromsäure, Permanganat, H ₂ 0 ₂ oder Ozon durchführen [Stoll et al.; Helv C im Acta (1950), 33: 1251]. Das erhaltene Sclareolid (4) wird durch eine an- schließende Reduktion (z.B. mit LiAIH ₄ oder NaBH ₄ ) in das Ambrox-1 ,4-diol (5) überführt [Mookherjee et al.; Perfumer and Flavourist (1990), 15: 27]. Die Herstellung von Verbindung (4) aus Sclareol (3) kann auch durch eine Biotransformation mit Hyphozyma roseoniger erfolgen [EP 204009]

Ambrox-1 ,4-diol (5) kann schließlich mit einer Reihe von chemischen Verfahren zu Verbindung ((-)-2) zyklisiert werden. Zu dem Racemat von Ambroxan (rac-2) sind Zugänge u.a. via Homofarnesylsäure [US 513,270; Lucius et al.; Chem Ber (1960), 93: 2663] und 4-(2,6,6- Trimethyl-cyclohex-1 -enyl)-butan-2-on [Büchi et al.; Helv Chim Acta (1989), 72: 996] bearbeitet worden.

Das Marktvolumen von Ambroxan lag 2002 mittelwertig bei 20 Tonnen pro Jahr. Hierfür ist eine Ausgangsbasis von ca. 33 Tonnen Sclareol pro Jahr notwendig. Für die Produkti- on einer Tonne Ambroxan werden 207 Tonnen verschiedener Einzelstoffe benötigt, die wiederum den Anfall von 206 Tonnen Abfall bedingen. Die anfallenden Substanzen weisen unterschiedliche, insgesamt aber verhältnismäßig starke Umwelt- und Gesundheitswirkungen auf [Deutsche Bundesstiftung Umwelt]. Somit ist diese Synthese sehr energieaufwändig und erfordert den Einsatz umweltbelastender Chemikalien.

Die biokatalytische Synthese von Verbindung ((-)-2) ist in der Literatur beschrieben

[Neumann et al.; Biol Chem Hoppe Seyler (1986), 367: 723]. Dabei wird das Molekül aus Homofarnesol (Verbindung (1 a), (3Z,7£)-4,8,12-Trimethyltrideca-3,7,1 1 -trien-1 -ol) gewonnen. Als Katalysator wurde die Squalen-Hopen-Zyklase (SHC) aus Alicyclobacillus acidocaldarius (ehem. Bacillus acidocaldarius) verwendet. Weitere Enzyme die Zyklisierung von Homofarne- sol zu Ambroxan katalysieren sind in Patentschriften (z.B. WO 2012/066059) und in der Literatur beschrieben [Neumann et al, a.a.O].

Seitz, M. et al beschreiben in ChemBioChem 2013, 14, 436-439 ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Sclareolid aus Homofarnesylsäure unter Verwendung der Squalen- Hopen Cyclase aus Zymomonas mobilis (Zm SHCI). Die dabei erzielten Produktausbeuten lie- gen jedoch nur bei etwa 7,7 bis 22,9 %.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Ambroxid-Vorstufen insbesondere von Sclareolid und verwandten Verbindungen zur Verfügung zu stellen, das technisch einfacher und kostengünstiger als herkömmliche chemische Verfahren (z.B Verringerung der Anzahl der notwendigen Reaktionsstufen, und/oder günstigere Ausgangsstoffe) durchgeführt werden kann. Eine weitere Aufgabe war es, die anfallenden Kosten zusätzlich durch die Verwendung leicht zugänglicher Ausgangsstoffe sowie einer Verminderung der Anzahl chemischer Reaktionen (bzw. Stufen) zu senken. Insbesondere sollte ein verbessertes biokatalytisches Verfahren zur Herstellung von Sclareolid bereitgestellt werden. Kurzfassung der Erfindung

Obige Aufgaben wurde gelöst durch Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Ambroxid-Vorstufen bevorzugt Sclareolid, der allgemeinen Formel (4) dadurch gekennzeichnet, dass Homo-'farnesyhsäure-Derivate, insbesondere Homofarnesylsäure der allgemeinen Formel (Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.) biokatalytisch, wie im folgenden näher erläutert, zyklisiert wird.

Figurenbeschreibung

Figur 1 zeigt das Gaschromatographie (GC) Spektrum (A) eines erfindungsgemäß hergestellten Zyklisierungsprodukts von Homofarnesylsäure im Vergleich zum (B) dem GC eines käuflichen Sclareolid-Präparats.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

A. Allgemeine Definitionen

"Homo-'farnesyhsäure", (Verbindung (1 b)) ist gleichbedeutend mit, "(3-r,7£)-4,8,12- trimethyltrideca-3,7,1 1 -triensäure "

"Sclareolid" (Verbindung (4)) ist gleichbedeutend mit "(3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a- tetramethyl-1 ,4,5,5a,7,8,9,9b-octahydrobenzo[e]benzofuran-2-on".

Linksdrehendes Sclareolid (oder Verbindung (-)-4) besitzt folgende Formel

„Ambrox",„Ambroxan" und„Amroxid" werden hierin als Synonyme verwendet. Sie umfassen sämtliche stereoisomeren Formen, wie insbesondere (+)-Ambrox, 3a-epi-(-)Ambrox, 9b-epi- (-) Ambrox und insbesondere (-) Ambrox.

„Cyclasen" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind allgemein Enzyme bzw. Enzymmutanten, welche insbesondere die Aktivität einer Homofarnesylsäure-Cyclase zeigen. Als Enzyme mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Cyclase sind intramolekulare Transferasen aus der Subklasse der Isomerasen; also Proteine mit der EC-Nummer EC 5.4 geeignet. (Enzym- code gemäß Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650) Insbesondere handelt es sich um Vertreter von EC 5.4.99.17. Als Enzyme mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Cyclase sind insbesondere solche Cyclasen geeignet, die auch die Cyclisierung von Homofarnesylsäure zu Sclareolid und/oder von Squalen zu Höpen (daher auch zuweilen die Bezeichnung„SHC" Squa- len Höpen Cyclase) bewirken und die ausführlich in der internationalen Anmeldung PCT/EP2010/057696 beschrieben werden, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Mutantan davon sond z.B. beschrieben in der WO 2012/066059 worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Aufgrund der Reversibilität enzymatischer Reaktionen betrifft die vorliegende Erfindung die hierin beschriebenen enzymatischen Umsetzungen in beiden Umsetzungsrichtungen.

„Funktionale Mutanten" einer „Cyclase" umfassen die unten definierten „funktionalen Äquivalente" solcher Enzyme.

Der Begriff „biokatalytisches Verfahren" betrifft jegliches in Gegenwart von katalytischer Aktivität einer erfindungsgemäßen„Cyclase" bzw. eines Enzyms mit„Cyclase Aktivität" durch- geführtes Verfahren, d.h. Verfahren in Gegenwart von rohem, oder gereinigtem, gelöstem, dis- pergiertem oder immobilisiertem Enzym, oder in Gegenwart ganzer mikrobieller Zellen, welche derartige Enzymaktivität aufweisen oder exprimieren. Biokatalytische Verfahren umfassen somit enzymatische als auch mikrobielle Verfahren.

Der Begriff „Stereoisomere" umfasst Konformationsisomere und insbesondere Konfigura- tionsisomere, wie Enantiomere und Diastereoisomere.

Generell mit umfasst sind erfindungsgemäß alle stereoisomeren Formen der hierin beschriebenen Verbindungen, wie Konstitutionsisomere und insbesondere Stereoisomere und Gemische davon, wie z.B. optische Isomere oder geometrische Isomere, wie E- und Z- Isomere., sowie Kombinationen davon. Sind mehrere Asymmetriezentren in einem Molekül vorhan- den, so umfasst die Erfindung sämtliche Kombinationen von unterschiedlichen Konformationen dieser Asymmetriezentren, wie z.B. Enantiomerenpaare.

Der Begriff„stereospezifisch" bedeutet, dass eines von mehreren möglichen Stereoisomeren einer erfindungsgemäß hergestellten Verbindung mit wenigstens eine Asymmetriezentrum durch die Wirkung eines erfindungsgemäßen Enzyms in hohem„Enatiomerenüberschuss" oder hoher "Enantiomerenreinheit", wie z.B. wenigstens 90%ee, insbesondere wenigstens 95 %ee, oder wenigstens 98 %ee, oder wenigstens 99 %ee produziert wird. Der ee% Wert wird nach folgender Formel berechnet: ee% = [X _A -XB]/[ XA+XB] ^* 100, worin XA und XB für den Molenbruch der Enantiomere A bzw B stehen.

Unter einer„Zyklase-Aktivität", die mit einem„Referenzsubstrat unter Standardbedingungen" bestimmt wurde, ist z.B. eine Enzymaktivität, welche die Bildung eines cyclischen Produkts aus einem nicht-cyclischen Substrat beschreibt. Standardbedingungen sind z.B. Substratkon- zentrationen von 10 mM bis 0,2 M, insbesondere 15 bis 100mM, wie z.B. etwa 20 bis 25 mM; bei pH 4 bis 8, und bei Temperaturen von z.B. 15 bis 30 oder 20 bis 25 °C. Die Bestimmung kann dabei mit rekombinanten Zyklase-exprimierenden Zellen, aufgeschlossenen Zyklase- exprimierenden Zellen, Fraktionen davon oder angereichertem oder gereinigtem Zyklase- Enzym erfolgen. Insbesondere ist Referenzsubstrat ein Homofarnesylsaure der Formel (la); Standardbedingungen sind insbesondere etwa 20 bis 25 mM Homofarnesylsaure der Formel (la), bei 20 bis 25 °C und pH 4 - 6, wie etwa 4,5; wie auch in den Bespielen näher beschrieben.

„Ausbeute" und/oder der„Umsatz" einer erfindungsgemäßen Reaktion w i rd über einen definierten Zeitraum von beispielsweise 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 36 oder 48 Stunden bestimmt, in dem die Umsetzung von Homo ^-, farnesyhsäure zu Sclareolid mittels der erfin- dungsgemäßen Zyklasen erfolgt. Insbesondere wird die Umsetzung unter genau definierten Bedingungen durchgeführt, von zum Beispiel 25, 30, 40, 50 oder 60°C. Insbesondere erfolgt die Bestimmung der Ausbeute und/oder des Umsatzes indem die Reaktion zur Umsetzung von Homofarnesylsäure zu Sclareolid mittels der erfindungsgemäßen Zyklasen bei 30°C über 16 Stunden durchgeführt wird.

Zur Bestimmung der Ausbeute und/oder des Umsatzes wi rd i n sbeson d ere eine 10 mM Homo-'farnesyhsäure-Lösung mit einer Zyklase-Lösung umgesetzt, wobei das Enzym als Membran-Proteinextrakt Zyklase-exprimierender Zellen (isoliert z.B. gemäß [Ochs D.et al.; J Bacteriol (1992), 174: 298]) in einer Konzentration an Proteingehalt von 0,08 Gewichtsprozent vorliegt.

Eine erfindungsgemäße Zyklase kann auch dadurch gekennzeichnet sein, dass sie bei der Umsetzung von Homofarnesylsäure zu Sclareolid unter den gleichen Bedingungen die 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 1 1 -, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 20-, 21 -, 22-, 23-, 24-, 25-, 26-, 27-, 28-, 29-, 30-, 31 -, 32-, 33-, 34-, 35-, 36-, 37-, 38-, 39-, 40-, 41 -, 42-, 43-, 44-, 45- , 46-, 47-, 48-, 49-, 50-, 51 -, 52-, 53-, 54-, 55-, 56-, 57-, 58-, 59-, 60-, 61 -, 62-, 63-, 64-, 65-, 66-, 67-, 68-, 69-, 70-, 71 -, 72-, 73-, 74-, 75-, 76-, 77-, 78-, 79-, 80-, 81 -, 82-, 83-, 84-, 85-, 86-, 87-, 88-, 89-, 90-, 91 -, 92-, 93-, 94-, 95-, 96-, 97-, 98-, 99-, 100-, 200-, 500-, 1000- fache oder höhere Ausbeute und/oder des Umsatz im Vergleich zu der Squalen-Hopen- Zyklase (SHC) aus Alicyclobacillus acidocaldarius (ehem. Bacillus acidocaldarius) zeigt Der Begriff „Bedingungen" bezieht sich hier auf Reaktionsbedingungen wie Susbstratkonzentra- tion, Enzymkonzentration, Umsetzungszeitraum und/oder Temperatur.

Der Begriff „Carbonsäure" umfasst sowohl die freie Säure als auch die Salzform davon, wie z.B. deren Alkali- oder Erdalkalimetall-Salze. Dies gilt entsprechend für alle hierin genannten Carbonsäuren, wie z.B. die Homofarnesylsäure

Der Begriff„ etwa" bezeichnet eine potentielle Änderung von ± 25% eines angegebenen Wertes, insbesondere ± 15%, ± 10%, vorzugsweise ± 5%, ± 2% oder ± 1 %.

Der Begriff „ im Wesentlichen" umschreibt einen Wertebereich von etwa 80 bis einschließlich 100%, wie z.B. 85-99,9% , insbesondere 90 bis 99,9%, vorzugsweise 95 bis 99,9% oder 98 bis 99,9% vor allem 99 bis 99,9%. Sofern keine abweichenden Angaben gemacht werden gelten hierin folgende allgemeine chemische Definitionen:

„Alkyl" steht für gesättigte, geradkettige oder verzweigte, insbesondere geradkettige Kohlenwasserstoffreste mit 1 bis 6 insbesonderel bis 4 Kohlenstoffatomen, z. B.

Methyl, Ethyl, Propyl, 1 -Methylethyl, Butyl, 1 -Methyl-propyl, 2-Methylpropyl, und 1 ,1 - Dimethylethyl als beispielhafte Vertreter für Ci-C4-Alkyl; sowie Pentyl, 1 -Methylbutyl, 2- Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Di-methylpropyl, 1 -Ethylpropyl, Hexyl, 1 ,1 -Dimethylpropyl, 1 ,2- Dimethylpropyl, 1 -Methylpentyl, 2-Methyl pentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,1 - Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3- Dimethylbutyl, 1 -Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethyl-1 - methylpropyl und 1 -Ethyl-2-methylpropyl; insbesondere Methyl, Ethyl, n-Propyl und n-Butyl.

B. Spezielle Ausgestaltungen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere folgende spezielle Ausführungsformen:

1 . Verfahren zur biokatalytischen Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel II

(II) worin R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ unabhängig voneinander für H oder Ci-C4-Alkyl, insbesondere Methyl oder Ethyl, vorzugsweise Methyl, stehen,

in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren,

wobei man die Verbindung mit einem Protein, insbesondere einem Protein mit Zyklase- Aktivität, in Kontakt bringt, das zur Zyklisierung einer mehrfach ungesättigten Carbonsäure, insbesondere von Homofarnesylsäure, befähigt ist.

Verfahren nach Ausführungsform 1 , wobei man die Verbindung der Formel I mit einem Protein in Kontakt bringt, das die enzymatische Aktivität einer Squalen-Hopen-Zyklase (SHC) aufweist.

Verfahren nach Ausführungsform 1 oder 2 wobei man als Substrat eine mehrfach ungesättigte Carbonsäure der allgemeinen Formel I,

worin R ¹ , R ² , R ³ und R ⁴ die oben angegebenen Bedeutungen besitzen,

insbesondere in im wesentlichen stereoisiomerenreiner Form, einsetzt.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei man Homofarnesylsäu- re der Formel la

(la)

als Edukt einsetzt, insbesondere in im wesentlichen stereoisiomerenreiner Form, vorzugsweise in einem Anteil der (3E,7E)-Homofarnesylsaüre von wenigsten 70 mol%, besonders bevorzugt wenigsten 75, 80 oder 85 mol%, am meisten bevorzugt 90, 95 oder 99 oder 99,9 mol%, bezogen auf die Gesamtmenge an enthaltenen Homofarnesylsäure- Isomeren.

Verfahren nach Ausführungsform 4, wobei man Sclareolid der Formel IIa

(IIa)

in stereoisomerenreiner Form oder als Gemisch von Stereoisomeren erhält. Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die SHC ausgewählt ist unter

a) Proteinen, umfassend ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2

b) durch Deletion, Insertion, Substitution, Addition, Inversion oder einer Kombination von Proteinen gemäß a) abgeleiteten Proteinen, umfassend ein Polypeptid mit einer Sequenzidentität von wenigsten 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %, 70%, insbesondere wenigstens 75% oder 80%, vorzugsweise wenigsten 85 %, wie z.B. wenigstens 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2; und

c) zu a) oder b) funktional äquivalenten Proteinen, welche die Zyklisierung von Homo- farnesylsäure zu Sclareolid katalysieren.

Verfahren nach Ausführungsform 6, wobei das funktional äquivalente Protein ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist unter

a) SEQ ID NO: 3 bis 326 und

b) einer davon durch Deletion, Insertion, Substitution, Addition, Inversion oder einer Kombination abgeleiteten Aminosäuresequenz mit einem Identitätsgrad von wenigstens 60%, 65 %, 70%, insbesondere wenigstens 75% oder 80%, vorzugsweise wenigsten 85 %, wie z.B. wenigstens 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%,

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die enzymatische Zyk- lase-Aktivität, insbesondere dir Aktivität der SHC, in einer Form vorliegt, ausgewählt unter:

a) einer freien, gegebenenfalls teilweise oder vollständig gereinigten natürlichen oder rekombinant hergestellten Zyklase,

b) Zyklase gemäß a) in immobilisierter Form;

c) ganzen Zellen, enthaltend mindestens eine Zyklase;

d) Zelllysaten oder Zellhomogenisaten von Zellen gemäß c).

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die Umsetzung in einphasigen wässrigen Systemen oder in zweiphasigen wässrig-organischen oder festflüssigem Systemen erfolgt.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die Umsetzung bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 60°C, insbesondere 10 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C und/oder einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8, insbesondere 5 bis 7 erfolgt.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die SHC aus einem Mikroorganismus ausgewählt unter Methylococcus capsalatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec, Streptomyces coelicolor und insbesondere Zymomonas mobilis isoliert wird.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die SHC aus einem die SHC überexprimierenden Mikroorganismus isoliert wird, welcher ausgewählt ist unter Bakterien der Gattung Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacil- lus und Lactococcus.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die SHC aus transge- nen die SHC überexprimierenden Bakterien der Spezies Escherichia coli, Pseudomonas put/da, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Zymomonas mobilis isoliert wird.

Verfahren nach einer der vorherigen Ausführungsformen, wobei die Umsetzung in batch-, fed-batch oder kontinuierlicher Fahrweise erfolgt.

Verfahren nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man die biokataly- tische Umsetzung unter wenigstens einer der folgenden Bedingungen durchführt:

a) bei einem pH Wert des Reaktionsmediums im Bereich von etwa 4 bis 5,9 oder 5,8 oder 4,5 bis 5,8, insbesondere 4,5 bis 5,5 oder 5 bis 5,5;

b) bei einer Substratkonzentration von mindesten 15 mM, wie z.B. bis zu 100 mM insbesondere bis zu 50 mM, insbesondere 15 bis 30 mM, vor allem 15 bis 25 mM; c) bei einer Enzymkonzentration von wenigstens 5mg/ml; insbesondere 5 bis 100, vorzugsweise 10 bis 50 oder 15 bis 40 oder 15 bis 30 mg/ml

d) bei einer Reaktionstemperatur im Bereich von 32 bis 40 °C insbesondere 35 bis 38°C;

e) in einem Citrat-Puffer, insbesondere Natrium-Citrat-Puffer, insbesondere enthaltend 1 bis 20 mM oder 5 bis 10 mM MgC

f) bei einer Pufferkonzentration von etwa 10 bis 100, insbesondere 20 bis 50 mM.

Bevorzugt werden die erfindungsgemöße Verfahren unter gleichzeitiger Verwirklichung der obigen Bedingungen a) bis b) oder a) bis c) oder a) bis d) oder a) bis e) oder a) bis f) durchgeführt. Dabei sind jegliche Kombinationen von Parameterbereichen unabhängig vom jeweiligen Bevorzugungsgrad einzelner Bereiche Teil der vorliegenden Offenbarung. Verfahren zur Herstellung von 3a,6,6,9a-Tetramethyl-dodecahydronaphto[2,1 -b]furan (Ambroxid), wobei man a) Homofarnesylsäure nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zu Sclareolid umsetzt;

b) das Produkt aus Stufe a) in an sich bekannter Weise chemisch zu Ambroxdiol reduziert und

c) Ambroxidol aus Stufe b) in an sich bekannter Weise chemisch zu Ambroxid cycli- siert.

17. Verfahren nach Ausführungsform 16, wobei Ambroxid das (-)- Ambroxid ((3aR,5aS,9aS,9bR)-3a,6,6,9a-Tetramethyl-dodecahydronaphto[2 ,1 -b]furan [CAS 6790- 58-5]) ist.

C. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung

1. Besonders geeignete Zyklase-Sequenzen

Erfindungsgemäß brauchbare Zyklasen) sind SHCs deren SEQ ID NO für die entsprechende Wildtypsequenz, Quellorganismus und Genbank-Referenznummer, sind in folgender Tabelle zusammengefasst.

SJD DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen

sl seq_ JD 2 Zymomonas mobilis AAV90172.1

s20 seq_ JD 3 Streptomyces coelicolor CAB39697.1

s911 seq_ JD 4 Acetobacter pasteurianus BAH99456.1

s2 seq_ JD 5 Bradyrhizobium sp. ABQ33590.1

s940 seq_ JD 6 Zymomonas mobilis EE 62728.1

s949 seq_ JD 7 Acidithiobacillus caldus EET25937.1

sl67 seq_ JD 8 Acidithiobacillus ferrooxidans ACH84004.1

s41 seq_ JD 9 Acidobacterium capsulatum AC034244.1

s36 seq_ JD 10 Acidothermus cellulolyticus ABK53469.1

s83 seq_ JD 11 Adiantum capillus-veneris BAF93209.1

sl43 seq_ JD 12 Ajellomyces capsulatus EDN09769.1

s995 seq_ JD 13 Ajellomyces capsulatus EER40510.1

sl63 seq_ JD 14 Ajellomyces capsulatus EEH02950.1

sl3 seq_ JD 15 Alicyclobacillus acidocaldarius EED08231.1

sl4 seq_ JD 16 Alicyclobacillus acidocaldarius P33247.4

S1193 seq_ JD 17 Alicyclobacillus acidocaldarius AAT70690.1

s21 seq_ JD 18 Alicyclobacillus acidoterrestris CAA61950.1

S1189 seq_ JD 19 Alicyclobacillus acidoterrestris AAT70691.1

s51 seq_ JD 20 Anabaena variabilis ABA24268.1

s76 seq_ JD 21 Anaeromyxobacter sp. ABS28257.1

sl59 seq_ JD 22 Aspergillus clavatus EAW07713.1

sl31 seq_ JD 23 Aspergillus flavus EED48353.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen sl76 seq_ JD 24 Aspergillus fumigatus EDP50814.1 sl26 seq_ JD 25 Aspergillus fumigatus EAL84865.1 sl78 seq_ JD 26 Aspergillus fumigatus EAL86291.2 sl21 seq_ JD 27 Aspergillus niger CAK43501.1 sll5 seq_ JD 28 Aspergillus niger CAK45506.1 sl24 seq_ JD 29 Aspergillus oryzae BAE63941.1 sll9 seq_ JD 30 Azotobacter vinelandii EAM07611.1 s223 seq_ JD 31 Bacillus amyloliquefaciens ABS74269.1 s221 seq_ JD 32 Bacillus anthracis AAP27368.1 s976 seq_ JD 33 Bacillus cereus EEK66523.1 s225 seq_ JD 34 Bacillus cereus EAL12758.1 s972 seq_ JD 35 Bacillus cereus EEL44583.1 s977 seq_ JD 36 Bacillus cereus EEK43841.1 s985 seq_ JD 37 Bacillus cereus EEK82938.1 s988 seq_ JD 38 Bacillus cereus EEK99528.1 s981 seq_ JD 39 Bacillus cereus EEK77935.1 s987 seq_ JD 40 Bacillus cereus EEL81079.1 s960 seq_ JD 41 Bacillus cereus EEK88307.1 s979 seq_ JD 42 Bacillus cereus EEL63943.1 s974 seq_ JD 43 Bacillus cereus EEL59884.1 s956 seq_ JD 44 Bacillus cereus EEL69857.1 s951 seq_ JD 45 Bacillus cereus EEL92663.1 s986 seq_ JD 46 Bacillus cereus EEL49968.1 s227 seq_ JD 47 Bacillus cereus AAU 16998.1 s224 seq_ JD 48 Bacillus cereus AAS42477.1 s212 seq_ JD 49 Bacillus cereus ACK95843.1 s289 seq_ JD 50 Bacillus coahuilensis 205373680 s219 seq_ JD 51 Bacillus cytotoxicus ABS22481.1 s230 seq_ JD 52 Bacillus licheniformis AAU23777.1 s955 seq_ JD 53 Bacillus mycoides EEL98438.1 s990 seq_ JD 54 Bacillus mycoides EEM04821.1 s989 seq_ JD 55 Bacillus pseudomycoides EEM16144.1 s247 seq_ JD 56 Bacillus pumilus ABV62529.1 s250 seq_ JD 57 Bacillus pumilus EDW21137.1 s249 seq_ JD 58 Bacillus sp. EA 64404.1 s218 seq_ JD 59 Bacillus sp. EDL66148.1 s241 seq_ JD 60 Bacillus subtilis Q796C3.1 s284 seq_ JD 61 Bacillus subtilis AAB84441.1 s215 seq_ JD 62 Bacillus thuringiensis ABK86448.1 s984 seq_ JD 63 Bacillus thuringiensis E EM 21409.1 s957 seq_ JD 64 Bacillus thuringiensis EEM82653.1 s980 seq_ JD 65 Bacillus thuringiensis EEM52372.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen s961 seq_ JD 66 Bacillus thuringiensis EEM27851.1 s969 seq_ JD 67 Bacillus thuringiensis EEM40716.1 s959 seq_ JD 68 Bacillus thuringiensis EEM46814.1 s965 seq_ JD 69 Bacillus thuringiensis EEM94969.1 s202 seq_ JD 70 Bacillus weihenstephanensis ABY44436.1 s63 seq_ JD 71 Bacterium Ellin514 EEF57225.1 s72 seq_ JD 72 Bacterium Ellin514 EEF59508.1 s87 seq_ JD 73 Beijerinckia indica ACB96717.1 s69 seq_ JD 74 Blastopirellula marina EAQ81955.1 s543 seq_ JD 75 Blastopirellula marina EAQ78122.1 sl56 seq_ JD 76 Bradyrhizobium japonicum CAA60250.1 s938 seq_ JD 77 Acetobacter pasteurianus BAH98349.1 s3 seq_ JD 78 Bradyrhizobium sp. CAL79893.1 s201 seq_ JD 79 Brevibacillus brevis BAH44778.1 sl48 seq_ JD 80 Burkholderia ambifaria EDT05097.1 sl58 seq_ JD 81 Burkholderia ambifaria EDT37649.1 sl49 seq_ JD 82 Burkholderia ambifaria ACB68303.1 slOO seq_ JD 83 Burkholderia ambifaria EDT42454.1 sl46 seq_ JD 84 Burkholderia cenocepacia EAY66961.1 sl39 seq_ JD 85 Burkholderia cenocepacia ACA95661.1 sl47 seq_ JD 86 Burkholderia cenocepacia CA 57099.1 s95 seq_ JD 87 Burkholderia cenocepacia CAR56694.1 sl02 seq_ JD 88 Burkholderia dolosa EAY71311.1 s941 seq_ JD 89 Burkholderia glumae ACR32572.1 s945 seq_ JD 90 Burkholderia glumae ACR30752.1 sl32 seq_ JD 91 Burkholderia graminis EDT12320.1 sl04 seq_ JD 92 Burkholderia mallei ABM48844.1 sl40 seq_ JD 93 Burkholderia multivorans ABX19650.1 sll6 seq_ JD 94 Burkholderia multivorans ABX16859.1 s91 seq_ JD 95 Burkholderia oklahomensis 167567074 slll seq_ JD 96 Burkholderia phymatum ACC73258.1 sl27 seq_ JD 97 Burkholderia phytofirmans ACD21317.1 sl20 seq_ JD 98 Burkholderia pseudomallei EEC32728.1 sl37 seq_ JD 99 Burkholderia sp. EEA03553.1 sl44 seq_ JD 100 Burkholderia sp. ABB06563.1 s98 seq_ JD 101 Burkholderia sp. ABB10136.1 s944 seq_ JD 102 Burkholderia sp. CCGE1002 EFA54357.1 s89 seq_ JD 103 Burkholderia thailandensis 167840988 sll3 seq_ JD 104 Burkholderia thailandensis 167617352 sl54 seq_ JD 105 Burkholderia ubonensis 167589807 s93 seq_ JD 106 Burkholderia ubonensis 167584986 s96 seq_ JD 107 Burkholderia vietnamiensis AB056791.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen sl50 seq_ JD 108 Burkholderia xenovorans ABE35912.1 s54 seq_ JD 109 Candidatus Koribacter ABF40741.1 sl71 seq_ JD 110 Candidatus Kuenenia CAJ71215.1 s79 seq_ JD 111 Candidatus Solibacter ABJ82180.1 s99 seq_ JD 112 Candidatus Solibacter ABJ82254.1 s917 seq_ JD 113 Catenulispora acidiphila ACU75510.1 s65 seq_ JD 114 Chthoniobacter flavus EDY15838.1 s637 seq_ JD 115 Chthoniobacter flavus EDY22035.1 s38 seq_ JD 116 Crocosphaera watsonii EAM53094.1 sl86 seq_ JD 117 Cupriavidus taiwanensis CAQ72562.1 s32 seq_ JD 118 Cyanothece sp. ACB53858.1 s40 seq_ JD 119 Cyanothece sp. ACK71719.1 s30 seq_ JD 120 Cyanothece sp. EDY02410.1 s29 seq_ JD 121 Cyanothece sp. ACK66841.1 s47 seq_ JD 122 Cyanothece sp. EDX97382.1 s35 seq_ JD 123 Cyanothece sp. EAZ91809.1 s39 seq_ JD 124 Cyanothece sp. ACL45896.1 s925 seq_ JD 125 Cyanothece sp. PCC 8802 ACV02092.1 s64 seq_ JD 126 Desulfovibrio salexigens EEC62384.1 s74 seq_ JD 127 Dryopteris crassirhizoma BAG68223.1 s59 seq_ JD 128 Frankia alni CAJ61140.1 s48 seq_ JD 129 Frankia alni CAJ60090.1 s56 seq_ JD 130 Frankia sp. ABD10207.1 s60 seq_ JD 131 Frankia sp. ABW15063.1 s31 seq_ JD 132 Frankia sp. ABW14125.1 s948 seq_ JD 133 Frankia sp. Eullc EFA59873.1 s919 seq_ JD 134 Frankia sp. Eullc EFA59089.1 s628 seq_ JD 135 Gemmata obscuriglobus 168700710 s209 seq_ JD 136 Geobacillus sp. EED61885.1 s206 seq_ JD 137 Geobacillus sp. EDY05760.1 s964 seq_ JD 138 Geobacillus sp. Y412MC52 EEN95021.1 s993 seq_ JD 139 Geobacillus sp. Y412MC61 ACX79399.1 s205 seq_ JD 140 Geobacillus thermodenitrificans AB067242.1 sl5 seq_ JD 141 Geobacter bemidjiensis ACH40355.1 s8 seq_ JD 142 Geobacter lovleyi ACD95949.1 s62 seq_ JD 143 Geobacter metallireducens ABB30662.1 sl2 seq_ JD 144 Geobacter metallireducens ABB33038.1 s73 seq_ JD 145 Geobacter sp. ACM21577.1 slO seq_ JD 146 Geobacter sp. EDV72707.1

Sil seq_ JD 147 Geobacter sp. ACM22003.1 s913 seq_ JD 148 Geobacter sp. M18 EET34621.1 s914 seq_ JD 149 Geobacter sp. M21 ACT16952.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen s58 seq_ JD 150 Geobacter sulfurreducens AA 36453.1 s7 seq_ JD 151 Geobacter sulfurreducens AAR34018.1 s9 seq_ JD 152 Geobacter uraniireducens ABQ25226.1 s46 seq_ JD 153 Gloeobacter violaceus BAC91998.1 s67 seq_ JD 154 Gluconacetobacter diazotrophicus ACI51585.1 sl65 seq_ JD 155 Gluconacetobacter diazotrophicus CAP55563.1 s68 seq_ JD 156 Gluconobacter oxydans AAW61994.1 s80 seq_ JD 157 Granulibacter bethesdensis ABI63005.1 s937 seq_ JD 158 Hyphomicrobium denitrificans EET65847.1 s932 seq_ JD 159 Leptospirillum ferrodiazotrophum EES53667.1 s24 seq_ JD 160 Leptospirillum rubarum EAY57382.1 s25 seq_ JD 161 Leptospirillum sp. EDZ38599.1 sl74 seq_ JD 162 Magnaporthe grisea EDK02551.1 sl53 seq_ JD 163 Magnetospirillum magnetotacticum 46203107 s49 seq_ JD 164 Methylacidiphilum infernorum ACD82457.1 sl69 seq_ JD 165 Methylobacterium chloromethanicum ACK83067.1 s75 seq_ JD 166 Methylobacterium chloromethanicum ACK86232.1 s946 seq_ JD 167 Methylobacterium extorquens CAX24364.1 sl41 seq_ JD 168 Methylobacterium nodulans ACL61886.1 sl52 seq_ JD 169 Methylobacterium populi ACB79998.1 sl62 seq_ JD 170 Methylobacterium radiotolerans ACB27373.1 sl80 seq_ JD 171 Methylobacterium sp. ACA20611.1 sl75 seq_ JD 172 Methylocella silvestris ACK52150.1 sl81 seq_ JD 173 Methylococcus capsulatus CAA71098.1 s55 seq_ JD 174 Microcystis aeruginosa CA086472.1 slOl seq_ JD 175 Neosartorya fischeri EAW20752.1 sl29 seq_ JD 176 Nitrobacter hamburgensis ABE63461.1 sl61 seq_ JD 177 Nitrobacter sp. EAQ34404.1 sl60 seq_ JD 178 Nitrobacter winogradskyi ABA05523.1 sl57 seq_ JD 179 Nitrococcus mobilis EAR22397.1 sl64 seq_ JD 180 Nitrosococcus oceani ABA57818.1 sl70 seq_ JD 181 Nitrosomonas europaea CAD85079.1 sl73 seq_ JD 182 Nitrosomonas eutropha ABI59752.1 s943 seq_ JD 183 Nitrosomonas sp. AL212 EET32702.1 sl42 seq_ JD 184 Nitrosospira multiformis ABB75845.1 s52 seq_ JD 185 Nostoc punctiforme ACC84529.1 s45 seq_ JD 186 Nostoc sp. BAB72732.1 sl22 seq_ JD 187 Oligotropha carboxidovorans ACI93782.1 s233 seq_ JD 188 Paenibacillus sp. EDS49994.1 s991 seq_ JD 189 Paenibacillus sp. JDR-2 ACS99948.1 s950 seq_ JD 190 Paenibacillus sp. oral taxon 786 EES74793.1

S1280 seq_ JD 191 Paramecium tetraurelia 145542269 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen s71 seq_ JD 192 Pelobacter carbinolicus ABA87701.1 s5 seq_ JD 193 Pelobacter carbinolicus ABA87615.1 s66 seq_ JD 194 Pelobacter propionicus ABK98395.1 sl6 seq_ JD 195 Pelobacter propionicus ABK98811.1 sl36 seq_ JD 196 Penicillium chrysogenum CAP99707.1 s936 seq_ JD 197 Planctomyces limnophilus EE067214.1

S1158 seq_ JD 198 Planctomyces limnophilus EE068341.1 s526 seq_ JD 199 Planctomyces maris EDL58855.1 s992 seq_ JD 200 Polypodiodes niponica BAI48071.1 s942 seq_ JD 201 Polypodiodes niponica BAI48070.1

S1202 seq_ JD 202 Populus trichocarpa EEF12098.1 sl68 seq_ JD 203 Ralstonia eutropha AAZ64302.1 sl90 seq_ JD 204 Ralstonia eutropha CAJ96989.1 s81 seq_ JD 205 Ralstonia metallidurans ABF11015.1 sllO seq_ JD 206 Ralstonia metallidurans ABF11268.1 sl23 seq_ JD 207 Rhizobium sp. P55348.1 s657 seq_ JD 208 Rhodopirellula baltica CAD74517.1 s4 seq_ JD 209 Rhodopseudomonas palustris ABJ08391.1 sl30 seq_ JD 210 Rhodopseudomonas palustris CAA71101.1 sl55 seq_ JD 211 Rhodopseudomonas palustris ABD06434.1 s97 seq_ JD 212 Rhodopseudomonas palustris ABD87279.1 sl35 seq_ JD 213 Rhodopseudomonas palustris ACF02757.1 s84 seq_ JD 214 Rhodospirillum rubrum ABC20867.1

S1279 seq_ JD 215 Rubrobacter xylanophilus ABG05671.1 s915 seq_ JD 216 Saccharomonospora viridis ACU97316.1 s42 seq_ JD 217 Saccharopolyspora erythraea CAM03596.1 s82 seq_ JD 218 Schizosaccharomyces japonicus EEB08219.1 s923 seq_ JD 219 Sphaerobacter thermophilus ACZ39437.1 s924 seq_ JD 220 Streptomyces albus 239983547 s23 seq_ JD 221 Streptomyces avermitilis BAC69361.1 s44 seq_ JD 222 Acaryochloris marina ABW29816.1 s921 seq_ JD 223 Streptomyces filamentosus 239945642 s934 seq_ JD 224 Streptomyces flavogriseus EEW70811.1 s920 seq_ JD 225 Streptomyces ghanaensis 239927462 s922 seq_ JD 226 Streptomyces griseoflavus 256812310 s28 seq_ JD 227 Streptomyces griseus BAG17791.1 s926 seq_ JD 228 Streptomyces hygroscopicus 256775136 s916 seq_ JD 229 Streptomyces lividans 256783789 s33 seq_ JD 230 Streptomyces peucetius ACA52082.1 s27 seq_ JD 231 Streptomyces pristinaespiralis EDY61772.1 s933 seq_ JD 232 Streptomyces scabiei CBG68454.1 s37 seq_ JD 233 Streptomyces sp. EDX25760.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen s34 seq_ JD 234 Streptomyces sp. EDY46371.1 s931 seq_ JD 235 Streptomyces sp. AA4 256668250 s918 seq_ JD 236 Streptomyces sp. C 256770952 s929 seq_ JD 237 Streptomyces sp. Mgl 254385931 s928 seq_ JD 238 Streptomyces sp. SPB74 254379682 s930 seq_ JD 239 Streptomyces sp. SPB78 256680470 s26 seq_ JD 240 Streptomyces sviceus EDY55942.1 s927 seq_ JD 241 Streptomyces viridochromogenes 256805984 s61 seq_ JD 242 Synechococcus sp. EDX84551.1 s935 seq_ JD 243 Synechococcus sp. PCC 7335 254422098 s53 seq_ JD 244 Synechocystis sp. BAA17978.1 s22 seq_ JD 245 Syntrophobacter fumaroxidans ABK18414.1 s6 seq_ JD 246 Syntrophobacter fumaroxidans ABK17672.1 s912 seq_ JD 247 Teredinibacter turnerae AC 13362.1 s57 seq_ JD 248 Thermosynechococcus elongatus BAC09861.1 s43 seq_ JD 249 Trichodesmium erythraeum ABG50159.1

S1178 seq_ JD 250 Uncultured organism ACA58560.1

S1176 seq_ JD 251 Uncultured organism ABL07557.1

S1165 seq_ JD 252 Uncultured organism ACA58559.1

S1166 seq_ JD 253 Uncultured organism ACA58558.1

S1168 seq_ JD 254 Uncultured organism ABL07560.1

S1169 seq_ JD 255 Uncultured organism ABL07565.1

S1170 seq_ JD 256 Uncultured organism ABL07566.1

S1167 seq_ JD 257 Uncultured organism ACA58545.1

S1171 seq_ JD 258 Uncultured organism ACA58535.1

S1180 seq_ JD 259 Uncultured organism ACA58549.1

S1179 seq_ JD 260 Uncultured organism ACA58554.1

S1181 seq_ JD 261 Uncultured organism ACA58555.1

S1182 seq_ JD 262 Uncultured organism ACA58556.1

S1235 seq_ JD 263 Uncultured organism ACA58530.1

S1188 seq_ JD 264 Uncultured organism ACA58534.1

S1237 seq_ JD 265 Uncultured organism ACA58552.1

S1223 seq_ JD 266 Uncultured organism ABL07558.1

S1200 seq_ JD 267 Uncultured organism ABL07542.1

S1236 seq_ JD 268 Uncultured organism ACA58539.1

S1238 seq_ JD 269 Uncultured organism ACA58537.1

S1233 seq_ JD 270 Uncultured organism ACA58543.1

S1173 seq_ JD 271 Uncultured organism ABL07553.1

S1241 seq_ JD 272 Uncultured organism ABL07540.1

S1242 seq_ JD 273 Uncultured organism ABL07544.1

S1225 seq_ JD 274 Uncultured organism ACA58557.1

S1183 seq_ JD 275 Uncultured organism ACA58520.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen

S1197 seq_ JD 276 Uncultured organism ACA58524.1

S1185 seq_ JD 277 Uncultured organism ACA58522.1

S1190 seq_ JD 278 Uncultured organism ACA58525.1

S1187 seq_ JD 279 Uncultured organism ACA58523.1

S1184 seq_ JD 280 Uncultured organism ACA58521.1

S1204 seq_ JD 281 Uncultured organism ACA58547.1

S1221 seq_ JD 282 Uncultured organism ACA58544.1

S1198 seq_ JD 283 Uncultured organism ACA58546.1

S1226 seq_ JD 284 Uncultured organism ACA58527.1

S1227 seq_ JD 285 Uncultured organism ABL07537.1

S1232 seq_ JD 286 Uncultured organism ACA58510.1

S1230 seq_ JD 287 Uncultured organism ACA58538.1

S1229 seq_ JD 288 Uncultured organism ACA58542.1

S1231 seq_ JD 289 Uncultured organism ACA58540.1

S1207 seq_ JD 290 Uncultured organism ABL07564.1

S1212 seq_ JD 291 Uncultured organism ABL07563.1

S1208 seq_ JD 292 Uncultured organism ABL07562.1

S1209 seq_ JD 293 Uncultured organism ABL07559.1

S1214 seq_ JD 294 Uncultured organism ABL07556.1

S1216 seq_ JD 295 Uncultured organism ACA58528.1

S1219 seq_ JD 296 Uncultured organism ACA58536.1

S1192 seq_ JD 297 Uncultured organism ABL07533.1

S1195 seq_ JD 298 Uncultured organism ABL07536.1

S1174 seq_ JD 299 Uncultured organism ABL07545.1

S1186 seq_ JD 300 Uncultured organism ABL07548.1

S1196 seq_ JD 301 Uncultured organism ACA58561.1

S1172 seq_ JD 302 Uncultured organism ABL07555.1

S1194 seq_ JD 303 Uncultured organism ABL07541.1

S1211 seq_ JD 304 Uncultured organism ABL07554.1

S1220 seq_ JD 305 Uncultured organism ABL07547.1

S1203 seq_ JD 306 Uncultured organism ABL07550.1

S1199 seq_ JD 307 Uncultured organism ABL07551.1

S1228 seq_ JD 308 Uncultured organism ACA58509.1

S1201 seq_ JD 309 Uncultured organism ACA58514.1

S1205 seq_ JD 310 Uncultured organism ABL07543.1

S1206 seq_ JD 311 Uncultured organism ABL07534.1

S1177 seq_ JD 312 Uncultured organism ABL07546.1

S1210 seq_ JD 313 Uncultured organism ABL07535.1

S1175 seq_ JD 314 Uncultured organism ABL07552.1

S1191 seq_ JD 315 Uncultured organism ABL07549.1

S1222 seq_ JD 316 Uncultured organism ACA58553.1

S1244 seq_ JD 317 Uncultured organism ABL07539.1 S_ID DB SEQ ID NO Organism Gl-Nr. der Referenz Sequenzen

S1213 seq_ JD 318 Uncultured organism ACA58532.1

S1239 seq_ JD 319 Uncultured organism ACA58548.1

S1215 seq_ JD 320 Uncultured organism ABL07561.1

S1240 seq_ JD 321 Uncultured organism ACA58533.1

S1234 seq_ JD 322 Uncultured organism ABL07538.1

S1224 seq_ JD 323 Uncultured organism ACA58541.1

S1217 seq_ JD 324 Uncultured organism ACA58529.1

s596 seq_ JD 325 Verrucomicrobium spinosum 171910093

s70 seq_ JD 326 Acidiphilium cryptum ABQ30890.1

SEQ ID NO:2 ist die Aminosäuresequenz der Zyklase die hierin auch als Zm-SHC-1 bezeichnet wird. 2. Weitere erfindungsgemäße Proteine/Enzymmutanten

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die hierin konkret offenbarten Proteine mit Zyklase- Aktivität beschränkt, sondern erstreckt sich vielmehr auch auf funktionale Äquivalente davon.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Enzyme, insbesondere von SEQ ID NO: 2 bis 6, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Po- lypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, wie insbesondere Zyclase- Aktivität, besitzen.

So versteht man beispielsweise unter„funktionalen Äquivalenten" Enzyme und Mutanten, die in einem verwendeten Test auf „Zyclasee-Aktivität" im Sinne der Erfindung (d.h. mit einem Referenzsubstrat unter Standardbedingungen) eine um mindestens 1 %, insbesondere um min- destens etwa 5 bis 10 % wie z.B. mindestens 10% oder mindestens 20 %, wie z.B. mindestens 50 % oder 75% oder 90 % höhere oder niedrigere Aktivität eines Enzyms, umfassend eine hierin konkret definierte Aminosäuresequenz (insbesondere SEQ ID NO: 2 bis 6) aufweisen.

Die Aktivitätsangaben für funktionale Äquivalente beziehen sich hierin, wenn nichts anderes angegeben ist, auf Aktivitätsbestimmungen, durchgeführt mittels eines Referenzsubstrates unter Standardbedingungen, wie hierin definiert.

Die „Zyklase-Aktivität" im Sinne der Erfindung kann mit Hilfe verschiedener bekannter Tests nachgewiesen werden. Ohne darauf beschränkt zu sein, sei ein Test unter Verwendung eines Referenzsubstrates, wie z. B. Homofarnesylsäure, unter Standardbedingungen, wie oben beschrieben und im experimentellen Teil erläutert, zu nennen.

Funktionale Äquivalente sind außerdem z.B. zwischen pH 4 bis 1 1 stabil und besitzen vorteilhaft ein pH-Optimum in einem Bereich von pH 5 bis 10, wie insbesondere 6,5 bis 9,5 oder 7 bis 8 oder etwa bei 7,5, sowie ein Temperaturoptimum im Bereich von 15°C bis 80°C oder 20°C bis 70°C, wie z.B. etwa 30 bis 60°C oder etwa 35 bis 45°C, wie etwa bei 40°C.

Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch „Mutanten", welche abgeleitet sind von SEQ ID NO:2 bis 326, insbesondere von SEQ ID NO: 2 bis 6, und in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen.

„Funktionale Äquivalente" umfassen die durch eine oder mehrere, wie z.B. 1 bis 50, 2 bis 30, 2 bis 15, 4 bis 12 oder 5 bis 10 Mutationen, wie Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, - Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid quali- tativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

Nichtlimitierende Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind in folgender Tabelle zusammengefasst:

Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gin; His

Asp Glu

Cys Ser

Gin Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn ; Gin

lle Leu; Val

Leu lle; Val

Lys Arg ; Gin ; Glu

Met Leu ; lle

Phe Met ; Leu ; Tyr

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr

Tyr Trp ; Phe

Val lle; Leu

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide. „Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne der gewünschten biologischen Aktivität.

Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxal- säure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammo- niak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche eine der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C- terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitierende Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Histidin-Anker oder Enzyme.

Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97,98 oder 99%, Homologie (bzw. Identität) zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen, berechnet nach dem Algo- rithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448. Eine prozentuale Homologie bzw. Identität eines erfindungsgemäßen homologen Polypeptids bedeutet insbesondere prozentuale Identität der Aminosäurereste bezogen auf die Gesamtlänge einer der hierin konkret beschriebenen Aminosäuresequenzen. Die prozentualen Identitätswerte können auch anhand von BLAST Alignments, Algorithmus blastp (protein-protein BLAST), oder durch Anwendung der unten angegebenen Clustal Einstellungen ermittelt werden.

Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße„funktionale Äquivalente" Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung oder Verkürzung des Proteins.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nuklein- säureebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA- Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degene- rierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 1 1 :477).

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese erfindungsgemäßer Homologer erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Ex- pressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Scree- ningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:781 1 -7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).

3. Nukleinsäuren und Konstrukte

3.1 Nukleinsäuren Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen, die für ein wie oben beschriebenes Enzym mit Cyclase-Aktivität kodieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren mit einem bestimmten Identitätsgrad zu den hierin beschriebenen konkreten Sequenzen.

Unter„Identität" zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151 -1 ) unter Einstellung folgender Parame- ter berechnet wird:

Multiple alignment parameters:

Gap opening penalty 10

Gap extension penalty 10

Gap Separation penalty ränge 8

Gap Separation penalty off

% identity for alignment delay 40

Residue specific gaps off

Hydrophilic residue gap off

Transition weighting 0

Pairwise alignment parameter:

FAST algorithm on

K-tuple size 1

Gap penalty 3

Window size 5

Number of best diagonals 5

Alternativ dazu kann die Identität auch nach Chenna, Ramu, Sugawara, Hideaki, Koike, Tadashi, Lopez, Rodrigo, Gibson, Toby J, Higgins, Desmond G, Thompson, Julie D. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. (2003) Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500, gemäß Internetadresse: http://www.ebi.ac.Uk/Tools/clustalw/index.html# und mit den folgenden Parametern bestimmt werden: DNA Gap Open Penalty 15.0

DNA Gap Extension Penalty 6.66

DNA Matrix Identity

Protein Gap Open Penalty 10.0

Protein Gap Extension Penalty 0.2

Protein matrix Gönnet Protein/DNA ENDGAP -1

Protein/DNA GAPDIST 4

Alle hierin erwähnten Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA) sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen, wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896-897) erfol- gen. Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonie- rungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngi- ge DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalente, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukle- otidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, als auch Nukle- insäurefragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter„stringenten" Bedingungen (siehe unten) an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abge- trennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekom- binante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Stan- dard-Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungsson- de und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse cha- rakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können ferner durch Standard- Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen oder Derivate davon, Homologe oder Teile dieser Sequenzen, lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Bakterien, z.B. über genomische oder cDNA-Banken, isolieren. Die- se DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen.

Unter "hybridisieren" versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids an eine nahezu komplementäre Sequenz unter Standardbedingungen zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu können die Sequenzen zu 90-100% komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure (Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz) oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58 °C in einer wässrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42 °C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhaf- terweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20 °C bis 45 °C, bevorzugt zwischen etwa 30 °C bis 45 °C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30 °C bis 55 °C, bevorzugt zwischen etwa 45 °C bis 55 °C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztempera- turwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C- Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA- Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nuklein- säuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991 , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Die„Hybridisierung" kann insbesondere unter stringenten Bedingungen erfolgen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., in: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31 -9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 -6.3.6 beschrieben.

Unter„stringenten" Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden: Die Inkubation bei 42°C über Nacht in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium-citrat), 50 mM Natrium Phosphat (pH7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von ei- nem Waschschritt der Filter mit 0,1 x SSC bei 65°C.

Gegenstand der Erfindung sind auch Derivate der konkret offenbarten oder ableitbaren Nukleinsäuresequenzen.

So können weitere erfindungsgemäße, für Cyclase-Mutanten kodierende Nukleinsäuresequenzen z.B. von SEQ ID NO:1 oder von den kodierenden Sequenzen zu SEQ ID NO: 2 bis 326, insbesondere SEQ ID NO: 2 bis 6, durch eine F486 oder F486-analoge Mutation abgeleitet sein und sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide unterscheiden, aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil kodieren.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarian- ten, davon.

Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstitutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) erhältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleo- tidsequenz eines Gens.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen, für Zyklasen kodierende Nukleinsäuresequenzen abgeleitet von Sequenz SEQ ID NO: 1 oder von einer der kodierenden Sequenzen zu SEQ ID NO: 2 bis 326, insbesondere SEQ ID NO: 2 bis 6, sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 60 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 80 % Homologie, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % Homologie über den gesamten Sequenzbereich aufweisen (bezüglich Homologie auf Aminosäureebene sei auf obige Ausführungen zu den Polypeptiden verwiesen auf). Über Teilbereiche der Sequenzen kön- nen die Homologien vorteilhaft höher liegen.

Weiterhin sind unter Derivaten auch Homologe der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der kodierenden und nichtkodierenden DNA-Sequenz, zu verstehen.

Außerdem sind unter Derivaten beispielsweise Fusionen mit Promotoren zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch wenigstens einen Nukleotidaustausch, wenigstens eine Insertion, Inversion und/oder Deletion verändert sein, ohne dass aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des Weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen aus- getauscht werden.

3.2 Generierung funktionaler Mutanten

Dem Fachmann sind darüber hinaus Verfahren zur Erzeugung funktionaler Mutanten erfindungsgemäßer Enzyme bekannt.

Je nach verwendeter Technik kann der Fachmann völlig zufällige oder auch gezieltere

Mutationen in Gene oder auch nicht codierende Nukleinsäurebereiche (die beispielsweise für die Regulation der Expression wichtig sind) einbringen und anschließend Genbanken erstellen. Die dazu erforderlichen molekularbiologischen Methoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook und Russell, Molecular Cloning. 3. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 .

Methoden zur Veränderung von Genen und somit zur Veränderung der von diesen codierten Protein sind dem Fachmann seit langem geläufig, wie beispielsweise

- die ortsspezifische Mutagenese, bei der gezielt einzelne oder mehrere Nukleotide eines Gens ausgetauscht werden (Trower MK (Hrsg.) 1996; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey),

- die Sättigungsmutagenese, bei der an jeder beliebigen Stelle eines Gens ein Codon für eine beliebige Aminosäure ausgetauscht oder hinzugefügt werden kann (Kegler-Ebo DM, Docktor CM, DiMaio D (1994) Nucleic Acids Res 22:1593; Barettino D, Feigenbutz M, Valcärel R, Stun- nenberg HG (1994) Nucleic Acids Res 22:541 ; Barik S (1995) Mol Biotechnol 3:1 ), - die fehleranfällige Polymerase-Kettenreaktion (error-prone PCR), bei der Nukleotidsequenzen durch fehlerhaft arbeitende DNA-Polymerasen mutiert werden (Eckert KA, Kunkel TA (1990) Nucleic Acids Res 18:3739);

- die SeSaM-Methode (Sequence Saturation Method), bei der bevorzugte Austausche durch die Polymerase verhindert werden. Schenk et al., Biospektrum, Vol. 3, 2006, 277-279

- das Passagieren von Genen in Mutator-Stämmen, in denen beispielsweise aufgrund defekter DNA-Reperaturmechanismen eine erhöhte Mutationsrate von Nukleotidsequenzen auftritt (Greener A, Callahan M, Jerpseth B (1996) An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK (Hrsg.) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press, New Jersey), oder

- das DNA-Shuffling, bei dem ein Pool aus nahe verwandten Genen gebildet und verdaut wird und die Bruchstücke als Templates für eine Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden, bei der durch wiederholte Strangtrennung und Wiederannäherung letztendlich Mosaikgene voller Länge erzeugt werden (Stemmer WPC (1994) Nature 370:389; Stemmer WPC (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91 :10747).

Unter Anwendung der so genannten gerichteten Evolution („directed evolution"; beschrieben unter anderem in Reetz MT und Jaeger K-E (1999), Topics Curr Chem 200:31 ; Zhao H, Moore JC, Volkov AA, Arnold FH (1999), Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution, In: Demain AL, Davies JE (Hrsg.) Manual of industrial microbiology and biotechnolo- gy. American Society for Microbiology) kann der Fachmann auch in gezielter Weise und auch in großem Maßstab funktionale Mutanten erzeugen. Dabei werden in einem ersten Schritt zunächst Genbanken der jeweiligen Proteine erzeugt, wobei beispielsweise die oben angegebenen Methoden zur Anwendung kommen können. Die Genbanken werden auf geeignete Weise exprimiert, beispielsweise durch Bakterien oder durch Phagen-Display-Systeme.

Die betreffenden Gene von Wirtsorganismen, die funktionale Mutanten mit Eigenschaften exprimieren, welche den gewünschten Eigenschaften weitgehend entsprechen, können einer weiteren Mutationsrunde unterworfen werden. Die Schritte der Mutation und der Selektion oder des Screening können iterativ solange wiederholt werden, bis die vorliegenden funktionalen Mutanten die gewünschten Eigenschaften in ausreichendem Maße aufweisen. Durch diese ite- rative Arbeitsweise können stufenweise eine begrenzte Anzahl von Mutationen, wie z.B. 1 , 2, 3, 4 oder 5 Mutationen, vorgenommen und auf deren Einfluss auf die betreffende Enzymeigenschaft bewertet und selektiert werden. Die selektierte Mutante kann dann in gleicher Weise einem weiteren Mutationsschritt unterworfen werden. Dadurch lässt sich die Anzahl der zu untersuchenden Einzelmutanten signifikant verringern.

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse liefern auch wichtige Informationen in Bezug auf

Struktur und Sequenz der betreffenden Enzyme, die erforderlich sind, um gezielt weitere Enzyme mit gewünschten modifizierten Eigenschaften zu generieren. Insbesondere können sogenannte„hot spots" definiert werden, d.h. Sequenzabschnitte, die sich potentiell eignen, um über die Einführung gezielter Mutationen eine Enzymeigenschaft zu modifizieren. Ebenfalls sind Informationen ableitbar bezüglich Aminosäure-Sequenzpositionen, in deren Bereich Mutationen durchgeführt werden können, die voraussichtlich wenig Einfuß auf die Enzymaktivität haben sollten, und als potentielle„silent mutations bezeichnet werden können. 3.3 Konstrukte

Gegenstand der Erfindung sind außerdem, insbesondere rekombinante, Expressionskon- strukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie, insbesondere rekombinante, Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.

Unter einer„Expressionseinheit" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressionsaktivität verstanden, die einen Promotor, wie hierein definiert umfasst, und nach funktioneller Verknüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder einem Gen, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert. Man spricht deshalb auch in diesem Zusammenhang von einer„regulativen Nukleinsäuresequenz". Zusätzlich zum Promotor können weitere, regulative Elemente, wie z.B. Enhancer, enthalten sein.

Unter einer„Expressionskassette" oder„Expressionskonstrukt" wird erfindungsgemäß eine Expressionseinheit verstanden, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäure oder dem zu exprimierenden Gen funktionell verknüpft ist. Im Gegensatz zu einer Expressionseinheit um- fasst eine Expressionskassette somit nicht nur Nukleinsäuresequenzen, welche Transkription und Translation regulieren, sondern auch die Nukleinsäuresequenzen, welche als Folge der Transkription und Translation als Protein exprimiert werden sollen.

Die Begriffe "Expression" oder„Überexpression" beschreiben im Kontext der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in ei- nem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.

Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.

Unter einem„Promotor", einer„Nukleinsäure mit Promotoraktivität" oder einer„Promotor- sequenz" wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu transkribierenden Nukleinsäure die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.

Unter einer„funktionellen" oder„operativen" Verknüpfung versteht man in diesem Zusammenhang beispielsweise die sequentielle Anordnung einer der Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente, wie zum Beispiel Nukleinsäuresequenzen, die die Transkription von Nuk- leinsäuren gewährleisten, sowie zum Beispiel einen Terminator, derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäuresequenz hinter (d.h. am 3'-Ende) der Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kova- lent miteinander verbunden sind. Dabei kann der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, oder kleiner als 100 Basenpaare oder kleiner als 50 Basenpaare sein.

Neben Promotoren und Terminator sind als Beispiele weiterer regulativer Elemente zu nennen Targeting-Sequenzen, Enhancer, Polyadenylierungssignale, selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- logy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukte umfassen insbesondere eine für eine Zyklase kodierende Sequenz, z.B. SEQ ID NO: 1 oder kodierend für eine Zyklase gemäß SEQ ID NO: 2 bis 326 oder Derivate und Homologe davon, sowie die davon ableitbaren Nukleinsäuresequenzen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Steuerung, z.B. Erhöhung, der Genexpression operativ oder funktionell verknüpft wurden.

Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die kodierende Sequenz insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird.

Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhafterweise auch eine oder mehre- re der schon erwähnten "Enhancer" Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Beispiele geeigneter Regulationssequenzen sind in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacl^ T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP (rhaPßAD)SP6-, lambda-PR- oder im lambda-Pi_-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien An- wendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram- positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha , AC, P-60, CYC1 , GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafter- weise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z.B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repli- ziert oder chromosomal repliziert werden. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.

Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, plN-lll ³ -B1 , Agt1 1 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361 , in Bacillus pUB1 10, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB1 16, in Hefen 2alphaM, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHIac ⁺ , pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über hete- rologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "Codonnut- zung" zu verändern. Der "Codonnutzung" lässt sich anhand von Computerauswertungen ande- rer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klo- nierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusi- ons, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.

4. Mikroorganismen

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff „Mikroorganismus" der Wildtyp- Mikroorganismus oder ein genetisch veränderter, rekombinanter Mikroorganismus oder beides verstanden werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co- Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor La- boratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Orga- nismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen E- scherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium, Clostridium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüber hinaus in der Gruppe der alpha- Proteobacterien, beta-Proteobacterien oder gamma-Proteobacterien zu finden

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für ein Enzym mit Phenylethanol Dehydrogenase- Aktivität gemäß obiger Definition kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 °C und 100 °C, bevorzugt zwischen 10 °C bis 60 °C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann „batch"-weise, „semi batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden.

5. Rekombinante Herstellung von erfindungsgemäßen Enzymen

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung erfindungsgemäße Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repea- ted fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods für General Bacteriology" der American Society für Bac- teriology (Washington D. C, USA, 1981 ) enthalten.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spurenelemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearin- säure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniump- hosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder kom- plexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.

Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Ka- lium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen.

Als Schwefelquelle können anorganische schwefelhaltige Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikalium- hydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen beispielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindun- gen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und der- gleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1 ,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben wer- den.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht lässt sich während der Anzucht durch Zugabe von basische Ver- bindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B. Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuer- halten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C. Die Kultur wird so lange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.

Die Fermentationsbrühe wird anschließend weiterverarbeitet. Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmethoden, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Methoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Die Zellen können auch, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen werden. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von De- tergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purifi- cation, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Vorteilhaft kann es sein, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungieren- de sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, En- zymmarker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Pro- teine verwendet werden.

Für die Expression erfindungsgemäßer Mutanten kann auf die Beschreibung der Expression des Wildtypenzyms EbN1 und der dafür brauchbaren Expressionssysteme in der WO2005/108590 und der WO2006/094945, zurückgegriffen werden, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. 6. Enzymimmobilisierung

Die erfindungsgemäßen Enzyme können in den hierin beschriebenen Verfahren frei oder immobilisiert eingesetzt werden. Unter einem immobilisierten Enzym versteht man ein Enzym, das an einen inerten Träger fixiert ist. Geeignete Trägermaterialien sowie die darauf immobili- sierten Enzyme sind aus der EP-A-1 149849, EP-A-1 069 183 und der DE-OS 100193773 sowie aus den darin zitierten Literaturstellen bekannt. Auf die Offenbarung dieser Schriften wird diesbezüglich in vollem Umfang Bezug genommen. Zu den geeigneten Trägermaterialien gehören beispielsweise Tone, Tonmineralien, wie Kaolinit, Diatomeenerde, Perlit, Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, Natriumcarbonat, Calciumcarbonat, Cellulosepulver, Anionenaustauschermaterialien, synthetische Polymere, wie Polystyrol, Acrylharze, Phenolformaldehydharze, Polyurethane und Polyolefine, wie Polyethylen und Polypropylen. Die Trägermaterialien werden zur Herstellung der geträgerten Enzyme üblicherweise in einer feinteiligen, partikelförmigen Form eingesetzt, wobei poröse Formen bevorzugt sind. Die Partikelgröße des Trägermaterials beträgt üblicherweise nicht mehr als 5 mm, insbesondere nicht mehr als 2 mm (Sieblinie). Analog kann bei Ein- satz der Dehydrogenase als Ganzzell-Katalysator eine freie oder immobiliserte Form gewählt werden. Trägermaterialien sind z.B. Ca-Alginat, und Carrageenan. Enzyme wie auch Zellen können auch direkt mit Glutaraldehyd vernetzt werden (Cross-Iinking zu CLEAs). Entsprechende und weitere Immobilisierungsverfahren sind beispielsweise in J. Lalonde und A. Margolin „Immobilization of Enzymes" " in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Syn- thesis 2002, Vol. III, 991 -1032, Wiley-VCH, Weinheim beschrieben. Weitere Informationen zu Biotransformationen und Bioreaktoren zur Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren findet man z.B. auch in Rehm et al (Ed) Biotechology, 2nd Edn, Vol 3, Chapter 17, VCH, Weinheim.

7. Enzymatische Cyclisierung von mehrfach ungesättigten Carbonsäuren

7.1 Allgemein

Insbesondere wird das erfindungsgemäße Cyclisierungsverfahren in Gegenwart eines Enzyms durchgeführt, wobei das Enzym von einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:1 oder einem funktionalen Äquivalent davon kodiert wird, wobei die Nukleinsäuresequenz Bestandteil eines Genkonstrukts oder Vektors ist. Solche Genkonstrukte oder Vektoren werden ausführlich in der internationalen Anmeldung PCT/EP2010/057696 auf den Seiten 16 bis 20 beschrieben, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Die Wirtszelle, die ein Genkonstrukt oder einen Vektor enthält, worin die Nukleinsäuresequenz enthalten ist, die das Enzym mit der gewünschten Aktivität kodiert, bezeichnet man auch als transgenen Organismus. Die Herstellung solche transgenen Organismen ist prinzipiell be- kannt und wird beispielsweise in internationalen Anmeldung PCT/EP2010/057696 auf Seite 20 diskutiert, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird.

Als transgene Organismen werden bevorzugt Zellen aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Cyanobakterien, Pilzen und Hefen ausgewählt. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Pilzen der Gattung Pichia oder Bakterien der Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralsto- nia, Clostridium, Pseudomonas, Bacillus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholde- ria, Lactobacillus oder Lactococcus. Besonders bevorzugt ist die Zelle ausgewählt aus Bakterien der Spezies Escherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor oder Zymomonas mobilis.

Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass das En- zym mit der Aktivität einer Homofarnesylsaäure-Cyclase von einem Gen kodiert wird, das aus einem Mikroorganismus isoliert wurde, ausgewählt unter Zymomonas mobilis, Methylococcus capsulatus, Rhodopseudomonas palustris, Bradyrhizobium japonicum, Frankia spec, Streptomyces coelicolor sowie Acetobacter pasteurianus. Besonders zu nennen sind die betreffenden Gene aus Zymomonas mobilis, Streptomyces coelicolor, Bradyrhizobium japonicum und Acetobacter pasteurianus isoliert.

Weiterhin bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym mit der Cyclase-Aktivität von einem Mikroorganismus generiert wurde, der das Enzym überproduziert und der ausgewählt wurde aus der Gruppe der Mikroorganismen bestehend aus den Gattungen Escherichia, Corynebacterium, Ralstonia, Clostridium, Pseudomonas, Bacil- lus, Zymomonas, Rhodobacter, Streptomyces, Burkholderia, Lactobacillus und Lactococcus.

Besonders zu erwähnen ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet dass das Enzym mit der Cyclase-Aktivität von transgenen Mikroorganismen der Spezies E- scherichia coli, Pseudomonas putida, Burkholderia glumae, Corynebacterium glutamicum, Sac- charomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Bacil- lus subtilis oder Zymomonas mobilis erzeugt wurde, welche das Enzym mit der Cyclase- Aktivität überproduzieren.

Weitere Ausgestaltungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen biokatalytischen Cyclisierungsverfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in we- nigstens einer der folgenden Formen vorliegt: a) freies, gegebenenfalls gereinigtes oder teilweise gereinigtes Polypeptid;

b) immobilisiertes Polypeptid;

c) aus Zellen isoliertes Polypeptid gemäß a) oder b);

d) ganze Zelle, gegebenenfalls ruhende oder wachsende Zellen, enthaltend mindestens ein solches Polypeptid;

e) Lysat oder Homogenisat der Zellen gemäß d).

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekenn- zeichnet, dass die Zellen Mikroorganismen sind, bevorzugt transgene Mikroorganismen expri- mierend mindestens ein heterologes Nukleinsäuremolekül kodierend für ein Polypeptid mit der Cyclase-Aktivität.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst wenigsten die folgenden Schritte a), b) und d): a) einen ein Enzym mit Zyklase-Aktivität produzierenden Mikroorganismus aus einer natürlichen Quelle zu isolieren oder rekombinant herzustellen,

b) diesen Mikroorganismus zu vermehren,

c) aus dem Mikroorganismus das Enzym mit Zyklase-Aktivität gegebenenfalls zu isolieren oder eine dieses Enzym enthaltende Proteinfraktion herzustellen, und

d) den Mikroorganismus gemäß Stufe b) oder das Enzym gemäß Stufe c) in ein Medium zu überführen, das Substrat, z.B. Homofarnesylsäure der allgemeinen Formel (la), enthält.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Substrat mit dem Enzym, das die Aktivität ei- ner Zyklase besitzt, in einem Medium in Kontakt gebracht und/oder so inkubiert, dass eine Umsetzung des Substrats, wie z.B. von Homofarnesylsäure, zu Sclareolid in Gegenwart des Enzyms erfolgt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Medium um ein wässriges Reaktionsmedium.

Der pH-Wert des wässrigen Reaktionsmediums, in dem das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt durchgeführt wird, wird dabei vorteilhaft zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwi- sehen pH 4,5 und 9, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und 8 gehalten.

Bei den wässrigen Reaktionsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH-Wert von vorzugsweise von 5 bis 8, aufweisen. Als Puffer kann ein Citrat-, Phosphat-, TRIS- (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) oder MES-Puffer (2-(N- Morpholino)ethansulfonsäure) verwendet werden. Ferner kann das Reaktionsmedium noch wei- tere Zusätze enthalten, wie z.B. Detergentien (beispielsweise Taurodeoxycholat).

Das Substrat, wie z.B. Homofarnesylsäure, wird vorzugsweise in einer Konzentration von 2 - 200mM, besonders bevorzugt von 5 - 25mM in die enzymatische Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.

Die enzymatische Cyclisierung erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unter- halb der Desaktivierungstemperatur des eingesetzten Enzyms und oberhalb von -10°C. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C und 95°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur zwischen 15°C und 60°C, insbesondere zwischen 20 und 40°C, z.B. bei etwa 25 bis 30 °C durchgeführt.

Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Reaktion von Ho- mofarnesylsäure zu Sclareolid bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40 °C und/oder einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 8 erfolgt.

Neben diesen einphasigen wässrigen Systemen werden in einer weiteren Variante der Erfindung auch zweiphasige Systeme eingesetzt. Dabei werden neben einer wässrigen Phase als zweite Phase, organische, nicht-wasser-mischbare Reaktionsmedien verwendet. Dadurch ak- kumulieren die Reaktionsprodukte in der organischen Phase. Nach der Reaktion ist das Produkt in der organische Phase leicht von der wässrigen Phase, die den Biokatalysator enthält, abtrennbar.

Bevorzug ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung von Homofarnesylsäure in einphasigen wässrigen Systemen oder in zweiphasigen Systemen, oder die Umsetzung von schwerlöslichen Homofarnesylsäuresalzen in zweiphasigen Wässrig/festen Systemen erfolgt.

Das Reaktionsprodukt kann mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden und gegebenenfalls zur Aufreinigung destilliert werden.

Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Cyclooctan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, die Xylole, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol, aliphatische acyclische und cyclische Ether oder Alkohole, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Isopropanol, Diethylether, Me- thyl-tert-butylether, Ethyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetrahyd- rofuran oder Ester wie Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Besonders bevorzugt werden die vorgenannten Heptan, Methyl- tert-butylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Ethylacetat verwendet.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Zyklasen können im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym, wie oben bereits beschrieben, verwendet werden.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können ruhende oder wachsende, freie oder immobilisierte Zellen verwendet werden, die für die Zyklase kodierenden Nukleinsäuren, Nukleinsäu- rekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch aufgeschlossene Zellen, wie Zelllysate oder Zell- homogenate, können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung beispielsweise mit Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebro- chen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder teilweise gereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden.

Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt, beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.

7.2 Bevorzugte Umsetzung von Homofarnesylsäure zu Sclareolid

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Sclareolid, bei dem a) Homo-'farnesyhsäure mit der Homofarnesol-Ambroxan-Zyklase in Kontakt gebracht und/oder inkubiert wird, und

b) Sclareolid isoliert wird. In einer Ausführung der Erfindung wird Homo-'farnesyhsäure mit der Zyklase in einem Medium in Kontakt gebracht und/oder so inkubiert, dass eine Umsetzung von Homo-'farnesyhsäure zu Sclareolid in Gegenwart der Zyklase erfolgt. Bevorzugt handelt es sich bei dem Medium um ein wässriges Reaktionsmedium. Bei den wässrigen Reaktionsmedien handelt es sich vorzugsweise um gepufferte Lösungen, die in der Regel einen pH-Wert von vorzugsweise von 5 bis 8, aufweisen. Als Puffer kann ein Citrat-, Phosphat-, TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure)- Puffer verwendet werden. Ferner kann das Reaktionsmedium noch weitere Zusätze enthalten, wie z.B. Detergentien (beispielsweise Taurodeoxycholat).

Das Substrat wird vorzugsweise in einer Konzentration von 5 - 100mM, besonders bevorzugt von 15 - 25mM in die enzymatische Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden.

Die enzymatische Zyklisierung erfolgt in der Regel bei einer Reaktionstemperatur unter- halb der Desaktivierungstemperatur der eingesetzten Zyklase und oberhalb von -10 °C. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 0 bis 100 °C, insbesondere von 15 bis 60 °C und speziell von 20 bis 40 °C, z.B. bei etwa 30 °C.

Das Reaktionsprodukt Sclareolid kann mit organischen Lösungsmitteln, ausgewählt aus der Gruppe der unten genannten, extrahiert werden und gegebenenfalls zur Aufreinigung destil- liert werden.

Neben diesen einphasigen wässrigen Systemen werden in einer weiteren Variante der Erfindung auch zweiphasige Systeme eingesetzt. Dabei werden ionische Flüssigkeiten als zweite Phase, bevorzugt aber organische, nicht-wasser-mischbare Reaktionsmedien als zweite Phase verwendet. Dadurch akkumulieren die Reaktionsprodukte in der organischen Phase. Nach der Reaktion ist Ambroxan in der organische Phase leicht von der wässrigen Phase, die den Biokatalysator enthält, abtrennbar.

Unter nicht-wässrigen Reaktionsmedien werden Reaktionsmedien verstanden, die weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,5 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht des flüssigen Reaktionsmediums, enthalten. Insbesondere kann die Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden.

Geeignete organische Lösungsmittel sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Pentan, Cyclopentan, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Octan oder Cyclooctan, halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol, Toluol, die Xylole, Chlorbenzol oder Dichlorbenzol, aliphatische acyclische und cyclische Ether oder Alkohole, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Isopropanol, Diethylether, Me- thyl-tert-butylether, Ethyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetra- hydrofuran oder Ester wie Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Besonders bevorzugt werden die vorgenannten Heptan, Methyl-ie/f-butylether, Diisopropylether, Tetrahydrofuran, Ethylacetat verwendet.

Die Umsetzung von Homo-'farnesyhsäure zu Sciareolid kann nicht nur in einphasigen wässrigen Systemen sondern auch in zweiphasigen Systemen stattfinden. Bei den zweiphasi- gen Systemen werden die oben genannten eingesetzt. Bevorzugt werden die oben genannten organische, nicht-wasser-mischbare Lösungsmittel als zweite Phase verwendet. Dadurch akkumulieren die Reaktionsprodukte in der organischen Phase. Nach der Reaktion ist Ambroxan in der organische Phase leicht von der wässrigen Phase, die den Biokatalysator enthält, abtrennbar.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur biokatalyti- schen Herstellung von Sciareolid, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein Polypeptid ist, welches kodiert wird von einem Nukleinsäuremolekül umfassend mindestens ein Nuklein- säuremolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, umfassend die in SEQ ID NO 2; b) Nukleinsäuremolekül, das zumindest ein Polynukleotid der Sequenz gezeigt in SEQ ID NO 1 umfasst;

c) Nukleinsäuremolekül, das ein Polypeptid kodiert, dessen Sequenz eine Identität von mindestens 45% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2 aufweist;

d) Nukleinsäuremolekül nach (a) bis (c), das für ein funktional äquivalentes Polypeptid oder ein Fragment der Sequenz gemäß SEQ ID NO 2 kodiert;

e) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, das man erhält in dem man ein Nukleinsäuremolekül aus einer cDNA Bank oder aus genomischer DNA mittels der Primer ge- mäß SEQ ID NO: Nr. 327 und 328 amplifiziert, oder das Nukleinsäuremolekül durch de novo Synthese chemisch synthetisiert;

f) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß (a) bis (c) hybridisiert;

g) Nukleinsäuremolekül kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, das aus einer DNA-Bank unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß (a) bis (c) oder deren Teilfragmente von mindestens 15 nt, vorzugsweise 20 nt, 30 nt, 50 nt, 100 nt, 200 nt oder 500 nt als Sonde unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden kann; und

h) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mit der Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, wobei die Sequenz des Polypeptids eine Identität von mindestens 30% zu den Sequenzen SEQ ID NO 2 aufweist;

i) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mitder Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, wobei das Polypeptid durch ein Nukleinsäu- remolekül ausgewählt aus der Gruppe der in a) bis h) j) Nukleinsäuremolekül, kodierend für ein funktional äquivalentes Polypeptid mitder Aktivität einer Homofarnesylsäure-Zyklase, wobei das Polypeptid eine analoge oder ähnliche Bindungsstelle aufweist, wie ein Polypeptid kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe der in a) bis h) beschriebenen.

Eine analoge oder ähnliche Bindungsstelle im Sinne der Erfindung ist eine konservierte Domäne oder Motiv der Aminosäurensequenz mit einer Homologie von 80%, besonders bevorzugt 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% oder 100%, welche die Bindung desselben Substrats, insbesondere Homo-'farnesyhsäure gewährleistet.

Bevorzugt weist das Nukleinsäuremolekül c) eine Identität mit der SEQ ID NO:1 von 15mindestens 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf.

Ebenso weisen ein funktional äquivalentes Polypeptid eine Identität mit der SEQ ID NO: 2 von mindestens 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, besonders bevorzugt 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, insbesondere 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf. Anstelle des Begriffs "Identität" kann auch der Begriff "homolog" oder "Homologie" gleichbedeutend verwendet werden. Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf folgende nichtlimitierende Beispiele näher beschrieben:

Experimenteller Teil

Sofern keine speziellen Angaben in den folgenden Beispielen gemacht werden, gelten die folgenden allgemeinen Angaben.

A. Allgemeine Angaben

Sämtliche eingesetzte Materialien und Mikroorganismen sind im Handel erhältliche Produkte.

Soweit nicht anderes angegeben wird, erfolgt die Klonierung und Expression von rekom- binanten Proteinen nach Standardmethoden, wie z.B. in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Mania- tis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

B. Beispiele

Beispiel 1 Klonierung der Zm-SHC und Expression in E. coli Mit den Oligonukleotiden Zm-SHC_fw und Zm-SHC_rev kann das Gen der Zyklase aus Zymomonas mobiiis amplifiziert werden.

Je 100 ng der Primer Zm-SHC_fw und Zm-SHC_rev wurden equimolar gemischt. Die

PCR mit genomischer DNA aus Z mobiiis (ATCC31821 ) wurde nach Herstellerangaben mit Pwo- Polymerase (Roche Applied Science) und dem folgenden Temperatur-Gradienten- Programmdurchgeführt: 95°C für 3 min; 30 Zyklen mit 95°C für 30 sec, 50°C für 30 sec, und 72°C für 3 min; 72°C für 10 min.; 4°C bis zur Verwendung. Das PCR-Produkt (-2.2 kB) wurde durch Agarosegel-Elektrophorese (1 ,2%E-Gel, Invitrogen) und Säulen-Chromatographie (GFX- Kit, Amersham Pharmacia) isoliert und anschließend sequenziert (Sequenzierprimer: Zm- SHC_fw und Zm-SHC_rev). Die erhaltene Sequenz entspricht der publizierten Sequenz.

Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsendonukleasen Nde\ und BamYW verdaut und in entsprechend verdauten /?DHE19.2-Vektor[9] ligiert. Die Sequenzierung der resultieren- den Plasmide ergab die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleinsäuresequenz. Die Korrespondierende Aminosäuresequenz ist im Folgenden dargestellt /(SEQ ID NO:2):

Met Gly Ile Asp Arg Met Asn Ser Leu Ser Arg Leu Leu Met Lys Lys

1 5 10 15

Ile Phe Gly Ala Glu Lys Thr Ser Tyr Lys Pro Ala Ser Asp Thr Ile

20 25 30

Ile Gly Thr Asp Thr Leu Lys Arg Pro Asn Arg Arg Pro Glu Pro Thr

35 40 45

Ala Lys Val Asp Lys Thr Ile Phe Lys Thr Met Gly Asn Ser Leu Asn

50 55 60

Asn Thr Leu Val Ser Ala Cys Asp Trp Leu Ile Gly Gin Gin Lys Pro

65 70 75 80

Asp Gly His Trp Val Gly Ala Val Glu Ser Asn Ala Ser Met Glu Ala

85 90 95

Glu Trp Cys Leu Ala Leu Trp Phe Leu Gly Leu Glu Asp His Pro Leu

100 105 110

Arg Pro Arg Leu Gly Asn Ala Leu Leu Glu Met Gin Arg Glu Asp Gly

115 120 125 Ser Trp Gly Val Tyr Phe Gly Ala Gly Asn Gly Asp Ile Asn Ala Thr 130 135 140

Val Glu Ala Tyr Ala Ala Leu Arg Ser Leu Gly Tyr Ser Ala Asp Asn 145 150 155 160

Pro Val Leu Lys Lys Ala Ala Ala Trp Ile Ala Glu Lys Gly Gly Leu

165 170 175

Lys Asn Ile Arg Val Phe Thr Arg Tyr Trp Leu Ala Leu Ile Gly Glu

180 185 190

Trp Pro Trp Glu Lys Thr Pro Asn Leu Pro Pro Glu Ile Ile Trp Phe

195 200 205

Pro Asp Asn Phe Val Phe Ser Ile Tyr Asn Phe Ala Gin Trp Ala Arg 210 215 220

Ala Thr Met Val Pro Ile Ala Ile Leu Ser Ala Arg Arg Pro Ser Arg

225 230 235 240

Pro Leu Arg Pro Gin Asp Arg Leu Asp Glu Leu Phe Pro Glu Gly Arg

245 250 255

Ala Arg Phe Asp Tyr Glu Leu Pro Lys Lys Glu Gly Ile Asp Leu Trp

260 265 270

Ser Gin Phe Phe Arg Thr Thr Asp Arg Gly Leu His Trp Val Gin Ser

275 280 285

Asn Leu Leu Lys Arg Asn Ser Leu Arg Glu Ala Ala Ile Arg His Val 290 295 300

Leu Glu Trp Ile Ile Arg His Gin Asp Ala Asp Gly Gly Trp Gly Gly 305 310 315 320

Ile Gin Pro Pro Trp Val Tyr Gly Leu Met Ala Leu His Gly Glu Gly

325 330 335

Tyr Gin Leu Tyr His Pro Val Met Ala Lys Ala Leu Ser Ala Leu Asp

340 345 350

Asp Pro Gly Trp Arg His Asp Arg Gly Glu Ser Ser Trp Ile Gin Ala

355 360 365

Thr Asn Ser Pro Val Trp Asp Thr Met Leu Ala Leu Met Ala Leu Lys 370 375 380

Asp Ala Lys Ala Glu Asp Arg Phe Thr Pro Glu Met Asp Lys Ala Ala 385 390 395 400

Asp Trp Leu Leu Ala Arg Gin Val Lys Val Lys Gly Asp Trp Ser Ile

405 410 415

Lys Leu Pro Asp Val Glu Pro Gly Gly Trp Ala Phe Glu Tyr Ala Asn

420 425 430

Asp Arg Tyr Pro Asp Thr Asp Asp Thr Ala Val Ala Leu Ile Ala Leu

435 440 445

Ser Ser Tyr Arg Asp Lys Glu Glu Trp Gin Lys Lys Gly Val Glu Asp 450 455 460

Ala Ile Thr Arg Gly Val Asn Trp Leu Ile Ala Met Gin Ser Glu Cys 465 470 475 480 Gly Gly Trp Gly Ala Phe Asp Lys Asp Asn Asn Arg Ser Ile Leu Ser

485 490 495

Lys Ile Pro Phe Cys Asp Phe Gly Glu Ser Ile Asp Pro Pro Ser Val

500 505 510

Asp Val Thr Ala His Val Leu Glu Ala Phe Gly Thr Leu Gly Leu Ser

515 520 525

Arg Asp Met Pro Val Ile Gin Lys Ala Ile Asp Tyr Val Arg Ser Glu

530 535 540

Gin Glu Ala Glu Gly Ala Trp Phe Gly Arg Trp Gly Val Asn Tyr Ile

545 550 555 560

Tyr Gly Thr Gly Ala Val Leu Pro Ala Leu Ala Ala Ile Gly Glu Asp

565 570 575

Met Thr Gin Pro Tyr Ile Thr Lys Ala Cys Asp Trp Leu Val Ala His

580 585 590

Gin Gin Glu Asp Gly Gly Trp Gly Glu Ser Cys Ser Ser Tyr Met Glu

595 600 605

Ile Asp Ser Ile Gly Lys Gly Pro Thr Thr Pro Ser Gin Thr Ala Trp

610 615 620

Ala Leu Met Gly Leu Ile Ala Ala Asn Arg Pro Glu Asp Tyr Glu Ala

625 630 635 640

Ile Ala Lys Gly Cys His Tyr Leu Ile Asp Arg Gin Glu Gin Asp Gly

645 650 655

Ser Trp Lys Glu Glu Glu Phe Thr Gly Thr Gly Phe Pro Gly Tyr Gly

660 665 670

Val Gly Gin Thr Ile Lys Leu Asp Asp Pro Ala Leu Ser Lys Arg Leu

675 680 685

Leu Gin Gly Ala Glu Leu Ser Arg Ala Phe Met Leu Arg Tyr Asp Phe

690 695 700

Tyr Arg Gin Phe Phe Pro Ile Met Ala Leu Ser Arg Ala Glu Arg Leu

705 710 715 720

Ile Asp Leu Asn Asn

725

Das Plasmid oDHE-Zm-SHC-1 wurde in den Stamm E. coli TG10 /?Agro4 /?HSG575 [Takeshita et al., Gene Sl, 61 :63-74; Tomoyasu et al., Mol Microbiol2W , 40:397-413] transformiert. Die rekombianten E. < >//erhalten die Bezeichnung E. < >// LU 15568.

Beispiel 2: Bereitstellung rekombinanter Homofarnesol-Zyklase aus Z. mobilis

Aus einer entsprechenden 2ml_ Vorkultur angeimpft, wurde E. < >// LU 15568 in 20ml_ LB- Amp/Spec/Cm (100pg/l Ampicillin; 10Opg/l Spectinomycin; 20^g/l Chloramphenicol), 0,1 mM I PTG, 0,5g/L Rhamnose in 100ml_ Erlenmeyerkolben (Schikanen) 16 h bei 37°C angezogen, bei 5000 ^* g/10min zentrifugiert und bei 4°C gelagert. Proteinextrakt wurde hergestellt indem das Zellpellet in 15ml_ Aufschlusspuffer (0,2M Tris/HCI, 0,5M EDTA, pH 8.0), 375U Benzonase (z.B. Novagen, 251Ι/μΙ-), 40μΙ_ PMSF (100mM, gelöst in ÄPropOH), 0,8g Saccharose und ca. 0.5mg Lysozym suspendiert wurden. Den Ansatz wurde gemischt und 30min auf Eis inkubiert.

Anschließend wurde die Mischung bei -20°C eingefroren.

Nach dem Auftauen des Ansatzes wurden mit Aqua dest. auf ca. 40ml_ aufgefüllt und nochmals für 30min auf Eis inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen 3mal 3min mit Ultraschall aufgeschlossen (HTU-Soni 130, Fa. G. Heinemann, Schwäbisch-Hall, Amplitude 80%, 15" Puls / 15" Pause). Nach dem Aufschluss wurden die Zelltrümmer in 60min bei 4°C und 26900 ^* g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 100ml_ Solubilisationspuffer (50mM Tris/HCI, 10mM MgCI2x6H20, 1 % Triton X-100, pH 8.0) resuspendiert und ca. 5min gepottert. Anschließend wurde die Suspension für 30min auf Eis gehalten.

Der homogenisierte Extrakt wurde erneut für 1 h bei 4°C und 26900 zentrifugiert und das Pellet verworfen. Der Extrakt wurde für die Enzymtests eingesetzt und kann mehrere Wochen ohne Aktivitätsverlust bei -20°C gelagert werden. Der Proteingehalt liegt im Bereich von 1 mg/mL.

Beispiel 3: Aktivitätsbestimmung der rekombinanten Zyklase aus £ ^" . co//LU15568

Mit der in Beispiel 2 beschriebenen Proteinpräparation wurde Homofarnesylsäure (1 b,

(3-r,7 )-4,8,12-trimethyltrideca-3,7,1 1 -triensäure)) inkubiert. Im Einzelnen wurden 0,0412g Homofarnesylsäure abgewogen (20mM im Ansatz; Reinheit 85,1 % bestehend aus ZZ0,44%, E,Z 10,13%, EE 74,93%), 2,913ml_ Wasser, 0,350ml_ Natriumeitrat Puffer (1 M Natriumeitrat pH 5,4), 0,560ml_ MgCI ₂ (0,5M Lösung) dazu pipettiert und unter Rühren bei 37°C 30Min tempe- riert. Die Reaktion wurde mit Zugabe von auf 37°C temperiertem Homogenat aus E. coli LU 15568 (Proteingehalt 35mg/ml) gestartet. Der Reaktionsansatz wurde 24h bei pH 5,0 und 37°C bei max. Rührgeschwindigkeit auf einem Magnetrührer im Ölbad gerührt. pH Ausgleich während der Reaktion erfolgte mit 0,5M HCl. Nach einer 24 stündigen Inkubation wurden 0,500ml_ aus dem Ansatz mit 1 ,000ml_ /7-Heptan / /7-Propanol 3:2 30 Sekunden mittels Vortexen extrahiert. Der organische Überstand nach Phasentrennung wurde für die GC Analyse eingesetzt (vgl. Figur 1 )

Mit der in unten näher beschriebenenAnalytik konnte ein Umsatz von 74,5% gesamt bzw. 82,7% aus dem E,E Isomer festgestellt werden.

Der Umsatz von Homofarnesylsäure (1 b) zu Sclareolid (3) lässt sich mit folgendem GC-System bestimmen:

Säule: 10m Optima 1

Temperaturprofil: 0 min: 100°C

5°C/min auf 200°C

Nach 5 min:30°C/min auf 320°C

danach konstant

Methodendauer: 30 min

Injektortemperatur: 280°C

Retentionszeiten (RT):

Homofarnesylsäure: Peak 1 bei 1 1 ,7 min, Peak 2 bei 12,1 min ;

Sclareolid: ca. 13,5 min

Mit authentischem Material (Sigma-, Kat. No.: 358002) wurde eine Eichreihe erstellt, anhand derer die Konzentration unbekannter Proben bestimmt wurde.

Auf die Offenbarung der hierin zitierten Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.

Sequenzen:

SEQ ID NO: 1 - 326 Nukleinsäure/Aminosäuresequenzen verschiedener SHC Gene

SEQ ID NO: 327-328 PCR Primer

Es folgt eine Auflistung erfindungsgemäß besonders brauchbarer SHC-Enzymsequenzen: Enzymsequenzen

>seq_ID 4

MNMASRFSLKKILRSGSDTQGTNVNTLIQSGTSDIVRQKPAPQEPADLSALKAMGNS LTHTLS- SACEWLMKQQKPDGHVWGSVGSNASMEAEWCLALWFLGLEDHPLRPRLGKAL- LEMQRPDGSWGTYYGAGSGDINATVESYAALRSLGYAEDDPAVSKAAA- WIISKGGLKNVRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWARATMM - PLAILSARRPSRPLRPQDRLDALFPGGRANFDYELPTKEGRDVIADFFRLADKGLHWLQS S- FLKRAPSREAAIKYVLEWIIWHQDADGGWGGIQPPVWYGLMALHGEGYQFHHPVMAKAL- DALNDPGWRHDKGDASWIQATNSPVWDTMLSLMALHDANAEERFTPEMDKALD- WLLSRQVRVKGDWSVKLPNTEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIAIASCRNRPEWQAKG - VEEAIGRGVRWLVAMQSSCGGWGAFDKDNNKSILAKIPFCDFGEALDPPSVDVTAHVLEA F- GLLGLPRDLPCIQRGLAYIRKEQDPTGPWFGRWGVNYLYGTGAVLPALAALGEDMTQPYI S- KACDWLINCQQENGGWGESCASYMEVSSIGHGATTPSQTAWALMGLIAANRPQDYEAI- AKGCRYLIDLQEEDGSWNEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLDDPAISKRLMQGAELSRAF- MLRYDLYRQLFPIIALSRASRLIKLGN

>seq_ID 2

MGIDRMNSLSRLLMKKIFGAEKTSYKPASDTIIGTDTLKRPNRRPEPTAKVDKTI-

FKTMGNSLNNTLVSACDWLIGQQKPDGHVWGAVESNASMEAEWCLALWFLGLEDH- PLRPRLGNALLEMQREDGSWGVYFGAGNGDINATVEAYAALRSLGYSADNPVLKKAAA- WIAEKGGLKNIRVFTRYWLALIGEWPWEKTPNLPPEIIWFPDNFVFSIYNFAQWA- RATMVPIAILSARRPSRPLRPQDRLDELFPEGRARFDYELPKKEGIDLWSQFFRTT- DRGLHWVQSNLLKRNSLREAAIRHVLEWIIRHQDADGGWGGIQPPVWYGLMALH-

GEGYQLYHPVMAKALSALDDPGWRHDRGESSWIQATNSPVWDTMLALMALKDAKAED RFT- PEMDKAADWLLARQVKVKGDWSIKLPDVEPGGWAFEYANDRYPDTDDTAVALIALSSYRD - KEEWQKKGVEDAITRGVNWLIAMQSECGGWGAFDKDNNRSILSKIPFCDFGESI- DPPSVDVTAHVLEAFGTLGLSRDMPVIQKAI DYVRSEQEAEGAWFGRWGVNYIYGTGAVLPA- LAAIGEDMTQPYITKACDWLVAHQQEDGGWGESCSSYMEIDSIGKGPTTPSQTAWALM- GLIAANRPEDYEAIAKGCHYLIDRQEQDGSWKEEEFTGTGFPGYGVGQTIKLD- DPALSKRLLQGAELSRAFMLRYDFYRQFFPIMALSRAERLIDLNN

>seq_ID 5 MTVTSSASARATRDPGNYQTALQSTVRAAADWLI-

ANQKPDGHWVGRAESNACMEAQWCLALWFMGLEDHPLRKRLGQSLLDSQRPD- GAWQVYFGAPNGDINATVEAYAALRSLGFRDDEPAVRRAREWIEAKGGLRNIRVFTRYWL A- LIGEWPWEKTPNIPPEVIWFPLWFPFSIYNFAQWARATLMPIAVLSARRPSRPLPPEN- RLDALFPHGRKAFDYELPVKAGAGGWDRFFRGADKVLHKLQNLGNRLNLGLFRPAATSRV - LEWMIRHQDFDGAWGGIQPPWIYGLMALYAEGYPLNHPVLAKGLDALND- PGWRVDVGDATYIQATNSPVWDTILTLLAFDDAGVLGDYPEAVD- KAVDVWLQRQVRVPGDWSMKLPHVKPGGWAFEYANNYYPDTDDTAVALIAL- APLRHDPKWKAKGIDEAIQLGVDWLIGMQSQGGGWGAFDKDNNQKILTKIPFCDYGEALD - PPSVDVTAHIIEAFGKLGISRNHPSMVQALDYIRREQEPSGPWFGRWGVNYVYGTGAVLP A- LAAIG ED MTQPYIG RAC DWLVAHQQADGGWG ESCASYM DVSAVG RGTTTASQTAWAL- MALLAANRPQDKDAIERGCMWLVERQSAGTWDEPEFTGTGFPGYGVGQTIKLND- PALSQRLMQGPELSRAFMLRYGMYRHYFPLMALGRALRPQSHS >seq_ID 6

MTVSTSSAFHHSSLSDDVEPIIQKATRALLEKQHQDGHVWFELEADATIPAEYILLKHYL GE- PEDLEIEAKIGRYLRRIQGEHGGWSLFYGGDLDLSATVKAYFALKMIGDSPDAPHML- RARNEILARGGAMRANVFTRIQLALFGAMSWEHVPQMPVELMLMPEWFPVHINKMAYWAR T- VLVPLLVLQALKPVARNRRGILVDELFVPDVLPTLQESGDPIWRRFFSALDKVLHK- VEPYWPKNMRAKAIHSCVHFVTERLNGEDGLGAIYPAIANSVMMYDALGYPENHPERAIA R- RAVEKLMVLDGTEDQGDKEVYCQPCLSPIWDTALVAHAMLEVGGDEAEKSAISALS- WLKPQQILDVKGDWAWRRPDLRPGGWAFQYRNDYYPDVDDTAWTMAM- DRAAKLSDLHDDFEESKARAMEWTIGMQSDNGGWGAFDANNSYTYLNNIPFADHGALLD- PPTVDVSARCVSMMAQAGISITDPKMKAAVDYLLKEQEEDGSWFGRWGVNYIYGTWSAL- CALNVAALPHDHLAIQKAVAWLKNIQNEDGGWGENCDSYALDYSGYEPMDSTASQTAWAL L- GLMAVGEANSEAVTKGINWLAQNQDEEGLWKEDYYSGGGFPRVFYLRYHGYSKYFPL- WALARYRNLKKANQPIVHYGM