Titel

Kombinierte Zellspezifische Markierung und Anreicherung von Biomarkern

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern, sowie auf ein Steuergerät, eingerichtet die Schritte des Verfahrens auszuführen und/oder anzusteuern, nach Gattung der unabhängigen Ansprüche. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Computerprogramm.

Stand der Technik

Unter einem Biomarker wird ein messbares biologisches Merkmal verstanden mit prognostischer oder diagnostischer Aussagekraft. In der molekularen Diagnostik können Erkrankungen auf Basis von Nukleinsäure-Biomarkern nachgewiesen und entsprechende Therapien eingeleitet werden. Diese Biomarker können Desoxyribonukleinsäure- (DNA) oder Ribonukleinsäure- (RNA) Biomarker sein.

Dabei ist die Abfrage von gezielten, multiplen Biomarkern von hohem Wert und wird beispielsweise in der Infektionsdiagnostik, bei der beispielsweise simultan verschiedene Spezies oder in der Tumordiagnostik, bei der simultan verschiedene Mutationsstellen im Genom abgefragt werden, eingesetzt.

Die Zahl dieser so genannten Biomarker-Targets variiert je nach Assay von wenigen Dutzend bis zu mehreren Zehntausenden. Ziel dabei ist immer eine spezifische Anreicherung dieser Biomarker-Targets gegenüber dem nicht informativen, in der Regel aber hochkonzentrierten Hintergrund, um das Auslesen der Biomarker-Targets einfacher und robuster zu gestalten, beispielsweise mittels quantitativer Echtzeit- Polymerase Kettenreaktion (real-time quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR), der Digitalen Polymerase- Kettenreaktion (Digital Droplet Polymerase Chain Reaction, ddPCR) oder Parallelsequenzierung (Next-Generation-Sequencing, NGS). Für die Anreicherung von Nukleinsäuren werden hauptsächlich zwei grundlegend verschiedene Prinzipien verfolgt - zum einen eine Multiplex-PCR mit spezifischen Primern bzw. Primerpaaren und zum anderen eine hybridisierungsbasierte, positive Selektion mit spezifischen Sonden. Jedoch ist diesen Anreicherungsverfahren gemeinsam, dass sie etliche, aufeinanderfolgende Prozessschritte beinhalten und mehrere Stunden bis zu einem Tag dauern können. Dies macht sie für den Einsatz am Point-of-Care in einer Lab-on-Chip- Umgebung ungeeignet. Zudem werden als Ausgangsmaterial mehrere Nanogramm der Nukleinsäuren benötigt, was beispielsweise bei Probenmaterial mit niedrigem Eintrag (low- input) eine zusätzliche Voramplifikation erfordert (Genomamplifikation, engl. Whole Genome Amplification, WGA und/oder Amplifikation des Ganztranskriptoms, engl. Whole Transcriptome Amplification, WTA), die wiederum zusätzliche Prozessschritte und Zeit kosten.

In zahlreichen Disziplinen der Biologie, wie beispielsweise der Immunologie, Neurobiologie, Onkologie- oder Stammzell- und Entwicklungsbiologie, ist man daran interessiert, möglichst viele (mehrere Hunderttausend bis Millionen) kernhaltige Zellen einer heterogenen Zellpopulation in möglichst kurzer Zeit (Stunden bis wenige Tage) auf Einzelzell-Ebene zu analysieren. Eine Einzelzell-Analyse kann dabei entweder molekular beispielsweise auf DNA-, RNA-, und/oder Protein- Ebene sowie funktional in Form von beispielweise Zellkultivierungen oder/und Medikamententests erfolgen?

Es sind Tröpfchen-basierte, Mikrowannen-basierte oder Ventil-basierte mikrostrukturierte Substrate bekannt mit welchen Zellen räumlich isoliert werden können. Jedoch erfüllt keines dieser Systeme die Erfordernisse mit wenigen Prozessschritten eine hochparallelisierte Anreicherung von DNA- und/oder RNA-kodierten Biomarkern bei einer eindeutigen molekularen Markierung der Target- Amplifikate durchzuführen, um beispielsweise am Point- of-Care- Analysen durchführen zu können.

Offenbarung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein mikrofluidisches Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs bereitgestellt.

Eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben, ist in der noch nicht veröffentlichten, deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 mit Anmeldetag am 19.04.2022 und Prioritätstag am 20.04.2022 beschrieben. Der Inhalt dieser Anmeldung wird durch Bezugnahme auf diese Anmeldung in die Beschreibung eingeschlossen. Es sei angemerkt, dass zweifelsfrei erkennbar ist, dass die Merkmale dieser Anmeldung zur Lösung der der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden technischen Aufgabe beitragen.

Das Mikrofluidische Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment umfasst zumindest die Schritte a) - g).

In Schritt a) wird eine mikrofluidische Vorrichtung, wie sie in der noch nicht veröffentlichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 beschrieben ist, bereitgestellt. Diese weist zumindest ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit auf. Das Trägersubstrat weist zumindest eine Mikrokavität auf und weiterhin zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle, insbesondere eine kernhaltige Zelle, und/oder einen Primer-Partikel in der Mikrokavität zu fangen.

In diese mikrofluidische Vorrichtung können beispielsweise etwa 30.000, einzeln aktuierbare Mikrokavitäten bzw. Reaktionskompartimente pro Quadratzentimeter integriert sein. Diese Mikrokavitäten weisen beispielsweise eine quadratische Grundfläche auf und beispielsweise eine Kavitäten breite von etwa 50 pm. Die Mikrokavitäten sind beispielsweise in einer regulären Matrix angeordnet. Die Mikrokavitäten können einzelne Zellen und/oder Partikel einfangen oder abstoßen. Es können kontrolliert einzelne Zellen in eine Mikrokavität sedimentieren. Zudem können beispielsweise irrelevante Zellen aus den Mikrokavitäten entfernt werden, wohingegen relevante Zellen festgehalten werden können, indem mittels eines elektrischen Felds ein Dielektrophorese- Käfig (D EP- Käfig) in der Mikrokavität erzeugt wird, der in Abhängigkeit von der Stromstärke beispielsweise geöffnet, geschlossen oder abgeschaltet werden kann.

Die DEP-Käfige können beispielsweise durch aktive Bauelemente, beispielsweise als Transistoren oder Speicherelemente realisiert werden. Diese sind innerhalb einzelner Elektroden in Complementary Metal-Oxide-Semiconductor-Technologie (CMOS- Technologie) integriert.

In Schritt b) wird die zumindest eine Mikrokavität der mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Zelle, insbesondere einer kernhaltigen Zelle, beladen und die Zelle in der Mikrokavität gefangen. Hierzu wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung geschlossen. Sich außerhalb des DEP-Käfigs befindliche weitere Zellen können diesen nicht länger betreten, während die Zelle innerhalb des DEP-Käfigs stabil gefangen ist. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass sich innerhalb der Mikrokavität nur eine einzige Zelle befindet.

In Schritt c) wird die zumindest einen Mikrokavität der mikrofluidischen Vorrichtung mit einem Primer- Partikel (engl. Primer-Bead) beladen und der Primer-Partikel in der Mikrokavität gefangen. Der Primer-Partikel umfasst beispielsweise zumindest eine an diesen gekoppelte Primerpopulation. Sobald der Primer-Partikel in die mit der Zelle befüllte Mikrokavität sedimentiert ist, wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung geschlossen. Sich außerhalb des DEP-Käfigs befindliche weitere Primer-Partikel können diesen nicht länger betreten, während die Zelle und der Primer-Partikel innerhalb des DEP-Käfigs stabil gefangen sind. Auf diese Weise ist sichergestellt, dass sich innerhalb der Mikrokavität nur ein einziger Primer-Partikel befindet.

Die Schritte b), c) und d) können auch in einer beliebig vertauschten Reihenfolge ablaufen, insbesondere können die Schritte b) und c) in umgekehrter Reihenfolge ablaufen.

In Schritt d) wird eine Amplifikationsmischung in die zumindest eine Mikrokavität eingebracht. Hierzu diffundieren die sich in der Amplifikationsmischung befindlichen Bestandteile in die zumindest eine Mikrokavität.

Die Amplifikationsmischung umfasst einen für ihre Bestandteile kompatiblen Puffer, eine Polymerase, insbesondere eine SD- Polymerase, wie beispielsweise Bst, Bst2.0, Bst3.0, EquiPhi, Phi29, Vent exo- und/oder andere. Desweiteren umfasst die Amplifikationsmischung optional eine reverse Transkriptase (RT), bspw. RTx, SSIV und/oder andere. Außerdem umfasst die Amplifikationsmischung Desoxyribonukleosid-Triphosphate (dNTPs) und/oder Analoge derer. Die dNTPs können zusätzlich modifiziert sein. Zudem kann die Amplifikationsmischung auch Bestandteile beinhalten, die die Amplifikationsreaktion und/oder eine Zelllyse und/oder eine Primer- Freisetzung beispielsweise positiv beeinflussen. Solche Bestandteile sind beispielsweise Additive wie Polyethylenglycol (PEG), Dithiothreitol (DTT), Detergenzen oder auch Enzyme wie Restriktionsenzyme oder Einzelstrangbruchinduzierende Enzyme (engl. Nicking Enzmyes).

In Schritt e) wird die Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität durch eine nicht-wässrige Phase, insbesondere durch eine Ölphase oder Luft, verdrängt, sodass die Mikrokavität im Bereich ihrer Öffnung durch die nicht-wässrige Phase geschlossen ist und somit ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt. Umfasst die mikrofluidische Vorrichtung mehrere Mikrokavitäten, so stellen alle Mikrokavitäten voneinander isolierte und geschlossene Reaktionskompartimente dar, in welchen je eine Zelle und ein Primer-Partikel mit der Amplifikationsmischung eingeschlossen sind.

In Schritt f) werden Bedingungen herbeigeführt, welche zu einer Lyse der Zelle und zu einer Freisetzung der Primer von dem Primer-Partikel führen. Solche Bedingungen werden beispielsweise durch eine Erhöhung der Temperatur, beispielsweise auf über 70°C für beispielsweise mehr als eine Minute und/oder durch Elektroporation und/oder durch Ultraschall erzeugt und/oder durch andere dieser Reaktion förderlicher Bedingungen oder Reagenzien, die beispielsweise mittels der Amplifikationsmischung eingebracht wurden.

In Schritt g) bindet die zumindest eine Primerpopulation an Biomarker- Regionen der DNA und/oder RNA, welche bei der Zelllyse aus der Zelle freigesetzt wurden, sodass eine Amplifikation der Biomarker-Targetregion erfolgt und das Biomarker-Targetamplifikat zellspezifisch markiert ist.

Für die Amplifikation werden DNA-Doppelstränge und/oder Sekundär- und/oder Tertiärstrukturen der RNA denaturiert, sodass die DNA und/oder RNA als Einzelstränge vorliegen, beispielsweise mittels geeigneter Temperaturen. In einem weiteren Schritt lagern sich die Primer an die DNA und/oder RNA an, wodurch eine Amplifikation der entsprechenden DNA und/oder RNA initiiert wird.

Vorteilhaft hierbei ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren ein automatisiertes, Lab-on- Chip-taugliches Verfahren ist, mit dem DNA- und/oder RNA-kodierte Biomarker hoch parallelisiert angereichert werden können und das Biomarker-Targetamplifikat eindeutig via molekularem Zellbarcode seiner ursprünglichen Zelle zugeordnet werden kann. Die Biomarker-Targetamplifikate sind so für nachgeschaltete Nachweisverfahren, wie beispielsweise für NGS-Analysen, innerhalb weniger Minuten bis Stunden verfügbar, wodurch das Verfahren für Analysen am Point-of- Care geeignet ist.

Hierfür ist keine weitere Ausstattung notwendig.

Ein großer Vorteil ist außerdem, dass nur wenige Prozessschritte benötigt werden. Es entfallen beispielsweise eine vorherige Voramplifikation/ WGA/ WTA oder vorheriges Zusammenführen (Pooling) mehrerer vorsortierter Einzelzellen. Dies führt zu einer deutlichen Reduzierung der benötigten Prozesszeit, Reagenzien, Kosten und Arbeitsschritte.

Das Verfahren gewährleistet eine eindeutige Markierung jeder einzelnen Zelle, und somit eine nahezu 100%-ige Paarungseffizienz, bei einer ebenfalls nahezu 100%-igen Beladungseffizienz. Das bedeutet, dass jede Mikrokavität genau mit einer Zelle und genau mit einem Primer-Partikel beladen werden kann. Zudem können mehrerer Prozessschritte nacheinander ablaufen, da die Mikrokavitäten mehrfach be- und entladbar sind.

Die gleichzeitige Anreicherung der relevanten DNA- und/oder RNA- Biomarker- Targetregionen kann bei einem Parallelisierungsgrad von beispielsweise 30.000 Mikrokavitäten je cm ² erfolgen.

Weiterhin vorteilhaft ist, dass das Probeneingabevolumen theoretisch unbegrenzt ist und verschiedene Proben eingegeben werden können, wie beispielsweise Blut oder Speichel. Zudem erlaubt es das Verfahren nur solche Zellen nachgeschaltet zu analysieren, die beispielsweise von Relevanz sind.

Desweiteren vorteilhaft ist, dass der in die Mikrokavität eingetretene Primer-Partikel zusammen mit der Zelle in der Mikrokavität gefangen ist und keine weiteren Zellen oder Primer- Partikel in die Mikrokavität eintreten können.

Weitere vorteilhafte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform sind an den Primer-Partikel verschiedene Populationen von Primern reversibel gekoppelt. Der Primer-Partikel umfasst beispielsweise ein Polystyrol, insbesondere in Form eines Polystyrol- Kügelchens. Die verschiedenen Primer-Populationen sind insbesondere Biomarker-spezifische vorwärts-gerichtete Primer (Specific Forward Primer, SFP), Biomarker-spezifische rückwärts-gerichtete Primer (Specific Reverse- Primer, SRP) und/oder randomisierte Primer (Random Primer, RP).

Die Kopplung der Primer-Populationen an den Primer-Partikel erfolgt beispielsweise über Basenpaarungen, die durch bestimmte Temperaturen gelöst werden können oder über spezifische Sequenzen oder sonstige chemische Modifikationen in der Basenzusammensetzung, die beispielsweise durch Enzyme oder Licht einer bestimmten Wellenlänge gelöst werden können. Dies kann beispielsweise eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym sein oder das Basenanalog dUTP für die Uracil-DNA Glycosylase (UDG).

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform umfassen die SFP und SRP je einen Selektionsmarker, gekoppelt an eine Universal-Sequenz, eine eindeutige Zellbarcode- Sequenz und entsprechend die Biomarker-Targetregionen flankierende spezifische Target- Sequenzen in forward- und reverse-Orientierung.

Dabei enthält jeder Primer-Partikel klonal eine eindeutige Zellbarcode-Sequenz (BCi- _n ) mit einer Länge von > 8 Basen. Der Selektionsmarker ist beispielsweise Biotin am 5‘-Ende des SFP bzw. SRP. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der Selektionsmarker an eine interne, beispielsweise modifizierte Base der Universal-Sequenz gekoppelt, wobei die Universal- Sequenz zum 5'-Ende hin um eine Einzelstrangbruch-Sequenz (Nicking site) verlängert ist, die einen Einzelstrangbruch über ein entsprechendes Nicking Enzym induziert.

Mittels des Selektionsmarkers ist eine spätere positive Selektion der Biomarker- Targetamplifikate möglich. Die Universal-Sequenz wird beispielsweise für eine spätere Amplifikation einer Sequenzier-Bibliothek oder einer bekannten Sequenz mit einer Funktion der Wahl, wie beispielsweise eine Restriktionsschnittstelle, insbesondere zur Freisetzung des Biomarker-Targetamplifikats beispielsweise von einem Fängermolekül, benötigt. Vorteilhaft ist zudem, dass aufgrund der Markierung der einzelnen Biomarker- Targetamp I if ikate mit einem Zellbarcode diese den einzelnen Zellen wieder eindeutig zugeordnet werden können. Weitere Analysen einer Vielzahl von Zellen, beispielsweise molekulargenetischer Art mittels NGS, bei denen relevante Biomarker den einzelnen Zellen zugeordnet werden können, beispielsweise aus vereinzelten Zellen von Gewebe- Biopsaten, kann von großem Nutzen beispielsweise in der Diagnostik und im Therapiemonitoring von Tumorpatienten sein.

Dadurch, dass die Zelle und der Primer-Partikel in der Mikrokavität gefangen sind und keine weiteren Zellen oder Primer-Partikel in die Mikrokavität eintreten können ist eine eindeutige Einzelzellmarkierung möglich, da jeder Primer-Partikel mit einem einzigartigen, molekularen Zellbarcode ausgestattet ist.

Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, für jede Biomarker- Targetregion mehrere, insbesondere 2-4, SFP und SRP mit unterschiedlichen, die Biomarker-Targetregion flankierenden spezifischen Forward- und Reverse-Targetsequenzen einzusetzen. Hierbei können diese beispielsweise auch in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt werden.

Vorteilhaft hierbei ist, dass beispielsweise mit zunehmender Anzahl der SFP bzw. SRP pro Biomarker-Targetregion neben der Amplifikationsrate auch die Chancen der Bindung der SFP bzw. SRP an die Targetregion steigen oder in einem weiteren Beispiel durch Konzentrationsanpassungen der SFP bzw. SRP einzelner, beispielsweise schwieriger zu amplifizierender Biomarker-Targetregionen eine gleichmäßigere Amplifikation im Vergleich zu anderen Biomarkertarget- Regionen erreicht wird.

Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn SFP und SRP weiterhin einen eindeutigen molekularen Identifikator (engl. unique molecular identifier, UMI) in Form einer randomisierten Sequenz aufweisen. Der UMI kann beispielsweise zwischen der Universal- Sequenz und der Zellbarcode-Sequenz oder zwischen der Zellbarcode-Sequenz und der Forward- bzw. Reverse-Targetsequenz lokalisiert sein. Der UMI hat insbesondere eine Länge von > 6 Basen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die Primer-Partikel so ausgeführt, dass die SFP und SRP bereits über den Selektionsmarker an die Primer-Partikel insbesondere reversibel gebunden sind. Im Fall einer reversiblen Verbindung sind die SFP und SRP beispielsweise über Antikörper, endständig chemische Modifikationen, wie beispielsweise eine Biotin- Kopplung. Weiterhin alternativ können die SFP und SRP auch über Aptamere, temperaturstabile Gruppen oder pH-sensitive Gruppen oder lichtspaltbare Gruppen wie beispielsweise o-Nitrobenzyl, reversibel an die Primer-Partikel gebunden sein.

Die Random Primer werden in dieser Ausführungsform mit der Amplifikationsmischung für die Amplifikation, insbesondere für eine ssMDA (nachfolgend beschrieben), zugeführt. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Target- Amplifikate direkt am Primer-Partikel hergestellt werden und mittels der DEP-Kräfte nach der Entfernung der nicht-wässrigen Phase festgehalten (gefangen) und direkt in der Mikrokavität aufgereinigt werden können. In dieser Ausführungsform sind somit keine Fängermoleküle notwendig, da die Amplifikation der Biomarker-Targetregion über die SFP und SRP angebunden an den Primer-Partikel erfolgt. Ein Selektionsmarker kann hier entfallen.

Ein weiterer Vorteil ist, dass die Biomarker-Targetamplifikate, immobilisiert an den im DEP- Käfig festgehaltenen Primer-Partikel, bei Bedarf in der Mikrokavität weiter prozessiert werden können, beispielsweise durch Zuführen weiterer Primer-Partikel oder durch Flüssigreagenzien.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Universal-Sequenz der SFP und SRP so gewählt, dass ein direkter Anknüpfungspunkt in Form einer spezifischen Sequenz für eine weitere Amplifikation eingeführt ist, insbesondere zur Fertigstellung einer Sequenzierbibliothek.

Vorteilhaft hierbei ist, dass eine zusätzliche Vervielfältigung bzw. Präparation der aufgereinigten Biomarker Target- Amplifikate mittels anderer Sequenziertechnologien, beispielsweise eines anderen Herstellers, ermöglicht wird.

Die dafür notwendige, asymmetrische Ausführung kann beispielsweise so realisiert werden, dass alle SFP eine erste Universal-Sequenz erhalten und alle SRP eine zweite Universalsequenz erhalten, welche sich von der ersten Universalsequenz unterscheidet. Auf diese Weise ist nur noch eine hochstandardisierte PCR, beispielsweise eine Index-PCR, nötig, bevor die Sequenzierbibliothek sequenziert werden kann. Durch einen flexiblen Einsatz der Universal-Sequenzen kann gewährleistet werden, dass das Verfahren entsprechend kompatibel mit nachgeschalteten, bevorzugt angewandten Analyseverfahren, wie beispielsweise verschiedene NGS-Technologien, für eine Einzelzellanalyse ist.

In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Amplifikationsmischung Zelllyse-unterstützend. Dies kann beispielsweise durch ein Reagenz erreicht werden, das die Zellen lysiert und Nukleinsäuren freisetzt, die anschließende Reaktion jedoch nicht hemmt bzw. sogar fördert, wie beispielsweise mit einem Detergenz oder durch eine Änderung der Osmolarität.

Vorteilhaft hierbei ist, dass keine einzelnen Prozessschritte für die Zelllyse und Mischung mit der Amplifikationsmischung notwendig sind und auch die jeweiligen Reagenzien bereits vorgemischt vorgelagert werden können. Dies führt zu einer Zeit-, Reagenzien- und Kostenersparnis. Des Weiteren werden durch die reduzierten Schritte Verdünnungseffekte sowie Verluste, die sich sonst durch mehrmaliges Überspülen ergäben, minimiert. Hieraus resultiert eine Steigerung der Effizienz.

In einer alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Zelllyse nach Einbringen der Amplifikationsmischung durch kurzzeitiges Erhitzen, beispielsweise auf >50 °C für >1 min. In einer weiterhin alternativen oder zusätzlichen Ausführungsform erfolgt die Zelllyse durch eine Erhöhung des Drucks innerhalb der Mikrokavitäten, beispielsweise durch Anlegen eines Überdrucks.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist die Amplifikation eine isothermale Amplifikation, insbesondere eine semi-specific Multiple Displacement Amplification (ssMDA). Diese Methode ist auch in der noch nicht veröffentlichten deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022211087.0 beschrieben.

Die ssMDA bietet die Option, simultan DNA und RNA aus geringsten Mengen sowohl gesamtgenomisch bzw. gesamttranskriptomisch anzureichern als auch einzelne Biomarkerrelevante Bereiche, also die Biomarker-Targetregionen, bevorzugt zu amplifizieren und anzureichern.

Dies wird dadurch erreicht, dass neben den Random Primern, beispielsweise RP6 mit der Sequenz NNNNNN oder RP9 mit der Sequenz NNNNNNNNN, wobei das N für eine der Basen A, C, T, oder G steht, bei der ssMDA auch für die Amplifikation der Biomarker- Targetregionen spezifische Forward-Primer und Reverse-Primer eingesetzt werden. Diese lagern sich bezüglich der Biomarker-Targetregion flankierend vorwärts-gerichtet (forward) bis zu 3 Kilobasen (kb) strangaufwärts (upstream) an die DNA bzw. RNA an und flankierend rückwärts-gerichtet (reverse) bis zu 3kb strangabwärts (downstream). Die SFP und SRP sind zusätzlich mit einem Selektionsmarker ausgestattet, beispielsweise Biotin. Eine nachgeschaltete Aufreinigung der Reaktion, beispielsweise mit einem passendem Fängermolekül wie zum Beispiel Streptavidin, erlaubt demnach eine direkte Anreicherung der spezifischen Biomarker Target- Amplifikate gegenüber dem parallel entstandenen Hintergrund-Amplifikat.

Besonders bevorzugt weisen die SFP und SRP bei der ssMDA eine Einzelstrangbruchschnittstelle auf. Diese Einzelstrangbruchschnittstelle stellt nach Erzeugung des Einzelstrangbruchs durch eine passend hinzugefügte Einzelstrangbruchinduzierende Endonuklease (engl. nicking enzyme) einen zusätzlichen Amplifikationsstartpunkt für eine Polymerase zur Verfügung. Hierdurch kann die Biomarker- Targetamplifikation an diesen Stellen ohne weitere Primer-Hybridisierungen fortgeführt werden, was die Prozessivität erhöht.

Bei der Amplifikation wird hierzu der Polymerase eine Einzelstrangbruch-induzierende Endonuklease beigefügt. Die Endonuklease ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Nt.Alwl, Nb.BbvCI, Nt.BbvCI, Nb.Bsml, Nt.BsmAI, Nt.BspQI, Nb.BsrDI, Nb.BssSI, Nt.BstNBI, Nb.BtsI und Nt.CviPII.

Die RP sind bei der ssMDA vorzugsweise Primer, die mindestens eine Modifikation aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus LNA (Locked Nucleic Acid), MGB (Minor Groove Binder), C-5 Propynyl-Desoxycytidin, C-5 Propynyl-Desoxyuridin, Aminoethyl-Phenoxazin-Desoxycytidin, 5-Methyl-Desoxycytidin, 2-Amino-Desoxyadenosin, Trimethoxystilben, Pyren und Spermin. ZNA-Primer (Zip Nucleic Acids) sind besonders bevorzugt. Hierbei handelt es sich um sperminmodifizierte Primer. Diese haben den Vorteil, dass sie mit einzelsträngigen Nukleinsäuren (DNA und/oder RNA) besonders temperaturstabile hybridisierte Nukleinsäuren ausbilden und dass höhere Hybridisierungstemperaturen verwendet werden können, ohne dass es zu einer Sequenzverlängerung der Primer kommen muss. Zudem reduzieren sie bei entsprechender Sperminbeladung der Primer die Selbsthybridisierung der Primer. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn die eingesetzten Primer kurz sind und die isothermale Amplifikation bei Temperaturen von mindestens 45°C durchgeführt wird.

Die ssMDA läuft isothermal beispielsweise bei Temperaturen zw. 40-72°C für beispielsweise mehr als 10 Minuten ab.

Für die ssMDA wird bevorzugt eine SD-Polymerase verwendet. Bei der SD-Polymerase kann es sich beispielsweise um eine Enzymmutante der DNA- Polymerase des Bacillus subtilis phage Phi29, insbesondere Equi Phi29, oder des Thermococcus litoralis, insbesondere Vent (exo-), handeln. Dabei besitzt die SD-Polymerase Vent (exo-) den Vorteil, dass sie bis zu Temperaturen von 100°C stabil und prozessiv ist. Deshalb kann sie bereits vor dem Denaturieren der DNA und/oder RNA zugesetzt werden, ohne durch die hohe Denaturierungstemperatur geschädigt werden. Allerdings weisen diese SD- Polymerasen keine RNA-Prozessivität auf.

Dabei ist die SD-Polymerase bevorzugt eine Enzymmutante der DNA-Polymerase des Bacillus stearothermophilus. Diese SD- Polymerasen weisen neben ihrer Prozessivität gegenüber DNA auch eine Prozessivität gegenüber RNA auf. Besonders bevorzugte Enzymmutanten der DNA-Polymerase des Bacillus stearothermophilus sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bst, Bst 2.0 und Bst 3.0. Unter diesen Enzymmutanten weist Bst 3.0 die höchste RNA-Prozessivität auf, weshalb Bst 3.0 ganz besonders bevorzugt ist.

Die SD-Polymerase ist eine DNA-Polymerase, die für isothermale Amplifikationsreaktionen geeignet und für eine hohe Strangverdrändungsaktivität in Amplifikations- Reaktionen bereits bekannt ist.

Die Verwendung der SD-Polymerase hat mehrere Vorteile. Sie ermöglicht eine isothermale Amplifikation. Außerdem tolerieren manche SD- Polymerasen hohe Temperaturen bei der isothermen Amplifikation, welche die Reaktionsgeschwindigkeit so weit erhöhen, dass eine deutliche Verkürzung der Reaktionsdauer möglich ist. Schließlich können manche SD- Polymerasen neben DNA auch RNA als Template zur Amplifikation nutzen.

Auch wenn die SD-Polymerase dazu in der Lage ist neben DNA auch RNA zu prozessieren ist es bevorzugt, dass bei der ssMDA zusätzlich mindestens eine reverse Transkriptase eingesetzt wird. Insbesondere handelt es sich hierbei um RTx oder SSIV. Prinzipiell sind aber alle reversen Transkriptasen denkbar, die unter ähnlichen Reaktionsbedingungen prozessieren, wie die eingesetzte SD-Polymerase. Hierdurch wird die Amplifikation von RNA gezielt unterstützt, sodass der erforderliche Amplifikationszeitraum noch weiter verkürzt werden kann. Wenn eine SD-Polymerase verwendet wird, die keine RNA-Prozessivität aufweist, dann ist die Verwendung einer reversen Transkriptase notwendig, um neben DNA auch RNA zu prozessieren.

Für die Amplifikation mittels ssMDA erfolgt eine Denaturierung der zu amplifizierenden DNA und/oder RNA, insbesondere durch Erhitzen auf eine geeignete Temperatur. Im Fall von thermophilen Polymerasen, beispielsweise der Vent (exo-) Polymerase, erfolgt die Denaturierung bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 75°C bis 98°C und ganz besonders bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von 80°C bis 95°C. Bevorzugt wird das Erhitzen für einen Zeitraum von mehr als 10 Sekunden durchgeführt, besonders bevorzugt für einen Zeitraum im Bereich von 30 Sekunden bis 120 Sekunden.

Im Fall von nicht-thermophilen SD-Polymerasen, wie beispielsweise der Bst3.0, werden bevorzugt Temperaturen von 65-85°C, und besonders bevorzugt Temperaturen von 72- 80°C, verwendet.

Die Primer zur Hybridisierung der einzelsträngigen DNA und/oder RNA, können bevorzugt bereits vor dem Denaturieren mit der DNA und/oder RNA zusammengebracht werden, besonders bevorzugt indem sie in der Amplifikationsmischung bereits gelöst sind. Die Hybridisierung der Primer an die DNA- und/oder RNA- Einzelstränge erfolgt dann vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 4°C bis 65°C während eines Zeitraums, der vorzugsweise mehr als 10 Sekunden beträgt.

Die ssMDA erfolgt vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur mit einem Wert im Bereich von 40°C bis 72°C. Ein bevorzugter Zeitraum der Amplifikation liegt im Bereich von 10 Minuten bis 120 Minuten. Je höher die Temperatur bei der Amplifikation ist, desto schneller läuft diese ab und desto geringer kann üblicherweise der Amplifikationszeitraum vorteilhaft gewählt werden.

Vorteilhaft bei der ssMDA ist, dass simultan DNA- und RNA-Biomarker automatisiert in demselben Reaktionskompartiment aus Einzelzellen amplifiziert und angereichert werden können, was eine enorme Verbesserung und Vereinfachung der Biomarker-Anreicherung darstellt, auch im Hinblick des aufzubringenden Aufwands, der Dauer der experimentellen Durchführung, der Anzahl der Arbeitsschritte und der damit verbundenen Kosten.

In einer zu der ssMDA alternativen Ausführungsform wird die Amplifikation mittels einer reversen Transkriptase-PCR durchgeführt. Hier werden beispielsweise nur ein SFP und SRP pro Biomarker-Targetregion eingesetzt. Die Amplifikationsmischung umfasst in dieser Ausführung beispielsweise eine Taq- Polymerase und eine reverse Transkriptase.

Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn zum Überführen einer Amplifikations- Reaktion aus der zumindest einen Mikrokavität und/oder zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen unterschiedlicher Mikrokavitäten, die nicht-wässrige Phase oberhalb der Mikrokavitäten, welche diese im Bereich ihrer Öffnung verschlossen hatte, verdrängt wird. Die Verdrängung kann beispielsweise mit Wasser, einem Elutionspuffer oder einem detergenzhaltigen Puffer erfolgen. Über die Öffnung kann/können die Amplifikations- Reaktionen in ein mikrofluidisch angeschlossenes System überführt werden und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen gegebenenfalls zusammengeführt werden. Unter einer Amplifikations- Reaktion ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung die sich nach der Amplifikation in dem Reaktionskompartiment befindliche Reaktionslösung zu verstehen.

In einer alternativen vorteilhaften Ausführungsform zum Überführen einer Amplifikations- Reaktion aus der zumindest einen Mikrokavität und/oder zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen unterschiedlicher Mikrokavitäten, weist die zumindest eine Mikrokavität eine, insbesondere nach unten gerichtete, weitere Öffnung in der Wandung auf. Eine solche weitere Öffnung ist beispielsweise während des Reaktionsablaufs durch eine aktuierbare Membran geschlossen. Nach Ablauf der Reaktion wird die weitere Öffnung geöffnet, bzw. die aktuierbare Membran entfernt, um die Amplifikations- Reaktion insbesondere nach unten, in ein mikrofluidisch angeschlossenes System zu überführen und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen gegebenenfalls zusammenzuführen.

Das mikrofluidisch angeschlossene System ist beispielsweise eine mikrofluidisch angeschlossene Reaktionskammer mit einem Volumen von beispielsweise 20pl. Hierin können die Biomarker-Targetamplifikate beispielsweise weiter angereichert und aufgereinigt werden. Zur weiteren Anreicherung werden die Biomarker-Targetamplifikate mit der Universal-Sequenz bei Bedarf erneut amplifiziert und beispielsweise mittels NGS ausgelesen. Anhand der bei der Auslese abgefragten Zellbarcode-Sequenz können die Biomarker den einzelnen Zellen wieder eindeutig zugeordnet werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt die Aufreinigung der Biomarker- Targetamplifikate mittels Fängermolekülen, insbesondere mittels an magnetische Beads immobilisierten Fängermolekülen. Die Fängermoleküle, insbesondere Streptavidin, binden beispielsweise an den Selektionsmarker der SFP und SRP, insbesondere Biotin. Hierzu werden beispielsweise entsprechende Bindebedingungen für die Fängermoleküle und die, den Selektionsmarker umfassenden Biomarker-Targetamplifikaten hergestellt und ein nach bekannten Protokollen durchführbares „Bind-Wash- Elute“- Verfahren angewandt.

Alternativ kann statt der klassischen Elution beispielsweise auch ein Restriktionsenzym die Biomarker-Targetamplifikate, beispielsweise von dem Fängermolekül, freisetzen. Eine Voraussetzung hierfür ist, dass in den SFP und SRP entsprechende Schnittstellensequenzen in der Universal-Sequenz eingebaut sind. Hierbei ist es in einer Ausführungsform der Erfindung vorteilhaft, wenn bei einer Elution der Biomarker-Targetamplifikate von dem Fängermolekül die Protelomerase TelN oder eine Enzymmutante derer verwendet wird, welche die beiden Einzelstrangmoleküle der DNA- Doppelhelix (sense- und antisense-Strang) an der Schnittstelle kovalent miteinander verbindet und hierbei eine Haarnadel-Struktur (Hairpin) hinterlässt. Eine solche Haarnadel- Struktur ist beispielsweise für die Herstellung von NGS-Bibliotheken erforderlich, beispielsweise für die Sequenzierbibliothek der Sequenziertechnologie der Fa. Pacific Biosciences. Vorteilhaft hierbei ist, dass keine weiteren Schritte zur Adapterligation durchgeführt werden müssen.

Desweiteren kann beispielsweise eine weitere Anreicherung der Biomarker-Targetamplifikate mittels einer isothermalen Rolling Circle Amplification (RCA) erfolgen ohne, dass für die Amplifikation zusätzliche Probenvorbereitungsschritte durchgeführt werden müssen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform sind die Zellen zirkulierende Tumorzellen (CTCs). Die molekulargenetische Einzelzellanalyse dieser CTCs ist beispielsweise beim Therapiemonitoring von Krebspatienten eine hochsensitive Möglichkeit um frühzeitig einerseits über den Therapieverlauf (prognostisch) und andererseits über die Therapieanpassung (diagnostisch) Informationen zu sammeln. Hierbei müssen die seltenen CTCs (beispielsweise 10 ¹ bis 10 ² pro mL Blut; einzeln oder einige wenige als Pool) aus einem hohen Hintergrund .gesunder“ Blutzellen (>10 ⁶ Leukozyten, >10 ⁹ Erythrozyten pro mL Blut) isoliert werden. Nach herkömmlichen Methoden muss das genetische Material dieser einzelnen, isolierten Zellen voramplifiziert werden, um für nachgeschaltete Analysen einen ausreichenden Eintrag (Input) zu generieren.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen Prozessschritte zur Voramplifikation der DNA und/oder RNA der CTCs, sowie vorherige Schritte zum Zusammenführen mehrerer vorsortierter Zellen, wodurch sich die Prozesszeit deutlich verkürzt, weniger Arbeitsschritte notwendig sind, weniger Reagenzien benötigt werden und somit auch geringere Kosten anfallen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zellen können vorher angefärbte Zellen sein, wie z.B. EpCAM-positive CTCs. Diese tragen das Oberflächenantigen EpCAM (epitheliales Zelladhäsionsmolekül, engl. epithelial cell adhesion molecule). Es können aber auch alle Zellen ohne vorherige Anfärbung betrachtet werden, wie beispielsweise alle aus dem Zellverbund eines Gewebes gelöste Einzelzellen.

Alternativ können die Zellen auch mikrobielle Zellen oder solche von Einzellern sein. Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Steuergerät, eingerichtet um die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens in entsprechenden Einheiten, insbesondere in einer mikrofluidischen Kartusche, auszuführen und/oder anzusteuern.

Weiterer Gegenstand der Erfindung sind desweiteren ein Computerprogramm, eingerichtet die Schritte des mikrofluidischen Verfahrens auszuführen und/oder anzusteuern sowie ein maschinenlesbares Speichermedium, auf dem das Computerprogramm gespeichert ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:

Fig. 1: die schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment, und

Fig. 2: die schematische Darstellung eines Biomarker-spezifischen Forward- oder

Reverse- Primers.

Ausführungsformen der Erfindung

In Figur 1 ist das erfindungsgemäße Verfahren zur kombinierten zellspezifischen Markierung und Anreicherung von Biomarkern in einem Reaktionskompartiment in einem Ausführungsbeispiel dargestellt, welches anhand einer isothermalen ssMDA beschrieben wird.

Eine Vorrichtung, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchführbar ist, ist in der noch nicht veröffentlichten deutschen Anmeldung mit dem Aktenzeichen 102022203848.7 beschrieben. Diese Vorrichtung weist ein Trägersubstrat zum Aufnehmen einer Probenflüssigkeit auf. Das Trägersubstrat weist zumindest eine Mikrokavität 110 auf und weiterhin zumindest eine Elektrode, die an oder in der Mikrokavität 110 angeordnet ist, um ein elektrisches Feld zu erzeugen, das ausgebildet ist, um eine Zelle 510, insbesondere eine kernhaltige Zelle 510, und/oder einen Primer-Partikel 512 und/oder einen weiteren Partikel in der Mikrokavität 110 zu fangen. Figur 1 der vorliegenden Erfindung zeigt lediglich je eine Mikrokavität 110 dieser Vorrichtung.

In einem nicht in Figur 1 dargestellten, diesem vorgelagerten Schritt 0, wird eine erste Probenflüssigkeit mit Zellen 510 in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Den Zellen 510 sedimentieren Richtung der Mikrokavitäten. Sobald sich eine Zelle 510 der Mikrokavität 110 nähert, wird der DEP-Käfig in einen geöffneten Zustand überführt oder ausgeschaltet, sodass diese Zelle 510 in die Mikrokavität eintreten kann. Sobald die Zelle 510 eingetreten ist, wird der DEP-Käfig wieder geschlossen, sodass keine weitere Zelle in diese eintreten kann und maximal eine Zelle pro Mikrokavität enthalten ist. Wenn alle Zellen sedimentiert sind und beispielsweise alle weiteren Mikrokavitäten ebenfalls mit je einer Zelle beladen sind, wird die Probenflüssigkeit weggespült. Dabei bleibt der DEP-Käfig geschlossen, sodass die Zelle 510 bis auf Weiteres festgehalten wird.

In einem Schritt S1 der Figur 1 ist eine Zelle 510 mit einem Zellkern 511, hier beispielhaft eine CTC, in der Mikrokavität 110 abgebildet. Nun wird eine zweite Probenflüssigkeit mit Primer-Partikeln 512 in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Hierbei wird beispielsweise die sich über dem Trägersubstrat befindliche erste Probenflüssigkeit, welche die Zellen 510 umfasst, verdrängt.

Die Primer-Partikel 512, umfassen beispielsweise einen Partikel 513 aus Polystyrol, mit unterschiedlichen reversibel an diese gekoppelten Primer-Populationen, hier beispielhaft Biomarker-spezifische Forward Primer (SFP) 517 und Biomarker-spezifische Reverse- Primer SRP) 517 mit einem Selektionsmarker 514 und Random Primer (RP) 516. In Figur 1 sind die SFP 517 und SRP 517 optisch nicht voneinander unterscheidbar, es sei jedoch angemerkt, dass es sich um unterschiedliche Populationen von Primern handelt.

In Schritt S2 wird der DEP-Käfig in einem geöffneten oder ausgeschalteten Zustand überführt, sodass ein Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 sedimentieren kann Sobald ein Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 sedimentiert ist, wird der DEP-Käfig durch eine Spannungsänderung in einen geschlossenen Zustand überführt und der Primer- Partikel 512 mit der Zelle 510 in diesem gefangen. In diesem Zustand können keine weiteren Primer-Partikel 512 in die Mikrokavität 110 eintreten, sodass sichergestellt ist, dass sich neben der einzigen Zelle 510 auch nur ein einziger Primer-Partikel 512 in der Mikrokavität 110 befindet. Die gestrichelte Linie mit dem Bezugszeichen 520 soll bildhaft verdeutlichen, dass der DEP-Käfig nach der Beladung mit dem Primer-Partikel 512 geschlossen ist. In einer alternativen, nicht in Figur 1 dargestellten Ausführungsform kann die Mikrokavität 110 auch zuerst mit einem Primer-Partikel 512 beladen werden und anschließend mit einer Zelle 510.

In einer weiterhin alternativen, nicht in Figur 1 dargestellten Ausführungsform können die Primer-Partikel auch nur die SFP und SRP tragen und die RP werden in Schritt S3 über die Amplifikationsmischung eingebracht.

In einem Schritt S3 wird anschließend eine Amplifikationsmischung in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht bzw. auf das Trägersubstrat gegeben. Hierbei wird entweder zuvor die zweite Flüssigkeit mit den nicht verwendeten Primer-Partikeln 512 von dem Trägersubstrat entfernt und die Amplifikationsmischung nachfolgend auf das Trägersubstrat gegeben oder die Flüssigkeit mit den Primer-Partikeln 512 wird direkt mit der Amplifikationsmischung auf dem Trägersubstrat vermischt. Die Amplifikationsmischung umfasst einen Puffer mit einer SD-Polymerase 525 und Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTPs), sowie optional einer reversen Transkriptase und/oder Nicking Enzyms. In Figur 1 ist zum einfacheren Verständnis lediglich die Polymerase 525 dargestellt.

In Schritt S3 ist die diffusions-basierte Verteilung der Bestandteile bzw. der Polymerase 525 der Amplifikationsmischung in die Mikrokavität 110 dargestellt. Hierbei ist der DEP-Käfig geschlossen, was die gestrichelte Linie mit dem Bezugszeichen 520 bildhaft verdeutlichen soll, da die Bestandteile der Amplifikationsmischung keine Entitäten mit dielektrischen Eigenschaften darstellen und den DEP-Käfig somit auch im geschlossenen Zustand diffusionsbasiert passieren können.

In der Mikrokavität 110 befinden sich nun die Zelle 510, der Primer- Partikel 512 und die SD- Polymerase 525 sowie weitere Bestandteile der Amplifikationsmischung.

In einem Schritt S4 wird die Amplifikationsmischung oberhalb der zumindest einen Mikrokavität 110 durch eine nicht-wässrige Phase 526, beispielsweise eine Ölphase oder Luft, verdrängt, sodass die Mikrokavität 110 im Bereich ihrer Öffnung durch die nichtwässrige Phase 526 geschlossen ist und somit ein geschlossenes Reaktionskompartiment darstellt, in welchem die Zelle 510 und der Primer- Partikel 512 mit der Amplifikationsmischung eingeschlossen sind. Es werden nun Bedingungen herbeigeführt, die zu einer Lyse der Zelle 510 und zu einer Freisetzung der Primer 516, 517 von dem Partikel 513 führen.

In S4 ist eine lysierte Zelle 510a dargestellt, aus welcher die Zellbestandteile, beispielsweise RNAs 539 frei geworden sind, sowie ein lysierter Zellkern 511a, welcher die sich in diesem befindliche DNA 539 freigegeben hat. Solche Bedingungen werden beispielsweise durch eine Temperaturerhöhung auf beispielsweise über 70°C für beispielsweise mehr als eine Minute und/oder durch Elektroporation und/oder durch Ultraschall erzeugt.

Bei der temperaturinduzierten Lyse der Zelle 510 erfolgt gleichzeitig eine Denaturierung der DNA-Doppelstränge und/oder der RNA-Sekundärstrukturen und/oder -Tertiärstrukturen, besonders bevorzugt bei Temperaturen zwischen 72°C und 80°C beispielsweise für mehr als eine Minute.

In einem weiteren Schritt S5 erfolgt die Amplifikations-Reaktion mittels ssMDA. Die Random Primer 516 binden ungerichtet an Regionen der DNA 539 und/oder RNA 539, sodass mittels dieser eine isothermale, strand-displacement-basierte Amplifikation der Gesamt-DNA 539 und/oder RNA 539 mithilfe der Polymerasen 525 erfolgen kann. Hierbei entstehen Gesamt- DNA-Amplifikate 539 und/oder Gesamt-RNA-Amplifikate 539. Außerdem binden die spezifischen Forward Primer 517 und die spezifischen Reverse-Primer 517 flankierend strangaufwärts und flankierend strangabwärts von Biomarker-Targetregionen 530 der DNA 539 und/oder RNA 539, sodass eine Amplifikation der Biomarker-Targetregion 530 erfolgt, welche durch den Selektionsmarker 514, beispielsweise Biotin, zellspezifisch markiert ist. Zur Amplifikation binden die Polymerasen 525 an die SFP und SRP, die den SD- Polymerasen 525 den Startpunkt für die Amplifikation vorgeben. Dabei entstehen Biomarker- Targetamp I if ikate 542.

Die SFP und SRP tragen beispielsweise zusätzliche Nicking-Sequenzen am 5‘-Ende, die die Universal-Sequenz verlängern. Bei vorheriger Zugabe eines entsprechenden Nicking- Enzyms mit der Amplifikationsmischung in Schritt S3 kann hier eine zusätzliche, überproportionale Verstärkung der Biomarker-Target- Amplifikation induziert werden, in der die Biomarker-Target- Amplifikate 542 weiterhin die Selektionsmarker 514 tragen.

Die Amplifikation der RNA kann beispielsweise zusätzlich verstärkt werden durch die reverse Transkriptase.

In einem Schritt S6 ist angedeutet, dass zum Zusammenführen mehrerer Amplifikations- Reaktionen aus unterschiedlichen Mikrokavitäten 110, die nicht-wässrige Phase 526 oberhalb der Mikrokavitäten 110, welche diese im Bereich ihrer Öffnung verschlossen hatte, verdrängt wird. Die Verdrängung kann beispielsweise mit einem Elutionspuffer oder einem detergenzhaltigen Puffer erfolgen. Über die Öffnung können die Amplifikations- Reaktionen in ein mikrofluidisch angeschlossenes System, beispielsweise eine mikrofluidisch angeschlossene Reaktionskammer, überführt werden und die einzelnen Amplifikations- Reaktionen zusammengeführt werden.

Hierin können die Biomarker-Targetamplifikate 542 beispielsweise weiter angereichert und aufgereinigt werden. In einem Schritt S7 erfolgt die Aufreinigung der amplifizierten Biomarker-Targetamplifikate 542 mittels Fängermolekülen 543, welche beispielsweise an magnetische Partikel (engl. Beads) immobilisiert sind. Die Fängermoleküle 543, beispielsweise Streptavidin, binden an den Selektionsmarker 514 der SFP 517 und SRP 517, insbesondere Biotin. So können die Biomarker-Targetamplifikate 542 von den übrigen Reaktionsbestandteilen, wie beispielsweise den Gesamt-DNA-Amplifikaten 539 und/oder Gesamt- RN A-Amplifikaten 539, abgetrennt werden. Anschließend erfolgt eine Elution der Biomarker-Targetamplifikate 542 von den Fängermolekülen 543 beispielsweise durch klassische Elutionsverfahren oder durch ein Restriktionsenzym.

In Figur 2 ist beispielhaft ein Biomarker-spezifischer Forward Primer (SFP) 517 bzw. ein Biomarker-spezifischer Reverse-Primer (SRP) 517 dargestellt.

Der SFP bzw. SRP umfasst, beginnend am 5'-Ende, einen Selektionsmarker 514 gekoppelt an eine Universal-Sequenz 501, gefolgt von einer eindeutigen Zellbarcode-Sequenz 503 und einer spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506.

Mittels der spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506 lagert sich der SFP 517 bezüglich der Biomarker-Targetregion 530 flankierend vorwärts-gerichtet bis zu 3 kb strangaufwärts an die DNA 539 und/oder RNA 539 an und der SRP 517 lagert sich bezüglich der Biomarker- Targetregion 530 flankierend rückwärts-gerichtet bis zu 3kb strangabwärts an die DNA 539 und/oder RNA 539 an.

Die eindeutige Zellbarcode-Sequenz 503 ist klonal in jedem SFP 517 und SRP 517 eines Primer-Partikels 512 enthalten, beispielsweise mit einer Länge von 8 oder mehr Basen. Der Selektionsmarker 514 ist beispielsweise Biotin am 5‘-Ende des SFP 517 bzw. SRP 517. Mittels des Selektionsmarkers 514 ist eine spätere positive Selektion der amplifizierten Biomarker-Targetamplifikate 542 möglich. Die Universal-Sequenz 501 wird beispielsweise für eine spätere Amplifikation einer Sequenzier-Bibliothek oder einer bekannten Sequenz mit einer Funktion der Wahl, wie beispielsweise eine Restriktionsschnittstelle, insbesondere zur Freisetzung des Biomarker-Targetamplifikats 542 beispielsweise von einem Fängermolekül 543, benötigt.

Optional und nicht in Figur 2 dargestellt, kann der SFP 517 bzw. SRP 517 einen eindeutigen molekularen Identifikator (UMI) in Form einer randomisierten Sequenz aufweisen. Der UMI kann beispielsweise zwischen der Universal-Sequenz 501 und der Zellbarcode-Sequenz 503 oder zwischen der Zellbarcode-Sequenz 503 und der spezifischen Biomarker-Targetsequenz 506 lokalisiert sein. Der UMI hat insbesondere eine Länge von 6 oder mehr Basen. Weiterhin optional und nicht in Figur 2 dargestellt, kann der SFP 517 bzw. SRP 517 um eine Nicking-Sequenz am 5‘-Ende der Universal-Sequenz 501 verlängert werden. Der Selektionsmarker ist damit nicht mehr endständig am SFP bzw. SRP lokalisiert, sondern intern am 5‘-Ende der Universalsequenz.