La présente invention concerne un procédé chimio-enzymatique de coproduction de disulfure et de sulfoxyde ou de sulfone à partir de mercaptan et de sulfure respectivement, ainsi qu’une composition permettant notamment la mise en oeuvre de ce procédé. La présente invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la réduction d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, et plus particulièrement l’utilisation d’un mercaptan en tant que substrat de régénération d’une cascade enzymatique permettant l’oxydation des sulfures.

Les mercaptans présentent un grand intérêt industriel et sont aujourd’hui très largement utilisés par les industries chimiques, notamment comme matières premières pour la synthèse de molécules organiques plus complexes. Par exemple, le méthylmercaptan (CH ₃ SH) est utilisé comme matière première dans la synthèse de la méthionine, acide aminé essentiel utilisé dans l’alimentation animale. Le méthylmercaptan est également utilisé dans la synthèse de disulfures de dialkyles, en particulier dans la synthèse du disulfure de diméthyle (DMDS), additif de sulfuration de catalyseurs d’hydrotraitement de coupes pétrolières, entre autres applications.

La synthèse industrielle des mercaptans, et en particulier du méthylmercaptan, se fait généralement selon un procédé connu, à partir d’alcools et de sulfure d’hydrogène à température élevée en présence d’un catalyseur selon l’équation (1) suivante :

R-OH + HzS R-SH + Hå0 (1)

Cependant, cette réaction donne lieu à la formation de sous-produits, tels que les sulfures selon l’équation (2) suivante :

R-OH ÷ R-SH - R-S-R + HzO (2)

La synthèse de mercaptans peut également se faire à partir de dérivés halogénés et de sulfhydrates alcalins, alcalinoterreux ou d’ammonium selon l’équation (3) suivante (exemple donné avec un dérivé chloré et un sulfhydrate de sodium) :

R-CI ÷ M _¾ Sfci R-SH + H¾Qi(3)

Cette seconde voie de synthèse conduit également à la présence de sulfures non désirés. Enfin, la synthèse de mercaptans peut se faire à partir d’oléfines et de sulfure d’hydrogène par catalyse acide ou par photochimie suivant que l’on souhaite obtenir un mercaptan ramifié ou non selon l’équation (4) suivante : Une nouvelle fois, cette synthèse donne lieu à des sulfures en tant que sous-produits.

Ces sulfures sont obtenus en grande quantité au niveau industriel et sont principalement amenés à être détruits. Ceci représente une perte d’efficacité pour le procédé de production du mercaptan visé et un coût supplémentaire lié à leur destruction. Cette génération de déchets constitue un véritable problème industriel pour les producteurs de mercaptans qui cherchent donc à valoriser ces sous-produits. Cette valorisation peut être effectuée de différentes manières.

Les sulfures ont tout d’abord leur propre marché : le diméthylsulfure peut être utilisé en tant qu’arôme alimentaire ou en tant qu’agent anti-cokant dans le vapocraquage des charges pétrolières. Cependant, la demande dans ces marchés est très inférieure aux quantités produites de sulfures.

Les sulfures peuvent également être transformés en mercaptans correspondants par la réaction de sulfhydrolyse. Néanmoins, les conditions requises pour réaliser cette réaction sont relativement sévères et génératrices de nouvelles réactions parasites. Cette application industrielle est donc limitée.

Enfin, un autre moyen de valorisation des sulfures produits concerne les réactions d’oxydation des sulfures pour les transformer en sulfoxydes et/ou en sulfones. De telles réactions d’oxydation chimique sont bien connues. Elles font intervenir différents types d’oxydants tels que l’eau de Javel (hypochlorite de sodium), l’eau oxygénée, l’oxygène, l’ozone ou les oxydes d’azote tels que N 0 en présence de catalyseurs ou non.

Outre les oxydations chimiques, les oxydations de sulfures peuvent être catalysées lors de procédés dit biologiques, par catalyse enzymatique en solution ou dans des organismes, généralement des microorganismes.

Les demandes FR1906488 et FR1906489 décrivent respectivement un procédé sélectif de préparation de sulfoxydes ou de sulfones, à partir de sulfures organiques par catalyse enzymatique. Le contenu de ces deux demandes de brevet est intégré ici par référence dans leur intégralité.

Les procédés décrits dans ces deux demandes permettent ainsi l’obtention sélective de sulfoxyde ou de sulfone par l’utilisation d’une enzyme catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone, en fonction de la quantité de sulfure présente lors de la réaction enzymatique. Lorsque le sulfure n’est pas totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors le sulfoxyde est sélectivement obtenu. Lorsque le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors la sulfone est sélectivement obtenue. Toutefois, l’enzyme utilisée peut nécessiter l’utilisation d’un cofacteur qui doit pouvoir être recyclé (ou regénéré) pour que la réaction enzymatique d’oxydation puisse se produire à nouveau.

En effet, par leur complexité et pour des raisons économiques, les cofacteurs ne sont généralement pas ajoutés en quantités stoechiométriques dans les procédés industriels enzymatiques. Différentes approches ont ainsi été développées afin de les recycler et de régénérer les cascades enzymatiques en découlant : l’utilisation d’une molécule analogue au cofacteur. Cette approche consiste à utiliser des molécules plus simples et donc moins coûteuses. Cependant, elle ne permet pas l’obtention d’une affinité enzymes/cofacteur suffisamment élevée pour envisager une application industrielle et constitue un coût non supportable pour les procédés industriels de production de produits à faible valeur ajoutée ; l’utilisation de systèmes oxydo-réducteurs enzymatiques avec utilisation d’un substrat sacrificiel. Ces techniques nécessitent généralement l’utilisation d’une seconde enzyme qui permet de recycler le cofacteur utilisé. Cependant, le coût du substrat sacrificiel impacte fortement la viabilité économique d’un tel procédé. Ceci est vrai en particulier dans le cas de l’oxydation de sulfure en sulfoxyde ou en sulfone à faible valeur ajoutée ; l’utilisation de cellules entières. Dans ce cas, c’est la machinerie cellulaire qui régénère le ou les cofacteurs utilisés. Le procédé se rapproche alors des procédés fermentaires : des ajouts de molécules carbonées/hydrogénées (comme le glucose ou le glycérol) sont généralement réalisés pour améliorer les performances de ce système, ce qui représente un coût supplémentaire.

Il existe donc un besoin pour une voie de régénération industriellement viable des cofacteurs utilisés dans les procédés enzymatiques d’oxydation des sulfures.

Il existe également un besoin pour un procédé de valorisation des sulfures, notamment issus de la synthèse des mercaptans, qui soit industriellement et économiquement viable.

La présente invention a pour objectif de répondre en tout ou partie aux besoins ci-dessus.

En particulier, la présente invention a pour objectif de fournir une voie de régénération (ou voie de recyclage) du cofacteur utilisé pour l’oxydation enzymatique des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones.

La présente invention a également pour objectif de fournir un procédé de coproduction chimio- enzymatique de sulfoxyde ou de sulfone et de disulfure.

Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé de coproduction chimio- enzymatique de sulfoxyde ou de sulfone et de disulfure industriellement viable, intégrant notamment une voie de recyclage des cofacteurs simple, efficace et économique. Un autre objectif de l’invention est de proposer un procédé permettant la valorisation des sulfures produits lors de la production de mercaptans, plus spécifiquement de méthylmercaptan.

Les présents inventeurs ont découvert un procédé chimio-enzymatique de production de sulfoxyde ou de sulfone, de préférence sélectif, intégrant un système de recyclage du cofacteur de l’enzyme catalysant l’oxydation des sulfures, à valeur ajoutée.

En effet, de façon surprenante, les inventeurs ont découvert une cascade chimio-enzymatique qui est non seulement compatible avec le procédé de production de sulfoxyde ou de sulfone mais qui permet aussi de coproduire un second produit d’intérêt, le disulfure, au lieu d’utiliser un substrat sacrificiel. Ainsi, c’est l’oxydation d’un mercaptan en disulfure en fin de cascade qui va permettre de recycler le cofacteur utilisé dans la sulfoxydation.

Par exemple, lorsque l’oxydant est l’oxygène, l’équation globale de la cascade peut s’écrire comme suit :

RSR’ + O2 + 2 R”SH -> RS(0) R’ + H ₂ 0 + R”SSR”, pour les sulfoxydes RSR’ + 2 0 ₂ + 4 R”SH -> RS(0) ₂ R’ + 2 H ₂ 0 + 2 R”SSR”, pour les sulfones. Ainsi, on peut considérer le mercaptan comme un donneur d’hydrogène.

La cascade enzymatique selon l’invention se déroule en particulier comme suit.

En présence d’une enzyme catalysant l’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone (ci- après enzyme E), de son cofacteur et de l’oxydant éventuel, le sulfure est transformé en sulfoxyde ou en sulfone et le cofacteur réduit se retrouve sous sa forme oxydée.

Puis, en présence d’une enzyme catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol (ci-après enzyme D) et de ce composé organique :

- ledit cofacteur oxydé est réduit (et donc recyclé grâce aux atomes d’hydrogène donnés par le composé organique), et

- un dimère est formé par un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique (le composé organique passe de sa forme « monomère » réduite à sa forme « dimère » oxydée).

Ainsi, on entend selon l’invention par « composé organique », un composé de formule R-SH et par « dimère » de ce composé, un composé de formule R-S-S-R (un exemple bien connu est le glutathion G-SH sous forme dimérique G-S-S-G appelée disulfure de glutathion).

La cascade se termine alors grâce à un équilibre chimique : le dimère oxydé est réduit par réaction avec deux équivalents de mercaptan qui sont transformés en disulfure correspondant. En effet, la présence de mercaptan permet grâce un équilibre chimique régi par le principe de Le Chatelier, de : - réduire le dimère en deux équivalents de composé organique (ce dernier est donc également recyclé grâce aux atomes d’hydrogène donnés par le mercaptan) ; et

- de former un disulfure.

C’est la réaction enzymatique qui déplace l’équilibre chimique vers la formation du disulfure. Les mercaptans peuvent être utilisés en quantités stoechiométriques par rapport aux sulfures. En particulier, pour la formation d’un équivalent sulfoxyde, deux équivalents de mercaptans sont utilisés et pour la formation d’un équivalent sulfone, quatre équivalents de mercaptans sont utilisés.

La cascade enzymatique est fonctionnelle jusqu’à épuisement des substrats, réactifs ou cofacteurs ou alors par inhibition, inactivation ou destruction des enzymes E et/ou D.

Cette cascade permet une coproduction de sulfoxyde ou sulfone et de disulfure, tout en régénérant le cofacteur et le composé organique utilisés.

A noter que l’on peut très bien commencer la cascade en sens inverse : toutes les réactions précédemment décrites peuvent être inversées.

On comprend ainsi l’un des avantages de l’invention qui est de pouvoir s’insérer dans un procédé global de valorisation des sous-produits issus de la production de mercaptans et plus particulièrement de méthylmercaptan. Lors de la production de mercaptans, des sulfures sont sous-produits comme indiqué plus haut. Grâce à l’invention, ces sulfures sont oxydés en sulfoxydes ou sulfones, de préférence de façon sélective, et les mercaptans produits peuvent en partie être utilisés pour régénérer les cofacteurs utilisés lors de la sulfoxydation ; tout en étant eux-mêmes transformés en disulfures, autres produits d’intérêts.

Ainsi, la présente invention concerne un procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone comprenant les étapes suivantes : a) préparation d’une composition M comprenant :

1) un sulfure,

2) éventuellement un oxydant,

3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,

4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,

5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère, et

6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; b) conduite, de préférence de façon simultanée, des réactions enzymatiques d’oxydation du sulfure et de formation du pont disulfure afin d’obtenir :

- un sulfoxyde ou une sulfone ; et

- un dimère (dudit composé organique) ; c) réduction dudit dimère obtenu à l’étape b) par réaction, notamment par réaction chimique, avec un mercaptan afin d’obtenir :

- le disulfure correspondant (au mercaptan) ; et

- ledit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol ; et d) éventuelle récupération :

- du disulfure obtenu à l’étape c) ; et/ou

- du sulfoxyde ou de la sulfone obtenu(e) à l’étape b) ; ledit mercaptan pouvant être ajouté lors de l’une quelconque des étapes a), b) ou c), de préférence le mercaptan est ajouté à l’étape a).

Définitions

Le terme « (Ci-C ₂ o)alkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés, qui peuvent être linéaires ou ramifiés et comprennent de 1 à 20 atomes de carbone. De préférence, les alkyles comprennent de 1 à 12 atomes de carbone, voire de 1 à 4 atomes de carbone. On peut citer par exemple le méthyle, l’éthyle, le n-propyle, l’isopropyle, le n-butyle, l’isobutyle, le sec-butyle ou le tert-butyle. Par « ramifié », on entend qu’un groupement alkyle est substitué sur la chaîne alkyle principale.

Le terme « (C ₂ -C ₂ o)alcényle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une double liaison carbone-carbone.

Le terme « (C ₂ -C ₂₀ )alcynyle » désigne un alkyle tel que défini ci-dessus, comprenant au moins une triple liaison carbone-carbone.

Le terme « (C ₆ -Cio)aryle » désigne des composés aromatiques hydrocarbonés monocycliques, bicycliques ou tricycliques, en particulier le phényle et le naphtyle.

Le terme « (C ₃ -Cio)cycloalkyle » désigne des hydrocarbures aliphatiques saturés comprenant de 3 à 10 atomes de carbone, monocycliques ou bicycliques tels que le cyclopropyle, le cyclobutyle, le cyclopentyle ou le cyclohexyle.

On entend par « (C ₃ -Cio)hétérocycloalcane », un cycloalcane comprenant de 3 à 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, de préférence le tétrahydrothiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.

On entend par « (C -Cio)hétéroarène », un arène comprenant entre 4 et 10 atomes de carbone et comprenant au moins un atome de soufre, par exemple le thiophène, et éventuellement au moins un autre hétéroatome.

On entend notamment par hétéroatome, un atome choisi parmi O, N, S, Si, P et les halogènes. On entend généralement par « catalyseur » une substance accélérant une réaction et qui se retrouve inchangée à la fin de cette réaction. Selon un mode de réalisation, ladite enzyme E catalyse la réaction d’oxydation des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones. Selon un mode de réalisation, ladite enzyme D catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère.

Par « quantité catalytique », on entend notamment une quantité suffisante pour catalyser une réaction, en particulier pour catalyser l’oxydation des sulfures en sulfoxydes ou en sulfones et/ou pour former un pont disulfure. Plus particulièrement, un réactif utilisé en quantité catalytique est utilisé en plus petite quantité, par exemple entre environ 0,01% et 20% en poids, par rapport à la quantité en poids d’un réactif utilisé en proportion stoechiométrique.

La sélectivité d’une réaction représente généralement le nombre de moles de produit formé par rapport au nombre de moles de réactif consommé suite à la réaction.

Les définitions usuelles de la conversion, de la sélectivité et du rendement sont les suivantes : Conversion = (nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction) / (Nombre de moles de réactif à l’état initial)

Sélectivité = Nombre de moles de réactif converti en produit souhaité / (Nombre de moles de réactif à l’état initial - nombre de moles de réactif restant après la réaction)

Rendement = Conversion X Sélectivité

Ainsi, on entend notamment par « procédé sélectif de préparation de sulfoxydes », un procédé consommant des sulfures et produisant des sulfoxydes, sans formation de sulfones (ou avec formation d’une quantité négligeable de sulfones). Selon un mode de réalisation, la réaction d’oxydation des sulfures en sulfoxydes est chimiosélective.

On entend notamment par « procédé sélectif de préparation de sulfones », un procédé consommant des sulfures et produisant des sulfones, sans formation de sulfoxydes (ou avec formation d’une quantité négligeable de sulfoxydes). Selon un mode de réalisation, la réaction d’oxydation des sulfures en sulfones est chimiosélective.

Par exemple, le procédé selon l’invention, en particulier l’étape b), permet d’obtenir une sélectivité comprise entre 95% et 100%, de préférence entre 99% et 100% pour les sulfoxydes ou les sulfones.

On considère notamment que la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère correspond à la formation d’un pont disulfure entre deux molécules dudit composé organique (soit 2 R- SH donnent R-S-S-R).

Procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone

Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone comprenant les étapes suivantes : a) préparation d’une composition M comprenant :

1) un sulfure de formule R1-S-R2,

2) éventuellement un oxydant, 3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,

4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,

5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère, et

6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; b) conduite, de préférence de façon simultanée, des réactions enzymatiques d’oxydation du sulfure et de formation du pont disulfure afin d’obtenir :

- un sulfoxyde ou une sulfone de formule RrS(0) _n -R ₂ , avec n = 1 ou 2 ; et un dimère ; c) réduction du dimère obtenu à l’étape b) par réaction avec un mercaptan de formule R ₃ - SH afin d’obtenir :

- un disulfure de formule R ₃ -S-S-R ₃ ; et

- ledit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol; et d) éventuelle récupération :

- du disulfure obtenu à l’étape c) ; et/ou

- du sulfoxyde ou de la sulfone obtenu(e) à l’étape b) ; ledit mercaptan pouvant être ajouté lors de l’une quelconque des étapes a), b) ou c), de préférence le mercaptan est ajouté à l’étape a) ; avec Ri, R ₂ et R ₃ tels que définis ci-après.

Selon un mode de réalisation préféré :

- le sulfure est le diméthylsulfure ;

- le composé organique porteur d’au moins un groupement thiol est le glutathion ;

- l’enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO), de préférence une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO) ;

- l’enzyme D est une glutathion reductase ; et

- le cofacteur commun aux deux enzymes E et D est le NADP.

Production d’un sulfoxyde ou d’une sulfone

Le procédé selon l’invention comprend notamment une étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone, ladite réaction étant de préférence sélective.

Dans un premier mode de réalisation, lorsque le sulfure n’est pas totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors le sulfoxyde est sélectivement obtenu. Ainsi, selon un mode de réalisation, ladite composition M comprend toujours une quantité de sulfure suffisante pour que l’enzyme E transforme le sulfure en sulfoxyde, de préférence sans formation de sulfone. Selon un mode de réalisation, le sulfure est fourni en excès dans la composition M. Dans ce cas, la quantité de sulfure restant après l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique E peut être comprise entre 0,0001% et 99,9% en poids, de préférence entre 0,1% et 99% en poids, de préférence entre 1% et 50% en poids, par exemple entre 1% et 10% en poids, par rapport à la quantité de sulfure de départ en poids, c’est-à-dire de l’étape a).

Dans un second mode de réalisation, lorsque le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure, alors la sulfone est sélectivement obtenue. Ainsi, l’étape de conduite de la réaction enzymatique d’oxydation peut notamment comprendre les deux étapes suivantes : b1) oxydation totale du sulfure en sulfoxyde ; b2) oxydation du sulfoxyde en sulfone.

On entend par « oxydation totale du sulfure », le fait que le sulfure est totalement consommé au cours de l’étape b1 ). Selon un mode de réalisation, le sulfure est le réactif limitant (i.e. présent en défaut) dans la composition M. Par « totalement consommé », on entend notamment que la quantité de sulfure restant après l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique peut être comprise entre 0% et 20% en poids, de préférence entre 0% et 5% en poids, par exemple entre 0% et 1% en poids, et encore plus préférentiellement entre 0% et 0,01% en poids par rapport à la quantité de sulfure de départ en poids, c’est-à-dire de l’étape a).

Cette réaction est décrite dans les demandes FR1906488 pour la formation de sulfoxydes et FR1906489 pour la formation de sulfones.

Coproduction d’un disulfure et d’un sulfoxyde ou d’une sulfone

De préférence, les étapes b) et c) ou les étapes a), b) et c) sont réalisées dans un seul et même réacteur ; de préférence encore les étapes b) et c) se déroulent simultanément.

Dans l’étape a), l’ajout des différents composants de la composition M peut se faire dans n’importe quel ordre, par exemple par simple mélange des différents composants dans un ordre indifférent. La composition M peut être préparée avant introduction dans le réacteur ou directement dans le réacteur (où se déroule l’étape b) et éventuellement l’étape c)).

A l’étape b), la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure peut être réalisée avant ou en même temps que la réaction enzymatique de formation du pont disulfure.

En particulier, à l’étape b), le dimère du composé organique obtenu est sous forme oxydée tandis qu’à l’étape c) le composé organique est sous forme réduite.

L’étape b) peut notamment se décomposer en plusieurs étapes qui sont les suivantes : i) conduite de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure avec l’enzyme E afin d’obtenir : un sulfoxyde ou une sulfone ; et le cofacteur commun aux enzymes E et D sous forme oxydée ; ii) conduite de la réaction enzymatique de formation d’un pont disulfure avec l’enzyme D afin d’obtenir :

- le cofacteur commun aux enzymes E et D sous forme réduite ; et

- un dimère dudit composé organique.

L’étape i) pouvant être effectuée avant ou en même temps que l’étape ii).

L’étape b) de conduite des réactions enzymatiques peut être réalisée à un pH compris entre 4 et 10, de préférence entre 6 et 8 et encore plus préférentiellement entre 7 et 8, par exemple 7.

L’étape b) de conduite des réactions enzymatiques peut être réalisée à une température comprise entre 5°C et 100°C, de préférence entre 20Ό et 80 °C et encore plus préférentiellement entre 25 °C et 40 °C.

Les cellules telles que définies ci-après peuvent être utilisées à l’étape b) directement en absence de traitement quelconque.

L’étape c) peut être réalisée dans les mêmes conditions, en particulier au même pH et à la même température, que l’étape b).

La pression utilisée pour lesdites réactions enzymatiques et/ou l’étape c) peut aller d’une pression réduite par rapport à la pression atmosphérique à plusieurs bars (plusieurs centaines de kPa), selon les réactifs utilisés et le matériel utilisé.

Selon un mode de réalisation, le procédé selon l’invention comprend une étape b’), entre l’étape b) et l’étape c), d’arrêt des réactions enzymatiques par inactivation de(s) enzyme(s) E et/ou D. Cette étape b’) peut être réalisée par des moyens connus tels que le choc thermique (par exemple avec une température d’environ 100°C)ou osmotique, l’application d’une forte pression, l’ajout d’un solvant permettant soit de détruire et/ou de précipiter les cellules et/ou les enzymes E et/ou D, la modification du pH (soit un pH bas d’environ 2, soit un pH élevé d’environ 10).

Le sulfure et ou le mercaptan et/ou éventuellement ledit oxydant peuvent être ajoutés en continu, de préférence à l’étape a).

A l’étape d), le sulfoxyde ou la sulfone et ou le disulfure peuvent être récupéré(e)s sous forme liquide ou solide. Le sulfoxyde ou la sulfone et/ou le disulfure peuvent être récupéré(e)s en solution aqueuse, sous forme liquide par décantation, voire sous forme solide par précipitation selon leur solubilité. Le disulfure peut être extrait dans une phase organique ou séparé du milieu réactionnel par des techniques bien connues de l’homme du métier ; par exemple par distillation après ultrafiltration ou centrifugation.

Ensuite, les produits obtenus peuvent éventuellement être purifiés selon des méthodes classiques. Par exemple, après séparation des cellules (contenant les enzymes E et D) par ultrafiltration ou centrifugation, une distillation peut permettre de séparer le sulfoxyde ou la sulfone et le disulfure. Cette distillation peut se faire à pression atmosphérique, pression réduite (par exemple sous vide), ou sous pression plus élevée si l’homme du métier y voit un intérêt. Une séparation membranaire peut aussi être envisagée pour diminuer la teneur en eau du mélange à distiller ou accélérer un processus de cristallisation. Si le sulfoxyde ou la sulfone et/ou le sulfure a été récupéré(e) par décantation d’un milieu réactionnel aqueux, un séchage sur tamis moléculaire (ou tout autre méthode de séchage) peut être envisagé.

Ledit procédé peut être réalisé en batch ou en continu. Les avantages que procure le procédé de l’invention sont nombreux. Parmi ces avantages, on peut citer la possibilité de travailler en solution aqueuse, dans des conditions très douces de température et de pression et dans des conditions de pH proches de la neutralité. Toutes ces conditions sont typiques d’un procédé biocatalytique dit « vert » ou « durable ».

La composition M peut comprendre le composé organique, l’enzyme E, l’enzyme D et le cofacteur en quantité catalytique. La composition M peut comprendre :

1 ) une quantité stoechiométrique d’un sulfure,

2) une quantité stoechiométrique d’un oxydant,

3) une quantité catalytique d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol,

4) une quantité catalytique d’une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,

5) une quantité catalytique d’une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère,

6) une quantité catalytique d’un cofacteur commun aux deux enzymes E et D ; et

7) une quantité stoechiométrique d’un mercaptan.

En particulier, le ratio molaire mercaptan/sulfure est compris entre 0,1 et 100, plus préférentiellement entre 1 et 5 et de manière préférée entre 2 et 4, par exemple 2.

Sulfure :

On entend notamment par sulfure un sulfure organique, soit tout composé organique comprenant au moins une fonction de type -C-S-C-.

Selon un mode de réalisation, la composition M comprend au moins un sulfure. Elle peut par exemple comprendre un, deux ou plusieurs sulfures différents.

Ledit sulfure peut être symétrique, c’est-à-dire que l’atome de soufre représente un centre de symétrie par rapport au composé.

Selon un mode de réalisation, ledit sulfure est de formule générale suivante :

R1-S-R2 dans laquelle, Ri et R ₂ peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :

(Ci-C ₂ o)alkyle, (C ₂ -C ₂₀ )alcényle, (C ₂ -C ₂₀ )alcynyle, (C ₃ -Cio)cycloalkyle et (C ₆ -Cio)aryle ou

Ri et R ₂ forment un cycle avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent, de préférence un groupement (C ₃ -Cio)hétérocycloalcane ou (C -Cio)hétéroarène ; lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène pouvant éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) ; et lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle et aryle pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatome(s).

Lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de :

(CrC ₂ o)alkyle, (C ₃ -Cio)cycloalkyle et (C ₆ -Cio)aryle ; et peuvent être éventuellement fonctionnalisés par une ou plusieurs fonction(s) choisie(s), de manière non limitative et à titre d’exemples, parmi les fonctions alcool, aldéhyde, cétone, acide, amide, nitrile, ester ou encore les fonctions porteuses de soufre, phosphore et silicium.

Selon un mode de réalisation, lesdits groupements alkyle, alcényle, alcynyle, cycloalkyle, aryle, hétérocycloalcane et hétéroarène peuvent éventuellement être substitué(s) par un ou plusieurs substituant(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de : (Ci-C ₂₀ )alkyle, (C ₃ - Cio)cycloalkyle, (C ₆ -C ₁₀ )aryle, -OH, -C(0)0H, -C(0)H, -C(0)-NH ₂ , -NH ₂ , -NHR, -NRR’, -C(O)- , -C(0)-NHR’, -C(0)-NRR’, -COOR et -CN ; dans lesquels R et R’ représentent indépendamment l’un de l’autre un groupement (Cr C ₂₀ )alkyle.

Selon un mode de réalisation préféré, Ri et R ₂ , peuvent être identiques ou différents et sont choisis indépendamment l’un de l’autre parmi le groupe constitué de :

(Ci-C ₂₀ )alkyle, (C ₂ -C ₂₀ )alcényle, (C ₂ -C ₂₀ )alcynyle et (C ₃ -Ci ₀ )cycloalkyle ou

Ri et R ₂ forment ensemble avec l’atome de soufre auquel ils se rattachent un groupement (C ₃ -

Cio)hétérocycloalcane.

De préférence, Ri et R ₂ sont choisis parmi les (Ci-C ₂₀ )alkyle ou Ri et R ₂ forment ensemble avec l’atome de soufre qui les porte un (C ₃ -Ci ₀ )hétérocycloalcane. Les radicaux Ri et R ₂ dudit sulfure sont de préférence identiques (i.e. formant ainsi un sulfure symétrique).

Plus préférentiellement, le sulfure est choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le dipropylsulfure, le dibutylsulfure, le dioctylsulfure, le didodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Le sulfure peut être choisi parmi le diméthylsulfure, le diéthylsulfure, le di-n-propylsulfure, le di-iso-propylsulfure, le di-n-butylsulfure, le di-iso-butylsulfure, le di-sec- butylsulfure, le di-tert-butylsulfure, le di-n-octylsulfure, le di-n-dodécylsulfure, et le tétrahydrothiophène. Le diméthylsulfure est particulièrement préféré selon l’invention. Selon un mode de réalisation, le sulfure est symétrique.

Mercaotan :

On entend notamment par mercaptan, un mercaptan organique, soit tout composé organique comprenant au moins une fonction de type -C-SH.

Selon un mode de réalisation, le mercaptan est de formule générale R ₃ -SH, dans laquelle R ₃ est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué.

En particulier, le mercaptan est de formule générale R ₃ -SH, dans laquelle R ₃ est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par au moins un groupement choisi parmi le groupe constitué de :

-OH, -C(0)0H, -NH ₂ , -OR _a , -C(0)0R _a , -N(R _a )H, -NR _a R et (C ₆ -C ₁₀ )aryle ; avec R _a et R _b étant indépendamment l’un de l’autre choisi parmi les (CrC ₂ o)alkyles.

De préférence, le mercaptan est de formule générale R ₃ -SH, dans laquelle R ₃ est un radical hydrocarboné, saturé, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par au moins un, par exemple un ou deux, groupement(s) choisi(s) parmi le groupe constitué de : -OH, - C(0)0H, -NH ₂ et (C ₆ -Cio)aryle ; plus préférentiellement -OH, -C(0)0H et -NH ₂ .

R ₃ est plus particulièrement choisi parmi le groupe constitué du méthyle, de l’éthyle, de l’octyle et du dodécyle, de préférence R ₃ est un méthyle.

Le mercaptan peut être choisi parmi le groupe constitué du : mercaptoéthanol, méthylmercaptan, éthylmercaptan, propylmercaptan, butylmercaptan, octylmercaptan, dodécylmercaptan, benzyl mercaptan, acide thioglycolique, acide 3- mercaptopropionique, la cystéine et l’homocystéine.

Le mercaptan est notamment choisi parmi le groupe constitué du : mercaptoéthanol, méthylmercaptan, éthylmercaptan, n-propyl mercaptan, iso- propylmercaptan (ou 2-propanethiol), n-butylmercaptan, sec-butylmercaptan, tert- butylmercaptan, n-octyl mercaptan, tert- octylmercaptan, n-dodécyl mercaptan, tert- dodécylmercaptan, benzyl mercaptan, acide thioglycolique, acide 3-mercaptopropionique, la cystéine et l’homocystéine.

De préférence, le mercaptan est le méthylmercaptan.

Oxydant :

On entend par oxydant tout composé pouvant oxyder un sulfure en sulfoxyde ou en sulfone. L’oxydant peut être choisi parmi le groupe constitué de l’air, de l’air appauvri en oxygène, de l’air enrichi en oxygène et de l’oxygène pur. Lorsque de l’air (air qui peut être appauvri ou enrichi en oxygène) est utilisé, c’est évidemment l’oxygène compris dans l’air qui est consommé au cours de la réaction enzymatique d’oxydation conduite à l’étape b) en tant qu’oxydant.

Lorsque l’oxydant se présente sous forme gazeuse, il est présent dans la composition M sous forme de gaz dissout. Le pourcentage d’oxygène dans l’air enrichi ou appauvri est choisi en fonction de la vitesse de réaction et de la compatibilité avec le système enzymatique de façon connue de l’homme du métier.

L’oxydant peut être en quantité stoechiométrique ou en excès dans la composition M. En excès, le sulfure présent est totalement consommé avec l’oxydant lors de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure conduite à l’étape b) (formation de sulfone).

L’oxydant peut être en quantité sous-stœchiométrique dans la composition M. Ainsi, le sulfure présent est en partie consommé avec l’oxydant lors de la réaction enzymatique d’oxydation du sulfure conduite à l’étape b) mais pas totalement (formation de sulfoxyde).

A l’issue de ladite réaction d’oxydation, généralement l’oxygène est transformé en eau lorsque l’enzyme E utilisée est une mono-oxygénase ou totalement consommé lorsque l’enzyme E est une dioxygénase. Ainsi, le procédé selon l’invention est particulièrement avantageux en termes de rejet et de respect de l’environnement.

Enzyme E :

On entend notamment par « enzyme oxydante », l’enzyme E, soit une enzyme permettant l’oxydation des sulfures en sulfoxydes et/ou sulfones et nécessitant l’utilisation d’un cofacteur. Ladite enzyme E peut être une oxydoréductase, de préférence une oxydoréductase choisie parmi le groupe constitué des monooxygénases et des dioxygénases, encore plus préférentiellement parmi les monooxygénases.

De préférence, ladite enzyme E est une Baeyer-Villiger Monooxygénase (BVMO).

Encore plus préférentiellement et parmi les BVMOs, l’enzyme E peut être une Cyclohexanone Monooxygénase (CHMO), et plus particulièrement une Cyclohexanone-1 ,2-MonoOxygénase ; une Cyclopentanone Monooxygénase (CPMO), plus particulièrement une cyclopentanone 1 ,2- monooxygénase ; ou une hydroxyacétophénone monooxygénase (HAPMO) et plus particulièrement une 4-hydroxyacétophénone monooxygénase.

Les Cyclohexanone-1 ,2-Monooxygénases sont notamment de classe EC 1 .14.13.22.

Selon un mode de réalisation particulier, la CHMO est une CHMO d ’Acinetobacter sp. (par exemple de souche NCIMB 9871 ) et/ou une CHMO codée par le gène chnB appartenant au cluster AB006902.

Les Cyclopentanone 1 ,2-Monooxygénase sont notamment de classe EC 1.14.13.16.

Selon un mode de réalisation particulier, la CPMO est une CPMO de Comamonas sp. (par exemple la souche NCIMB 9872) et/ou une CPMO codée par le gène cpnB. Les hydroxyacétophénone monooxygénases sont notamment de la classe EC 1.14.13.84. Selon un mode de réalisation particulier, IΉARMO est une HAPMO de Pseudomonas fluorescens. codée par le gène hapE.

Enzyme D et composé organique porteur d’un groupement thiol :

On entend par composé organique porteur d’un groupement thiol, tout composé hydrocarboné pouvant comprendre des hétéroatomes et/ou tout type de fonction chimique connue et porteur d’au moins un groupement -SH (ci-après composé organique). Le composé organique selon l’invention peut comprendre un ou deux groupement(s) thiol(s) (groupement -SH). Ce composé peut exister sous forme de dimère, le dimère étant formé grâce à un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique (2 R-SH donnent R-S-S-R).

Le composé organique peut être choisi parmi le groupe constitué d’un acide aminé porteur d’un groupement thiol, un peptide porteur d’un groupement thiol, le mycothiol (n°CAS 192126- 76-4) et l’acide dihydrolipoïque (n°CAS 462-20-4). De préférence, ledit composé organique est un acide aminé porteur d’un groupement thiol ou un peptide porteur d’un groupement thiol. En particulier, ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué de : la cystéine, l’homocystéine, le glutathion, la thiorédoxine, le mycothiol et l’acide dihydrolipoïque.

Selon un mode de réalisation, lorsque le mercaptan selon l’invention est la cystéine ou l’homocystéine, alors ledit composé organique est différent de la cystéine ou de l’homocystéine (respectivement). Selon un mode de réalisation, le composé organique et le mercaptan sont différents.

Plus spécifiquement, ledit composé organique est choisi parmi le groupe constitué de : la cystéine, l’homocystéine, le glutathion et la thiorédoxine.

De façon particulièrement préférée, ledit composé organique est le glutathion. Le couple glutathion (GSH)/disulfure de glutathion (GSSG) est largement connu en biologie. Cette espèce sous forme réduite (glutathion) ou oxydée (disulfure de glutathion) forme un couple d’oxydo-réduction important dans les cellules.

L’enzyme D catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique pour former un dimère (appelé un ou le dimère dans la description). En particulier, elle catalyse la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents d’un acide aminé porteur d’un groupement thiol ou entre deux équivalents d’un peptide porteur d’un groupement thiol pour former un diacide aminé ou un dipeptide. L’enzyme D peut être définie comme une « enzyme de recyclage » du cofacteur commun réduit ou oxydé, de préférence elle recycle le cofacteur commun oxydé en cofacteur commun réduit.

Elle peut être une réductase ou une déshydrogénase, de préférence elle peut être choisie parmi le groupe constitué de la glutathion réductase, la thiorédoxine réductase, la cystéine réductase, l’homocystéine-réductase, la mycothiol disulfure réductase et la dihydrolipoyl déshydrogénase. Plus particulièrement, l’enzyme D est choisie parmi le groupe constitué de la glutathion réductase, la thiorédoxine réductase, la cystéine réductase et l’homocystéine- réductase.

La glutathion réductase peut être représentée par les numéros de classification enzymatique EC 1.8.1.7 ou EC 1.6.4.2 ; la cystéine-réductase par le numéro EC 1 .8.1.6 ; la thioredoxine réductase par les numéros EC 1.8.1 .9 ou EC 1 .6.4.5; la mycothione réductase par le numéro EC 1.8.1.15 (cette enzyme est également appelée mycothiol-disulfure réductase). De façon particulièrement préférée, ladite enzyme D est la glutathion réductase.

Plus spécifiquement, chaque composé organique est couplé avec l’enzyme D qui lui correspond, permettant de former ainsi le dimère correspondant. Les couples ou complexes enzymatiques composé organique/enzyme D suivants sont donc particulièrement utiles pour la mise en œuvre du procédé selon l’invention :

- le glutathion/la glutathion réductase,

- la thiorédoxine/la thiorédoxine réductase,

- la cystéine/la cystéine réductase,

- l’homocystéine/rhomocystéine-réductase,

- le mycothiol/la mycothiol disulfure réductase, et

- l’acide dihydrolipoïque/la dihydrolipoyl deshydrogénase.

Cofacteur(s) commun(s) :

On entend notamment par « cofacteur commun » un cofacteur nécessaire à l’activité catalytique de l’enzyme E et de l’enzyme D telles que définies ci-dessus et/ou permettant d’améliorer leur activité catalytique. On entend de préférence par « cofacteur commun » aux enzymes E et D, un cofacteur pouvant être réduit et/ou oxydé par l’action de ces enzymes. Selon un mode de réalisation, un, deux cofacteurs ou plus sont présents dans la composition M. Par exemple, il est possible d’ajouter à la composition M un cofacteur déjà présent naturellement dans l’enzyme E et/ou dans l’enzyme D, en supplément d’un autre cofacteur. Ledit cofacteur peut être choisi parmi les cofacteurs nicotiniques et les cofacteurs flaviniques. En particulier, ledit cofacteur peut être choisi parmi le groupe constitué de : la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), la flavine mononucléotide (FMN), la flavine adénine dinucléotide (FAD) et/ou leur forme réduite correspondante (à savoir NADH,H+ NADPH,H+, FMNH ₂ , FADH ₂ ).

Les cofacteurs listés ci-dessus sont avantageusement utilisés sous leurs formes réduites (par exemple NADPH, H+) et/ou leurs formes oxydées (par exemple NADP+), c’est-à-dire qu’ils peuvent être ajoutés sous ces formes réduites et/ou oxydées dans la composition M, de préférence sous forme réduite.

De préférence l’enzyme E utilisée est la Cyclohexanone Monooxygénase, par exemple la Cyclohexanone Monooxygénase d ’Acinetobacter sp., le cofacteur utilisé est le NADP, éventuellement supplémenté de FAD et l’enzyme D est la glutathion réductase.

La composition M selon l’invention peut également comprendre :

- éventuellement un ou plusieurs solvants choisis parmi l’eau, les tampons tels que les tampons phosphates, Tris-HCI, Tris-base, bicarbonate d’ammonium, acétate d’ammonium, HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1 -pipérazine éthane sulfonique), CHES (acide N-cyclohexyl-2- aminoéthanesulfonique), ou les sels tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium, ou leurs mélanges ;

- éventuellement des additifs tels que des surfactants, afin notamment de favoriser la solubilité d’un ou plusieurs réactif(s) ou substrat(s) de la réaction enzymatique.

De préférence, la composition M est une solution aqueuse. Par exemple, ladite composition M comprend entre 50 % et 99 % en poids d’eau, de préférence entre 80 % et 97 % en poids d’eau par rapport au poids total de la composition M.

Selon un mode de réalisation, la composition M est considérée comme le mélange réactionnel. Les différents composants de la composition M préparée à l’étape a) ci-dessus sont aisément accessibles dans le commerce ou peuvent être préparés selon des techniques bien connues de l’homme du métier. Ces différents éléments peuvent se présenter sous forme solide, liquide ou gazeuse et peuvent très avantageusement être mis en solution ou dissous dans l’eau ou tout autre solvant pour être mis en oeuvre dans le procédé de l’invention. Les enzymes utilisées peuvent également être greffées sur support (cas des enzymes supportées).

Selon un mode de réalisation, les enzymes E et/ou D, éventuellement le composé organique et éventuellement le cofacteur commun sont :

- soit sous forme isolée et/ou purifiée, par exemple en solution aqueuse ;

- soit compris dans un extrait brut, c’est-à-dire dans un extrait de cellules broyées ; ou

- soit compris dans des cellules entières.

De préférence, des cellules entières sont utilisées. Le ratio [sulfure] (en mmol/L) / [cellules] (en g _cps .L ^-1 ) peut être compris entre 0,01 et 10, de préférence entre 0,01 et 3 mmol/g _cps , de préférence pendant l’étape b) de conduite de la réaction enzymatique. La détermination de la concentration massique en grammes de cellules sèches (gcps pour Cellules en Poids Sec ou gc _D w pour Cells Dry Weight en anglais) est réalisée selon des techniques classiques.

Les enzymes E et/ou D peuvent être surexprimée(s) ou non dans lesdites cellules, appelées ci-après cellules hôtes. La cellule hôte peut être tout hôte approprié pour la production d’une enzyme E et/ou D à partir de l’expression du gène codant correspondant. Ce gène pourra alors se trouver soit dans le génome de l’hôte, soit porté par un vecteur d’expression tels que ceux définis ci-après.

On entend notamment par « cellule hôte » au sens de la présente invention une cellule procaryote ou eucaryote. Des cellules hôtes couramment utilisées pour l’expression de protéines recombinantes ou non incluent notamment des cellules de bactéries telles que Escherichia coli ou Bacillus sp., ou Pseudomonas, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris, des cellules de champignons tels que Aspergillus niger , Pénicillium funiculosum ou Trichoderma reesei, des cellules d’insectes telles que les cellules Sf9, ou encore des cellules de mammifères (notamment humaines) telles que les lignées cellulaires HEK 293, PER-C6 ou CHO.

Lesdites cellules hôtes peuvent être en phase stationnaire de croissance, par exemple sorties du milieu de culture.

De préférence, les enzymes E et ou D, éventuellement le composé organique et éventuellement le cofacteur commun sont exprimés dans la bactérie Escherichia coli. Préférentiellement, la CHMO et/ou IΉARMO est exprimée à l’intérieur d’une souche d 'Escherichia coli comme par exemple Escherichia coli BL21 (DE3).

Intégration d’un vecteur d’expression comprenant la séquence codante pour l’enzyme E et/ou D dans l’hôte cellulaire

Lors de l’utilisation d’un vecteur d’expression tel qu’un plasmide, la transformation des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier, par exemple par lipofection, électroporation, choc thermique, ou par des méthodes chimiques. Le vecteur d’expression et la méthode d’introduction du vecteur d’expression au sein de la cellule hôte sont sélectionnés en fonction de la cellule hôte choisie. A l’issue de cette étape de transformation, une cellule transformée exprimant un gène codant une enzyme recombinante E et ou D est obtenue. Elle peut être cultivée, lors d’une étape de culture/d’incubation, afin de produire l’enzyme E et/ou D.

L’incubation/la culture des cellules procaryotes et eucaryotes est une technique bien connue de l’homme du métier qui peut déterminer par exemple, le milieu de culture ou encore les conditions de temps et de température. Selon le vecteur utilisé, une période d’induction - correspondant à une production accrue de l’enzyme E et ou D - peut être observée. L’utilisation d’inducteur faible (comme par exemple l’arabinose pour le vecteur pBad) ou fort (comme par exemple l’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG) pour les vecteurs pET22b, pRSF, etc...) peut être envisagée. Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E et/ou D, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot. On entend par « vecteur d’expression », une molécule d’ADN de taille réduite dans laquelle il est possible d’insérer une séquence nucléotidique d’intérêt. Il est possible de choisir entre plusieurs vecteurs d’expression connus tels les plasmides, les cosmides, les phages, etc ... Le choix du vecteur se fait notamment en fonction de l’hôte cellulaire utilisé.

Il peut s’agir par exemple du vecteur d’expression décrit dans le document WO 83/004261 .

Intégration de la séquence codante pour l’enzyme E et/ou D dans le génome de la cellule hôte en l’absence de vecteur d’expression

La séquence nucléotidique codant l’enzyme E et/ou D peut être intégrée dans le génome de la cellule hôte par toute méthode connue comme par exemple la recombinaison homologue ou encore le système CRISPR-Cas9 etc... Pour vérifier que la cellule hôte produit l’enzyme E et/ou D, on peut utiliser la technique d’électrophorèse SDS-PAGE ou la technique du Western blot.

Isolation et/ou purification de l’enzyme E et/ou D pour une utilisation sous forme isolée et/ou purifiée

Après transformation et culture/incubation de la cellule hôte transformée, une étape d’isolation et éventuellement de purification de l’enzyme E et/ou D peut être réalisée. De cette façon, le procédé selon l’invention n’est pas réalisé en présence des cellules hôtes mais par l’enzyme E et/ou D en solution dans la composition M, de préférence en solution aqueuse.

L’isolation et/ou la purification de ladite enzyme E et ou D produite peut être réalisée par tout moyen connu de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une technique choisie parmi une électrophorèse, un tamisage moléculaire, une ultracentrifugation, une précipitation différentielle, par exemple au sulfate d’ammonium, une ultrafiltration, une filtration sur membrane ou sur gel, un échange d’ions, une séparation par interactions hydrophobes, ou une chromatographie d’affinité, par exemple de type IMAC.

Mode de Ivse de la cellule hôte, préparation d’un extrait brut de cellules broyées Le lysat cellulaire peut être obtenu selon différentes techniques connues telles que la sonication, la pression (presse de French), via l’utilisation d’agents chimiques (ex. triton) etc... Le lysat obtenu correspond à un extrait brut de cellules broyées.

Composition et utilisations

La présente invention concerne également une composition comprenant :

1) un sulfure,

2) éventuellement un oxydant,

3) un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, 4) une enzyme E catalysant l’oxydation dudit sulfure en sulfoxyde ou en sulfone,

5) une enzyme D catalysant la formation d’un pont disulfure entre deux équivalents dudit composé organique porteur d’au moins un groupement thiol pour former un dimère,

6) un cofacteur commun aux deux enzymes E et D, et

7) un mercaptan.

L’invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la régénération ou le recyclage d’un cofacteur (cofacteur enzymatique, notamment tel que défini ci-dessus), de préférence d’un cofacteur utilisé dans l’oxydation enzymatique d’un sulfure. Par « régénération » ou « recyclage », on entend notamment le passage d’une forme oxydée à une forme réduite du cofacteur ou vice versa.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un mercaptan pour la réduction d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, ledit mercaptan étant de préférence transformé en disulfure correspondant. De préférence, ledit pont disulfure est formé par catalyse enzymatique, notamment telle que définie ci-dessus pour l’enzyme D. De préférence, le mercaptan est le méthylmercaptan et le composé organique est le glutathion. Cette utilisation du mercaptan est notamment prévue en tant que voie de régénération ou de recyclage d’un cofacteur, notamment d’un cofacteur utilisé dans l’oxydation enzymatique d’un sulfure.

L’invention concerne également un procédé d’oxydation enzymatique d’un sulfure comprenant une étape de régénération ou de recyclage d’un cofacteur par un mercaptan.

La présente invention concerne également un procédé de réduction par un mercaptan d’un pont disulfure formé entre deux équivalents d’un composé organique porteur d’au moins un groupement thiol, ledit mercaptan étant de préférence transformé en disulfure correspondant. Plus particulièrement, le sulfure, l’oxydant, le composé organique, l’enzyme E, l’enzyme D, le cofacteur, le mercaptan, les réactions enzymatiques et chimiques sont tels que définis ci- dessus, notamment dans le cadre du procédé de coproduction selon l’invention.

Description des Figures

Figure 1 : La Figure 1 représente les concentrations (en mM) de diéthylsulfure (DES), de diéthylsulfoxyde (DESO) et de Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) présentes dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction d’oxydation est catalysée par l’enzyme CHMO. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d’E. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le 2-mercaptoéthanol à une concentration double par rapport au DES. Figure 2 : La Figure 2 représente les concentrations (en mM) de diéthylsulfoxyde (DESO), de diéthylsulfone (DES0 ₂ ) et de Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) présentes dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction d’oxydation est catalysée par l’enzyme CHMO. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d Έ. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le 2-mercaptoéthanol à une concentration double par rapport au DESO.

Figure 3 : La Figure 3 représente la concentration (en mM) de diéthylsulfoxyde (DESO) présente dans le milieu réactionnel en fonction du temps (exprimé en heure), lorsque la réaction est catalysée par l’enzyme CHMO. Dans cet exemple, le 2-mercaptoéthanol a été remplacé par le méthylmercaptan (MeSH) comme donneur de protons. Les éléments de la cascade permettant le recyclage du cofacteur NADP ont également été ajoutés : les cellules sur-exprimant la glutathion réductase (GR) d’E. coli ont été ajoutées à la même concentration que les cellules exprimant la CHMO, le glutathion oxydé (GSSG) a été introduit en quantité catalytique et le MeSH est ajouté progressivement dans le milieu réactionnel selon un débit d’environ 4 mmol/L/h.

Figure 4 : La Figure 4 est une illustration d’une cascade enzymatique telle que selon l’invention.

Le mercaptan et le sulfure sont introduits dans un milieu réactionnel comprenant :

- la CHMO (correspondant à l’enzyme E), du NADPH (cofacteur commun),

- la Glutathion réductase (correspondant à l’enzyme D),

- le disulfure de Glutathion ou du Glutathion (correspondant au dimère ou au composé organique comprenant au moins un groupement thiol).

De l’air est notamment introduit en continu permettant l’oxydation du sulfure en sulfoxyde ou en sulfone suivant le mode d’introduction du sulfure. La cascade enzymatique est alors engendrée.

Le cofacteur commun, le NADPH, est concomitamment à la formation de sulfoxyde ou sulfone, oxydé en NADP+. Ce dernier, grâce à la présence de deux molécules de Glutathion, est réduit à nouveau en NADPH, H+, les 2 molécules de Glutathion (2 GSH) donnant du disulfure de Glutathion (GSSG). Pour terminer la cascade, le disulfure de Glutathion, par un équilibre chimique, permet d’oxyder 2 molécules de mercaptans en disulfure correspondant, régénérant ainsi 2 molécules de Glutathion. Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et ne sont pas limitatifs de la présente invention.

EXEMPLES

Exemple 1 : Synthèse sélective du diéthylsulfoxyde à partir de diéthylsulfure via l’utilisation de 2-mercaptoéthanol.

I. Préparation du biocatalvseur :

Production de la CycloHexanone MonoOxygénase (CHMO)

Une souche d ’Escherichia coli BL21(DE3) (commercialisée par Merck Millipore) exprimant le gène chnB inséré dans le plasmide pET22b (commercialisé par Promega, Qiagen) a été préalablement construite. Elle permet l’expression hétérologue de la CycloHexanone MonoOxygénase (CHMO) d ’Acinetobacter sp.

Il est entendu que ladite souche contient à la fois la CHMO, les cofacteurs de la CHMO qui sont le NADP et le FAD.

Une pré-culture et une culture de cette souche ont été réalisées selon les techniques connues de l’homme de métier.

Après une phase d’induction déclenchée par l’ajout d’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG) à 0,85 mmol/L en concentration finale, un certain volume de la culture est centrifugé (10 min, 5000 g, 4°C) afin d’obtenir la quantité souhaitée de celLiles.

Production de la glutathion réductase (G R)

Une souche d ’Escherichia coli BL21(DE3) (commercialisée par Merck Millipore) exprimant le gène gor inséré sur le plasmide pET26b+ (commercialisé par Promega, Qiagen) a été conçue selon les techniques connues de l’homme du métier. Elle permet l’expression hétérologue de la glutathion réductase (GR) d ’Escherichia coli.

Il est entendu que ladite souche contient à la fois la GR et le cofacteur de la GR qui est le NADP.

Une pré-culture et une culture de cette souche ont été réalisées selon les techniques connues de l’homme du métier.

Après une phase d’induction déclenchée par l’ajout d’isopropyl b-D-l-thiogalactoside (IPTG), un certain volume de la culture est centrifugé (10 min, 5000 g, 4°C) afin d’obtenir la quantité souhaitée de cellules. II. Bioconversion :

Dans cet exemple, les culots de cellules fraîches sont repris dans 32 ml_ d’un tampon phosphate 0,1 mol/L à pH 8. La concentration cellulaire alors obtenue est de 62 UDO/mL ou encore 20 gcps/L (avec CPS : cellules en poids sec) pour les cellules sur-exprimant la CHMO et la GR.

Dans une fiole de 250 mL, des concentrations initiales de 3 mmol/L de diéthylsulfure (DES), 6 mmol/L de 2-mercaptoéthanol et 0,25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) sont présentes à t=0 dans un volume final de 32 mL.

A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement le diéthylsulfoxyde (DESO) et le Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon préalablement obtenue. Dans les conditions de l’analyse pratiquée, la concentration minimale pouvant être mesurée est de 50 pM.

Une augmentation linéaire de la quantité de DESO est mesurée au cours du temps sans que la sulfone (DES0 ₂ ) ne soit détectée. La vitesse initiale d’oxydation du sulfure est alors de 1 mmol de DES oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 1 ). Une quantité analogue de Bis(2- hydroxyéthyl)disulfure est produite de manière concomitante à la production de DESO ce qui atteste du bon fonctionnement du système couplé GSSG/GR pour le recyclage du cofacteur. Il est à noter que la concentration en Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure en fonction du temps a été déterminée après soustraction du bruit de fond lié à l’oxydation spontanée lente du 2- mercaptoéthanol (bruit de fond déterminé en présence de tous les éléments de la cascade (dans les mêmes conditions) à l’exception des cellules sur-exprimant la CHMO).

La réaction catalysée par la CHMO est chimio-sélective, car la réaction de transformation du DESO en DES0 ₂ ne se produit que lorsque le DES est entièrement consommé. En d’autres termes, la sulfone ne se forme pas lorsqu’il y a du DES dans le milieu réactionnel.

La sélectivité obtenue est d’environ 100%. Lorsque le DES est toujours présent dans le milieu réactionnel, la sulfone n’est pas détectée avec les outils analytiques utilisés. A la fin de la réaction (t=4h), environ 100% de DESO est obtenu sans que le DES0 ₂ soit détecté par les outils analytiques utilisés. Exemple 2 : Synthèse sélective de diéthylsulfone à partir de diéthylsulfoxyde via l’utilisation de 2-mercaptoéthanol comme donneur d’hydrogènes.

I. Préparation du biocatalvseur :

Les mêmes souches que celles décrites dans l’exemple 1 ont été utilisées dans cet exemple, c’est-à-dire les souches sur-exprimant la CHMO et la GR d’E. coli.

Une centrifugation est réalisée (10 min, 5000 g, 4°C) et les culots sont ensuite repris dans 32 mL d’un tampon phosphate 0,1 mol/L pH 8. Une concentration cellulaire de 62 UDO/mL (ou environ 20 gcps/L) de chaque souche est alors utilisée pour l’essai réactionnel.

II. Bioconversion :

Dans une fiole de 250 mL, 3 mmol/L de diéthylsulfoxyde (DESO), 6 mmol/L de 2- mercaptoéthanol et 0,25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) sont ajoutés simultanément à t=0 dans un volume final de 32 mL.

A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement la diéthylsulfone (DES02) et le Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure (Disulfure) formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon obtenue précédemment.

Une augmentation linéaire de la quantité de DES0 ₂ est mesurée au cours du temps. La vitesse initiale d’oxydation du sulfoxyde est alors de 0,75 mmol de DESO oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 2). Parallèlement, une quantité analogue de 2- Bis(2-hydroxyéthyl)disulfure est produite de manière concomitante à la production de DES0 ₂ . Par conséquent, le 2- mercaptoéthanol ajouté permet bien de recycler le cofacteur NADP via une voie cascade- dépendante. Le bruit de fond a été déduit de la même façon que dans l’exemple 1 .

Exemple 3 : Synthèse sélective du diéthylsulfoxyde à partir de diéthylsulfure via l’utilisation de methylmercaptan (MeSH) comme donneur d’hydrogènes.

I. Préparation du biocatalvseur :

Les mêmes souches que celles décrites dans l’exemple 1 et 2 ont été utilisées dans cet exemple, c’est-à-dire les souches sur-exprimant la CHMO et la GR d’E. coli. Le 2- mercaptoéthanol a été remplacé par le MeSH dans cette réaction biocatalysée. II. Bioconversion :

Dans cet exemple, les culots de cellules fraîches sont repris dans 200 ml_ d’un tampon phosphate 0,1 mol/L à pH 8. La concentration cellulaire alors obtenue est de 62 UDO/mL ou encore 20 gcps/L (avec CPS : cellules en poids sec) pour les cellules sur-exprimant la CHMO et la GR.

Dans un réacteur de 1 L, sont ajoutés simultanément à t=0 : 10 mmol/L de diéthylsulfure (DES), 0.25 mmol/L de glutathion oxydé (GSSG) ainsi que la solution enzymatique préalablement préparée. De plus, du methylmercaptan est ajouté progressivement au milieu réactionnel par acidification à l’acide sulfurique du sodium methyl mercaptan (débit ajusté à environ 4 mmol/L/h). Puis du diéthylsulfure pur est progressivement ajouté selon un débit de 40 pl_ h de manière à assurer une concentration constante de DES et une vessie permet l’ajout régulier d’0 ₂ nécessaire à la conduite de la réaction. La réaction est initiée sous agitation à température contrôlée de 30 °C.

A des temps réguliers, 200 pL du milieu réactionnel sont prélevés et dilués dans 1000 pL d’une solution d’acétonitrile. Après centrifugation (5 min, 12 500 g), le surnageant est injecté en CPG afin de mesurer quantitativement le diéthylsulfoxyde (DESO) et la diéthylsulfone (DES0 ₂ ) potentiellement formés au cours de la réaction en utilisant une gamme étalon obtenue précédemment. Dans les conditions de l’analyse pratiquée, la concentration minimale pouvant être mesurée est de 50 pM.

Une augmentation linéaire de la quantité de DESO est mesurée au cours du temps sans que la sulfone (DES0 ₂ ) ne soit détectée. La vitesse initiale d’oxydation du sulfure est alors de 0,2 mmol de DES oxydé par litre de milieu et par heure (Figure 3). Du diméthyldisulfure (DMDS) est produit concomitamment à la production de DESO ce qui atteste du bon fonctionnement du système couplé GSSG/GR pour le recyclage du cofacteur.

La réaction catalysée par la CHMO est chimio-sélective, car la réaction de transformation du DESO en DES0 ₂ ne se produit pas puisque du DES est présent dans le milieu réactionnel tout au long de la réaction.