Zellüberwachung mittels Streulichtmessung Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Zell ^¬ überwachung mit mindestens einer Aufnahmeeinheit für eine Mehrzahl von Testzellen und einer Messeinrichtung zur Zellmessung . Im Bereich der Zellmessung sind prinzipiell verschiedene Me ^¬ thoden und Verfahren bekannt, mittels derer biologische sowie chemische Parameter bestimmt werden, die in der Medizin beispielsweise zur Medikamentenerprobung dienen. In-vitro- Zelltests umfassen markierungsfreie Methoden, beispielsweise die Adherenzmessung von Zellen mittels Impedanzspektroskopie, die Sauerstoffbestimmung mittels einer Clark-Elektrode oder mittels optischer Sensoren, sowie die pH-Messung mittels ionenselektiver Feldeffekttransistoren. Daneben sind Fluoreszenz- und Chemilumineszenz-Verfahren bekannt. Diese zählen zu den sogenannten Endpunktsbestimmungen und haben den Nachteil der meist einhergehenden Zellabtötung .

Die Methode der Durchflusszytometrie nutzt Lichtstreuung und Fluoreszenz zur Zellgrößen- und Zellstrukturmessung. Nachtei- lig an dieser Methode ist, dass durch den Probenfluss nur ei ^¬ ne Momentaufnahme gewährleistet ist und die Proben nicht über einen längeren Zeitraum charakterisiert werden.

Es ist bekannt, dass während einer Zellmessung, besonders über einen längeren Zeitraum, eine Überwachung des Zellzustandes sowie der Zelldichte einer Lage von Zellen auf einem Substrat notwendig ist. Dafür wird auf eine mikroskopische Kontrolle zurückgegriffen. Eine mikroskopische Kontrolle er ^¬ fordert einen manuellen Arbeitsprozessschritt oder eine auf- wendige Automatisierung. Eine kontinuierliche Mikroskopiekontrolle hat den Nachteil hoher Datenmengen, hohen Zeitbedarfs sowie aufwendiger Parallelisierung . Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zur Zellmessung bereitzustellen, durch die insbesondere eine aufwendige Mikroskopiekontrolle oder ein zusätz ^¬ licher manueller Arbeitsprozessschritt vermieden werden.

Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestal ^¬ tungen der Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche. Die erfindungsgemäße Vorrichtung dient der Zellüberwachung und umfasst mindestens eine Aufnahmeeinheit für eine Mehrzahl von Testzellen sowie eine erste Messeinrichtung zur Zellmessung. Die Aufnahmeeinheit umfasst ein wenigstens teilweise lichtdurchlässiges Substrat. Die Vorrichtung umfasst eine zweite Messeinrichtung zur Streulichtmessung. Die zweite

Messeinrichtung weist eine Lichtquelle und einen Streulicht ^¬ detektor auf. Dabei sind die Aufnahmeeinheit , die Lichtquelle und der Streulichtdetektor so angeordnet, dass wenigstens ein Teil des von der Lichtquelle erzeugten Lichts in die Aufnah- meeinheit einfällt und an wenigstens einem Teil der Testzel ^¬ len in der Aufnahmeeinheit gestreut wird, die Aufnahmeeinheit durch das Substrat verlässt und auf den Streulichtdetektor trifft. Das hat zum Vorteil, dass parallel zu einem Zelltest, auch über lange Beobachtungszeiträume, eine kontinuierliche Kontrolle des Zellzustandes sowie der Zelldichte einer Lage von Testzellen erfolgen kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt eine Kombination aus Zellüberwachung und Zellmessung, beispielsweise elektrochemischer Charakterisierung. Kein abbildendes Verfahren und kein Mikroskopieschritt sind notwendig, wodurch die Zellüberwachung einfacher und damit auch kostengünstiger wird. Darüber hinaus wird durch die Vermeidung eines zusätzlichen manuellen Arbeitsschrittes eine Zeiteinsparung erzielt. In einer vorteilhaften Ausgestaltung umfasst die Vorrichtung einen Streulichtdetektor mit mindestens einer Fotodiode. Die Vorrichtung ermöglicht die Kombination mehrerer Aufgaben, die Bestimmung der Zelldichte, die Bestimmung der Zellmorpholo- gie, die Konzentrations- bzw. Dichtebestimmung von Testzellen auf einem Substrat sowie die Bestimmung dynamischer Parameter wie Wachstumskurven, Konfluenz der Zellen und eine kontinuierliche Bestimmung akuttoxischer Parameter, die insbesondere gleichzeitig erledigt werden können. Zweckmäßig ist die Vor ^¬ richtung auf einem Chip integriert. In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Fotodiode des Streulichtdetektors so angeordnet, dass sie außerhalb des auf den Streulichtdetektor auftreffenden Lichts, das die Aufnahmeeinheit mit den Test- zellen sowie das Substrat ungestreut durchdringt, liegt. Das hat den Vorteil, dass kein optischer Filter für das unge- streute Licht notwendig ist und dadurch der Aufbau sehr ein ^¬ fach und kostengünstig realisiert werden kann. In einer alternativen Ausgestaltung der Vorrichtung umfasst die zweite Messeinrichtung einen optischen Filter, der zwischen der Aufnahmeeinheit und dem Streulichtdetektor angeordnet ist. Insbesondere kann der optische Filter auf die Wel ^¬ lenlänge des von der Lichtquelle erzeugten Lichts abgestimmt sein, was eine Anordnung der Fotodiode in direkter Durchstrahlrichtung erlaubt. Vorteilhaft ist es, wenn die optische Dichte des optischen Filters vom Einfallswinkel des Lichts abhängig ist. Insbesondere kann der optische Filter ein Interferenzfilter sein. Zweckmäßig ist es, einen optischen Fil- ter dann zu verwenden, wenn die Fotodiode zentral in einem von an Testzellen gestreutem Licht erfassten Bereich des Streulichtdetektors liegt. Dann ist es vorteilhaft, wenn die Ausdehnung der Oberfläche der Fotodiode größer ist als der vom in die Aufnahmeeinheit einfallenden Licht erfasste Be- reich des Substrats und insbesondere größer als das Substrat.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Substrat austauschbar. Insbesondere kann die gesamte Aufnahmeeinheit austauschbar ausgeführt sein. Beispielsweise ist die Aufnahmeeinheit eine Mikrotiterplatte . Derartige Aus ^¬ gestaltungen der Vorrichtung haben den Vorteil, dass der Einsatz kostengünstiger Substrate möglich ist. Insbesondere Mikrotiterplatten sind als Massenware erhältlich. Austausch- bare Substrate oder austauschbare Aufnahmeeinheiten haben weiter den Vorteil, die Vorrichtung und damit vorgenommene Messungen zu vereinfachen. Auch wird ein höherer Durchsatz ermöglicht .

Alternativ kann die Aufnahmeeinheit als Mikrofluidkanal aus ^¬ gestaltet sein. Diese Ausgestaltung erlaubt eine Versorgung der Testzellen mit einer Nährlösung, was insbesondere über einen längeren Zeitraum der Messung vorteilhaft ist.

Zweckmäßig bildet die Aufnahmeeinheit einen Teil der ersten Messeinrichtung zur Zellmessung und das Substrat ist als Sensorelektrode ausgestaltet. Diese Ausgestaltung hat den Vor ^¬ teil, dass dieselben Testzellen gleichzeitig elektronisch oder elektrochemisch charakterisiert werden und mittels

Streulicht erfasst und überwacht werden können.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind die zweite Messeinrichtung und die Aufnahmeeinheit relativ zuein- ander verfahrbar. Somit ist ein Abrastern der gesamten Testzellen möglich. Großflächige Substrate ermöglichen einen hohen Durchsatz an Testzellen. Alternativ ist nur die Lichtquelle gegenüber einer festen Aufnahmeeinheit und einem fes ^¬ ten Streulichtdetektor verfahrbar. Der Streulichtdetektor kann segmentierte Fotodioden umfassen.

Vorteilhaft ist es, wenn die erste Messeinrichtung mindestens eine Elektrode zur elektrochemischen Analyse der Testzellen umfasst. Alternativ oder auch zusätzlich kann die erste Test- einrichtung mindestens eine ionenselektive Elektrode umfas ^¬ sen. Des Weiteren kann alternativ oder auch zusätzlich die erste Messeinrichtung mindestens eine Elektrode zur Impedanz ^¬ messung der Testzellen umfassen. In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung sind derartige Elektroden im Sub- strat der Aufnahmeeinheit integriert. Zum Beispiel kann das Substrat ein Testchip sein. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren 1 bis 4 der ange ^¬ hängten Zeichnung beschrieben: Figur 1 zeigt eine Seitenansicht einer Ausführungsform der

Vorrichtung,

Figur 2 zeigt eine Draufsicht der weiteren Ausführungsform der Vorrichtung,

Figur 3 zeigt eine Seitenansicht einer weiteren Ausführungs- form der Vorrichtung,

Figur 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Aufnahmeeinheit und des Streulichtdetektors sowie eine verfahr ^¬ bare Lichtquelle,

Figur 5 zeigt eine weitere Ausführungsform der Aufnahmeein- heit,

Figur 6 zeigt eine Seitenansicht von Testzellen auf einem

Substrat,

Figur 7 zeigt eine Draufsicht auf Testzellen auf einem Sub ^¬ strat,

Figur 8 zeigt eine Seitenansicht von Testzellen auf einem

Substrat und

Figur 9 zeigt eine Draufsicht auf Testzellen auf einem Sub ^¬ strat . Anhand von Ausführungsbeispielen wird die Erfindung näher vorgestellt. Es wird eine Vorrichtung zur Zellüberwachung bereitgestellt, die zwei Messeinrichtungen umfasst. Die erste Messeinrichtung dient zur Zellmessung und umfasst eine Aufnahmeeinheit 30 für eine Mehrzahl von Testzellen 2. Figur 1 zeigt die Aufnahmeeinheit 30 in Form eines Mikrofluidkanals , wie in der Draufsicht in Figur 2 gezeigt. Dieser weist min ^¬ destens einen Einlass 32 und einen Auslass 32 für das Testme ^¬ dium, die Testzellen 2, auf. Das transparente Substrat 31 ist mit einer ausreichend dichten Monolage von Testzellen 2 be- deckt wie sie besonders in Figur 7 deutlich zu erkennen ist. Die Ausführung der Aufnahmeeinheit 30 als Mikrofluidkanal er ^¬ laubt eine kontinuierliche Zuführung einer Nährlösung für die Testzellen 2. Figur 1 zeigt weiterhin einen Streulichtdetek- tor 50 mit einer einzelnen großflächigen Fotodiode 51. Die Draufsicht in Figur 2 zeigt, dass die Ausdehnung A der Foto ^¬ diode 51 größer ist als das von Testzellen 2 bedeckte Sub ^¬ strat 31. Die Seitenansicht 51 in Figur 1 zeigt, dass Aufnah- meeinheit 30 und Streulichtdetektor 50 horizontal angeordnet sind, die Aufnahmeeinheit 30 oberhalb des Streulichtdetektors 50. Oberhalb der Aufnahmeeinheit 30 befindet sich eine Licht ^¬ quelle 10. Die Lichtquelle 10 emittiert kohärentes monochro ^¬ matisches Licht. Zweckdienlich ist eine Laserlichtquelle. Die Seitenansicht in Figur 1 zeigt weiterhin senkrecht in die

Aufnahmeeinheit einfallendes Licht IIa, das nach der Streuung an den Testzellen 2 die Aufnahmeeinheit 30 durch das Substrat 31 verlässt. Das Substrat 31 ist so ausgeführt, dass es für Licht der Lichtquelle 10 durchlässig ist. Das gestreute Licht IIb verlässt die Aufnahmeeinheit und bildet einen Streulicht ^¬ kegel. Dieser wird von der ausreichend großflächigen Fotodio ^¬ de 51 des Streulichtdetektors 50 vollständig erfasst. Zwi ^¬ schen der horizontalen Anordnung von der Aufnahmeeinheit 30 oberhalb des Streulichtdetektors 50 befindet sich ein opti- scher Filter 4. Die optische Dichte des Filters ist abhängig vom Einfallswinkel des Lichts. Damit kann direkt transmit- tiertes Licht der Lichtquelle, das nicht an den Testzellen 2 gestreut wurde, herausgefiltert werden. Die Ausgestaltung der Aufnahmeeinheit 30 als Mikrofluidkanal erlaubt die Integrati- on der Vorrichtung auf einen Testchip. Alternativ ist innerhalb des Mikrofluidkanals ein In-vitro-Testchip integriert.

Figur 3 zeigt eine Seitenansicht einer weiteren Ausführungs ^¬ form der Erfindung. Dabei sind wieder die Aufnahmeeinheit 30, der optische Filter 4 sowie der Streulichtdetektor 50 horizontal übereinander angebracht. Oberhalb der Aufnahmeeinheit 30 ist eine Lichtquelle 10 angebracht, die einen gerichteten Lichtstrahl IIa mit definiertem Strahldurchmesser aussendet. Der Strahldurchmesser ist geringer gewählt als die Ausdehnung A einer einzelnen Fotodiode 51 des Streulichtdetektors 50.

Der Streulichtdetektor 50 weist eine Mehrzahl von Fotodioden 51 auf. Diese sind in einem regelmäßigen Raster auf dem

Streulichtdetektor 50 angebracht. In direkter Transmissions- richtung des Lichtstrahls liegt keine Fotodiode 51. Diese An ^¬ ordnung erlaubt den Einsatz kostengünstigerer optischer Filter 4 mit geringerer Filterwirkung. Die Aufnahmeeinheit um- fasst einen Ein- und Auslass 32 für die Testzellen 2, eine notwendige Nährlösung oder allgemein ein Testmedium. Die

Testzellen 2 bilden eine dichte Monolage auf dem Substrat 31. Das Substrat 31 ist ein transparenter Chip mit einem oder mehreren integrierten Sensoren, beispielsweise eine Clark- Elektrode, eine Elektrode zur pH-Wert-Messung sowie Interdi- gitalstrukturen zur Impedanzmessung zur Bestimmung der Adhe- renz der Testzellen 2.

Figur 4 zeigt eine weitere Ausführungsform der Erfindung, hier speziell verschiedene Ausführungsformen der Aufnahmeein- heit 30. Wiederum sind Aufnahmeeinheit 30 und Streulichtde ^¬ tektor 50 horizontal übereinander angeordnet. Oberhalb der Aufnahmeeinheit 30 befindet sich eine Lichtquelle 10, die verfahrbar ist. Die Lichtquelle 10 kann über das gesamte Sub ^¬ strat 31 geführt werden. Der Streulichtdetektor 50 kann eine einzelne großflächige Fotodiode 51 aufweisen, wie in Figur 1 und Figur 5 gezeigt, oder eine Mehrzahl segmentierter Fotodioden 51, wie in Figur 3 und Figur 4 gezeigt. Im Fall der seg ^¬ mentierten Fotodioden 51 ist der Strahldurchmesser des einfallenden Lichts, d.h. der vom einfallenden Licht erfasste Bereich B, geringer als die Ausdehnung A der Fotodioden 51, siehe Figur 2. Die Ausdehnung A der Fotodioden 51 ist unabhängig vom Lichtkegel so groß zu wählen, dass ausreichend viele streuende Zellen 2 erfasst sind. Die Aufnahmeeinheit 30 ist als Mikrotiterplatte ausgestaltet. Die Mikrotiterplatte, also die Aufnahmeeinheit 30 selbst, bildet somit auch das Substrat 31. Kommerzielle Mikrotiterplatten bieten unterschiedliche Wellformen an. Die Seitenansichten in den Figuren 4 und 5 zeigen Wells 33a mit ebenem Substratboden und Wells 33b, die halbkugelförmige Vertiefungen im Substrat 31 dar- stellen. Ein optischer Filter 4 ist zwischen der Aufnahmeeinheit 30 und dem Streulichtdetektor 50 angebracht. Der opti ^¬ sche Filter 4 liegt direkt auf dem Streulichtdetektor 50 auf. Die Aufnahmeeinheit 30 liegt wiederum direkt auf dem opti- sehen Filter 4 auf. Die als Mikrotiterplatte ausgeführte Auf ^¬ nahmeeinheit 30 ist austauschbar. Beispielsweise kann anstatt einer Bewegung der Lichtquelle 10 auch die Aufnahmeeinheit 30 und/oder der Streulichtdetektor 50 verfahren werden.

Figur 6 zeigt eine Seitenansicht, Figur 7 eine Draufsicht auf ein mit Testzellen belegtes Substrat 31. Konfluente Testzel ^¬ len 2a bilden eine dichte Monolage auf dem Substrat 31. Die Draufsicht in Figur 9 zeigt, dass abgerundete Zellen 2b, wie sie in Figur 8 dargestellt sind, hingegen keine dichte Mono ^¬ lage bilden.