Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Behandlungsmittel für Saatgut einkeimblättriger Kulturpflanzen enthaltend wenigstens einen Wirkstoff gewählt aus einem Pilzstamm aus der Gruppe der Fusarien sowie gegebenenfalls eine Trägersubstanz und/oder weitere Hilfsstoffe.

Parasitäre Unkräuter der Gattung Striga führen weltweit zu hohen Ertrags- und Qualitätsver- lusten. Insbesondere in der Subsaharazone führt der Befall von Mais (Zea mays) und Hirse (z.B. Sorghum spp.) mit Striga hermonthica jährlich zu Ertragsausfällen von ca. acht Millionen Tonnen (Gressel J., Hanafi A., Head G., Marasas W., Obilana A.B., Ochanda J., Soussi T.,

Tzotzos G., 2004: Major heretofore intractable biotic constraints to African food security that may be amenable to novel biotechnological solutions. Crop Protection, Vol. 23: 661-689.). Die- se Verluste wurden 2003 geschätzt. Seitdem dürfte die durch S. hermonthica verursachte Er- tragseinbuße noch deutlich gestiegen sein, was zu einer massiven negativen Beeinflussung des Lebens von etwa 300 Millionen Menschen durch die parasitäre Pflanze führt (Pennisi E., 2010:

Armed and dangerous. Science, Vol. 327: 804-805).

Trotz erheblicher Bemühungen durch den chemischen Pflanzenschutz und die Pflanzenzüch- tung sowie durch kulturtechnische Maßnahmen ist es bisher nicht gelungen, die weitere Aus- breitung des Unkrautes in dieser Region zu verhindern. Getroffene Maßnahmen sind beispiels- weise der Anbau von Sorten mit geringerer Anfälligkeit gegenüber S. hermonthica, der Einsatz des Herbizides Imazapyr an Imazapyr-resistentem Mais (IR-Mais) oder das Pull-Push-An- bauverfahren, bei dem die Leguminose Desmodium intortum zwischen die Maisreihen ausgesät wird.

Aus diesem Grund gab es Bestrebungen einen Welkekrankheitserreger von Striga, insbeson- dere Striga hermonthica, den Pilz Fusarium oxysporum, für die Bekämpfung des Unkrautes zu verwenden (Ndambi B., Cadisch G., Elzein A., Heller, A., 2011 : Colonization and control of Striga hermonthica by Fusarium oxysporum f. sp. strigae, a mycoherbicide component: An ana- tomical study. Biological Control, Vol. 58: 149-159). Leider konnten auch mit dem Welkekrank- heitserreger bisher keine kommerziellen Erfolge erzielt werden. Eine neuste Entwicklung auf diesem Gebiet, die den Pilz Fusarium oxysporum einsetzt, erscheint aber vielversprechend (Nzioki H., Oyosi F., Morris C.E., Kaya E., Pilgeram A.L., Baker C., Sands D.C., 2016: Striga Biocontrol on a Toothpick: A Readily Deployable and Inexpensive Method for Smallholder Farmers. Frontier in Plant Science, Vol. 7: Artikel 1121). Trotz einiger Erfolge besteht der wesentliche Nachteil des Verfahrens im hohen manuellen Aufwand der Anwendung. Bislang wird das mit dem Pilz bewachsene Substrat per Hand in die Pflanzlöcher eingebracht, unmittel- bar bevor diese mit dem Saatkorn belegt und mit Erde verschlossen werden. Bei Mais mit einer Pflanzenzahl von ca. 60.000 Pflanzen pro Hektar (Zahlen aus Kenia) mag eine solche Techno- logie noch anwendbar sein, nicht aber bei Hirse oder Reis, wo noch eine bedeutend höhere Pflanzenzahl pro Hektar angebaut wird. Als Lösung für dieses Problem wurde vorgeschiagen, den Pilz an das Saatgut anzubinden. Auch hier wurden bereits Versuche vorgenommen (Elzein A., Kroschel J., Leth L.; 2006: Seed treatment technology: An attractive delivery system for controlling root parasitic weed Striga with mycoherbicide. Biocontrol Science and Technology, Vol. 16: 3-26.), die bislang aber nicht zu einem kommerziellen Produkt führten. Die Ursache für den bislang geringen Erfolg lag einerseits in der Verwendung von Pilzstämmen, die eine zu ge- ringe Pathogenität gegenüber dem Unkraut aufwiesen und andererseits in einer zu geringen er- reichbaren Lagerstabilität des verwendeten Pilzes im Saatgutbehandlungsmittel.

Aus Dorah A. Oula, John M. Nyongesah, George Odhiambo, Samuel Wagai; The effectiveness of local strains of Fusarium oxysporium f. sp. strigae to control Striga hermonthica on local maize in western Kenya; Foodscience-nutrition; 2020:8.4352 ff. wurde die Wirksamkeit von fünf lokalen Fusarium oxysprium f. sp. strigae Stämmen FK1 , FK2, FK3, FK4 und FK5 untersucht, um Striga auf Maiskulturen zu kontrollieren. Hierbei wurde auf Basis von Gefährdungs- und In- fektionszahlen sowie des Maisertrags FK 5 als der effizienteste Stamm ermittelt.

Aus Muhammad Jamil, Boubacar A. Kountche and Salim Al-Babili; Curent progress in Striga management, Plant Physiology, Vol 185, 04, 2021 , S. 1339 -1352 werden unter anderem Mykroherbizide, wie einige Stämme von F. oxysporum beschrieben, welche große Mengen an Aminosäuren produzieren können, welche für Striga toxisch sind, nicht jedoch für die zu kultivierenden Pflanzen, wie z.B. Mais und Hirse.

Die vorliegende Erfindung zielt nun darauf ab, ein Behandlungsmittel für Saatgut einkeimblättri- ger Kulturpflanzen bereitzustellen, das sowohl eine hohe Wirksamkeit gegen Unkräuter der Gat- tung Striga, insbesondere Striga hermonthica, aufweist, als auch bei Umgebungsbedingungen langzeitlagerstabil ist.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist das erfindungsgemäße Behandlungsmittel für Saatgut einkeim- blättriger Kulturpflanzen im Wesentlichen dadurch gekennzeichnet, dass als ein Wirkstoff der Pilz Fusarium oxysporum f. sp strigae, DSM 33471 enthalten ist. Im Rahmen spezieller Untersu- chungen konnten in Kenia zur Gattung Fusarium gehörige Pilzstämme isoliert werden, die eine sehr hohe Pathogenität gegenüber Striga hermonthica aufwiesen. Bei diesen Stämmen gelang zusätzlich zur guten Pathogenität die Fähigkeit zu einer gesteigerten Aminosäure-Produktion zu selektieren. Bestimmte Aminosäuren, wie z.B. Leucin und Thyrosin haben eine spezifische herbizide Wirkung auf Pflanzen. (Fernandez-Aparicio M., Bernard A., Falchetto L, Marqet P., Chauvel B., Steinberg C., Morris C.E., Gibot-Leclerc S., Boari A.. Vurro M., Bohan D.A., Sands D.C., Reboud X., 2017: Investigation of Amino Acids as Herbicides for Control of Orobanche minor Parasitism in Red Clover. Front Plant Sei. Vol. 8: Artikel 842). Andere Aminosäuren, wie z.B. Methionin, fördern die Keimung von Strigasamen im Boden (Logan D.C., Steward G.R., 1991 : Role of ethylen in the germination of the hemiparsite Striga hermonthica. Plant Phyiol. Vol. 97, 1435 - 1438.).

Mittels beider Eigenschaften, der hohen Pathogenität und der Produktion von Aminosäuren, sind die Fusarium-Stämme ausgezeichnet zur biologischen Bekämpfung von Striga hermon- thica geeignet. Unter den selektierten Fusarium-Stämmen ist in nicht erwarteter Weise eine spezielle Mutante, nämlich Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 darüber hinaus ge- genüber dem Fungizid Captan WP50 (Wirkstoff Captan) resistent. Nicht nur die Resistenz ge- gen Captan WP50 sondern auch die Befähigung von Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 große Mengen an Sporen, nämlich Konidien und Chlamydosporen, in einem Substrat zu bilden, erlauben seinen Einsatz in einem Behandlungsmittel für Saatgut einkeimblättriger Kultur- pflanzen.

Eine besonders effiziente Behandlung von Saatgut gelingt, wenn, wie dies einer Weiterbildung der Erfindung entspricht, das Saatgutbehandlungsmittel so weitergebildet ist, dass als Gesamt- menge der Wirkstoffe 1 x 10 ⁵ bis 1x 1O ¹⁰ Kolonie bildende Einheiten von Pilzstämmen aus der Gruppe der Fusarien pro Gramm Behandlungsmittel enthalten sind und dass wenigstens 1 x 10 ⁵ und höchstens 1 x 10 ¹⁰ , vorzugsweise 1 x 10 ⁶ bis 1 x 10 ⁹ Kolonie bildende Einheiten des

Pilzes Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 pro Gramm Behandlungsmittel enthalten sind. Derartige Wirkstoffkonzentrationen ermöglichen nicht nur eine effiziente Bekämpfung von Striga, insbesondere Striga hermonthica, sondern es gelingt mit derartigen Wirkstoffkonzentra- tionen, insbesondere der bevorzugten Anzahl von Kolonie bildenden Einheiten überraschender- weise eine Langzeit lagerstabile Zusammensetzung bereitzustellen. Die Lagerung eines derarti- gen Behandlungsmittels wird vorzugsweise in einem Kühlschrank bei Temperaturen zwischen 4 und 15 °C vorgenommen, jedoch ist das Behandlungsmittel auch bei Umgebungstemperatur von 25 bis 35 °C über mehrere Monate ohne nennenswerten Aktivitätsverlust lagerbar. Das er- findungsgemäße Sporenpulver kann über ein Jahr im Kühlschrank gelagert werden, ohne dass sich die in ihm vorhandene Zahl Kolonie bildender Einheiten deutlich verringert und seine aus- gezeichnete Wirkung verloren geht. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung sind als Kolonie bildende Einheiten wenigstens eine Gruppe gewählt aus Konidien, Chlamydosporen oder Myzelresten von Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 enthalten. Das so weitergebildete Behandlungsmittel gemäß der Erfin- dung führte überraschenderweise zu einer guten Lagerstabilität des Präparates. So ist es möglich, das Saatgut, abhängig von der Pflanzenart, mit einer überraschend geringen Menge einer Pilzsporenformulierung pro Kilogramm zu behandeln. Aus der Literatur bekannte Versu- che zur Behandlung von Saatgut mit Pilzmaterial erforderten regelmäßig wesentlich höhere Auf- wandmengen. So verwendeten z.B. Ciotola et al. (2000) 20 g eines Sporenpulvers für die Be- handlung von nur 1000 Saatkörnern von Sorghum-Hirse (Ciotola M., DiTommaso A., Watson A.K., 2000: Chlamydospore Production, Inoculation Methods and Pathogenicity of Fusarium oxysporum M12-4A, a Biocontrol for Striga hermonthica. Biocontrol Science and Technology, Vol. 10: 129-145.). Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Pilzstammes ist es überdies überraschender Weise gelungen, ein Saatgutbehandlungsmittel herzustellen, das eine sehr gute Wirkung, mit einer Captan-Resistenz, einer hohen Lagerstabilität und einer sehr geringen Aufwandmenge verbindet. Um trotz der möglichen geringen Einsatzmengen ein gut dosierbares Saatgutbe- handlungsmittel zur Verfügung zu haben, ist das erfindungsgemäße Behandlungsmittel für Saatgut einkeimblättriger Kulturpflanzen, im Wesentlichen so weitergebildet, dass weiterhin als Träger wenigstens ein fester pulverförmiger Träger gewählt aus der Gruppe der Zeolithe, Ver- miculite, Diatomeen-Erden, Kaoline, Bentonite, Torfe, Kleien, vorzugweise, Haferkleie, Weizen- kleie, Mehle von Bambusstauden, Holzmehle, insbesondere Laubholzmehl, vorzugsweise Bu- chenholzmehl oder Eukalyptusmehl eingesetzt wird. Unter den Trägermaterialien sind hierbei die organischen Trägermaterialien bevorzugt, da sie nicht nur für eine gleichmäßige Verteilung des Wirkstoffes in dem Saatgutbehandlungsmittel dienen, sondern gleichzeitig dazu dienen können, das Auskeimen des Pilzes nach der Aussaat zu unterstützen, damit dieser so vollstän- dig wie möglich die in der Umgebung der Saatkörner vorhandenen Keimlinge von Striga her- monthica befallen kann. Um eine besonders gute Haftfähigkeit des Saatgutbehandlungsmate- rials an der Oberfläche des Saatguts und somit eine unmittelbare Wirkung der Zusammenset- zung erreichen zu können, ist die Erfindung dahingehend weitergebildet, dass der Träger eine mittlere Korngröße von kleiner 500 pm, vorzugsweise kleiner als 250 pm aufweist. insbesondere bei Einsatz von organischen Trägermaterialien in dem Saatgutbehandlungsmate- rial, ist die Erfindung so weitergebildet, dass als Träger ein Holzmehl, insbesondere Buchen- holzmehl mit einer Korngrößenverteilung zwischen 200 pm und 20 pm eingesetzt ist. Eine Korn- mggßenverteilung zwischen 200 μ und 20 - des Trägers ermöglicht nicht nur den Erhalt einer homogenen Mischung aus Träger und Wirkstoff, sondern vor allem eine feine Verteilung des Pilzes Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 am Saatkorn, wo er nach Aussaat mit seinen Pilzhyphen auskeimt und sich mittels dieser Hyphen in die Umgebung des behandelten Saatkorns im Boden ausbreitet. Die in der Umgebung des Saatkornes vorhandenen keimenden Samen und Keimlinge von Striga hermonthica werden befallen oder durch die Wirkung der Ami- nosäure abgetötet und sind somit nicht mehr in der Lage, die Wurzeln der aus dem Saatkorn auskeimenden anfälligen Pflanze zu befallen. Schließlich kann das Behandlungsmittel weitere Hilfsstoffe gewählt aus: Bindemitteln, Farbstoffen, Pflanzenschutzmitteln, Stoffen zur Pflanzen- Stärkung, Stoffen zur Wachstumsförderung oder Beschichtungsmittel enthalten. Ein so ausge- bildetes Sporenpulver kann mehr als ein Jahr, vorzugsweise im Kühlschrank bei Temperaturen zwi sehen 4 und 15 °C gelagert werden, ohne dass sich die in ihm vorhandene Zahl Kolonie bildender Einheiten deutlich verringert und seine ausgezeichnete Wirkung verloren geht. Gemäß einer Weiterbildung der Erfindung kann das Behandlungsmittel pro Kilogramm 1 x 10 ⁸ bis 1 x 10 ¹³ , vorzugsweise 1 x 10 ⁹ bis 1 x 10 ¹² Kolonie bildende Einheiten des Pilzes Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 aufweisen und der Rest aus 40 bis 100 % Buchenholz- mehl als Trägermaterial sowie gegebenenfalls 5 bis 60 % eines Bindemittels und/oder 5 bis 60 % eines Farbstoffs besteht. Es ist hierbei zu beachten, dass, sollten die sonstigen Bestandteile, wie Farbstoffe und Bindemittel in dem Behandlungsmittel, vorhanden sein, diese in Mengen von

5 bis etwa 60 % beigemischt werden müssen, da der Pilz Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 und das Trägermaterial nur in sehr geringen Aufwandsmengen von etwa 1 kg bis 20 kg pro Tonne Saatgut angewandt werden. Nur sehr kleine eingesetzte Mengen an Bindemit- tel und/oder Farbstoff wären im vorliegenden Fall wirkungslos. Es ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass, wenn sowohl Bindemittel als auch Farbstoff enthalten sind, beide Hilfsstoffe zusammen eine Menge von 60 % der Gesamtmenge des Behandlungsmittels nicht übersteigen.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand von 8 Beispielen näher erläutert. Beispiel 1

Isolation von Fusarium oxysporum f. sp, strigae von welkenden Striga-Pflanzen

Es wurden welkende Striga-Pflanzen von Mais und Hirsefeldern entnommen und in Papiertüten gelagert. Aus dem Stängelbereich der Pflanzen wurden ca. 4 cm lange Segmente geschnitten und 5 min in einer 1 ,2%igen Natriumhypochlorid-Lösung oberflächlich sterilisiert. Danach wur- den die Segmente gründlich in sterilem Leitungswasser gespült und ihre Enden mit einem steri- len Skalpell abgeschnitten. Die so behandelten Segmente wurden sodann auf ein semiselekti- ves Nash & Snyder Agarmedium (Nash S.M., Snyder W.C. , 1962: Quantitative estimation by plate counts of propagules of the bean rot Fusarium in field soil. Phytopathology 52, 567 - 572) ausplattiert und bei 25 °C inkubiert, bis Pilzmyzel aus den Enden der Stängelsegmente aus- wuchs. Sodann wurden mit dem Ziel, die Kulturen zu reinigen, kleine Agar-Blöcke aus dem Randbereich der auswachsenden Kolonien ausgeschnitten und auf ein frisches Nash & Snyder Medium überführt. Diese Prozedur wurde einmal wiederholt. Aus dem Randbereich der dann auswachsenden Kolonien wurden erneut kleine Agarstücke ausgeschnitten und auf Wasser- agar überführt. Nach 2 Wochen wurden die Agarplatten mit sterilem Leitungswasser über- schichtet und die entstandenen Konidien mit Hilfe eines Drigalski-Spatels abgerieben und so in eine Suspension überführt. Daraus wurden einzelne Konidien entweder auf ein Nelkenblatt- Agarmedium (CLA) oder auf ein Kartoffel-Dextrose-Agarmedium überführt. Kolonien von Fusarium oxysporum wurden bei dem Nelkenblatt-Agarmedium anhand der Konidienmorpholo- gie und bei dem Kartoffel-Dextrose-Agarmedium anhand der typischen Verfärbung der Pilzkolo- nie identifiziert. Die auf dem Nelkenblatt-Agarmedium gebildeten Fusarium-oxysporum-Kolonien bildeten die für diese Art charakteristischen Makro- und Mikrokonidien sowie Chlamydosporen.

Die Fusarium-oxysporum-Kolonien auf dem Kartoffel-Dextrose-Agarmedium zeichneten sich durch eine typische lila Verfärbung des Myzels und des Agarmediums aus.

Es konnten mit diesem Versuch insgesamt 48 Einzeisporenisolate von F. oxysporum gewonnen werden.

Beispiel 2

Mikrokonidien-Suspension als Voraussetzung für die Herstellung eines Fusarium-oxysporum- Sporenpulvers 200 ml Kartoffel-Dextrose-Brühe wurden in einen 1 L Erlenmeyerkolben gegeben. Dieser wurde mit einem Wattestopfen und Aluminiumfolie verschlossen und sodann autoklaviert. Die abge- kühlte Brühe wurde mit 8 mit Fusarium oxysporum f. sp. strigae bewachsenen Agar-Stückchen (ca. 6 x 6 mm) aus dem Randbereich einer auf einem PDA-Nährboden wachsenden Pilzkolonie beimpft.

Die Kultur wurde danach bei 90 U/min 7 Tage bei 26 °C geschüttelt. Als Ergebnis der Schüttel- kultur wurden ca. 2,5 x 10 ⁷ Mikrokonidien pro Milliliter ausgezählt.

Beispiel 3 Herstellung eines Produktmusters Eine Kristallisierschale wurde mit 20 g Holzmehl aus Buche mit einer Körnung von ca. 40 - 120 pm, wie z.B. das Produkt „Lignocel® HB 120“ der Firma J. Rettenmaier & Söhne GmbH & Co. KG, sowie 40 ml eines wässrigen Erdbodenextraktes gefüllt. Die beiden Substanzen wurden gut miteinander verrührt. Die mit einer Aluminiumfolie geschlossene Kristallisierschale wurde sodann in einem Autoklaven bei 121 °C 15 min sterilisiert.

Die zuvor hergestellte Mikrokonidiensuspension (Beispiel 2) war zwischenzeitlich ca. 24 h im Kühlschrank aufbewahrt worden. Während dieser Zeit setzen sich die Sporen am Boden ab. Der Überstand (ca. 100 ml) wurde abgegossen, sodass die Sporenkonzentration sich auf ca. 6 x 10 ⁷ Konidien pro Milliliter erhöhte. Von dieser Suspension wurden 20 ml in die mit dem Holz- mehl und dem wässrigen Erdbodenextrakt gefüllte Kristallisierschale getan und mit Hilfe eines sterilen langstieligen Löffels gut mit dem Holzmehl-Bodenextrakt-Gemisch verrührt. Es entstand ein lockeres handfeuchtes Gemisch. Dieses wurde in der geschlossenen Kristallisierschale in einen Brutschrank gestellt und 14 Tage bei 25 °C inkubiert.

Nach der Inkubation wurde das Substrat im Laminarstrom einer Sterilwerkbank bei ca. 23 °C sieben Tage in der nun geöffneten Kristallisierschale getrocknet. Während des Trocknungspro- zesses wurde das Substrat täglich mit einem sterilen langstieligen Löffel gründlich gemischt, um die Trocknung möglichst gleichmäßig zu gestalten. Nach der Trocknung war ein feines homoge- nes Pulver entstanden.

Die Bestimmung der Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (cfu) pro Gramm erfolgte unmittel- bar nach der Trocknung. Dazu wurden je 100 mg des entstandenen Pulvers in 1000 ml sterilem Leitungswasser in einem Becherglas suspendiert und zwei Minuten mit Hilfe eines Ultra Turrax der Firma IKA®-Werke GmbH & Co. KG homogenisiert. Noch während des Homogenisierungs- prozesses wurden mit Hilfe einer Varipipette der Firma Eppendorf SE 100 μl der entstandenen Suspension aus dem Becherglas entnommen und auf einem PDA-Nährboden ausgestrichen. Nach 24 Stunden war ein deutliches Myzelwachstum auf der Oberfläche des Nährbodens zu er- kennen, so dass die Pilzkolonien bzw. keimenden cfu unter dem Mikroskop ausgezählt werden konnten. Nach Auszählung und Umrechnung ergab sich eine Zahl von 4,1 x 10 ⁷ cfu pro Gramm Substrat.

Mikroskopische Untersuchungen des Pulvers ergaben, dass große Mengen an Konidien und Chlamydosporen im Produkt vorhanden waren. Beispiel 4

Wirkung eines aus Striga isolierten Pilzstammes auf Striga hermonthica

Das im Beispiel 3 beschriebene Produkt wurde mit Hilfe einer Zuckerlösung an Maissaatgut an- gebunden. Es wurden je Kilogramm Maissaatgut drei Gramm Sporenpulver verwendet. Das Pulver hatte eine Konzentration von 4,1 x 10 ⁷ cfu pro Gramm. Es wurden insgesamt 8 Versuche in 2 verschiedenen Bezirken in Kenia durchgeführt. Die Versuche, die von an den Versuchs- standorten ansässigen Landwirten durchgeführt wurden, bestanden aus je einer behandelten und einer unbehandelten Parzelle von je 100 m ² . Die Versuchsstandorte können wie folgt spezi- fiziert werden: • Homa Bay (4 Landwirte)

• Migori (4 Landwirte)

Dabei handelte es sich in allen Fällen um hochgradig mit Striga hermonthica verseuchte Flä- chen. Die Versuchsparzellen wurden in der kurzen Regenzeit 2020 im September angelegt und im Januar abgeerntet. Im Dezember wurde die Zahl der voll entwickelten Striga-Pflanzen pro Parzelle ermittelt. Dabei wurden nur die Pflanzen berücksichtigt, die bereits Samenkapseln ge- bildet hatten. Die Ergebnisse der Auszählung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Saatgutbehand- lung führte zu einer Reduzierung des Striga-Befalls.

Die Kornerträge pro Parzelle wurden im Januar ermittelt. Es wurden die in Tabelle 2 dargestell- ten Erträge erzielt.

Tabelle 1 : Einfluss der Behandlung von Maissaatgut mit einem Pilzpulver, enthaltend die cfu eines aus Striga hermonthica isolierten Pilzstammes, auf die Anzahl der Pflanzen des parasitä- ren Unkrautes Striga hermonthica

*) Unterschiede im Bekämpfungserfolg zwischen den jeweils unbehandelten und behandelten Parzellen eines Standortes sind bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % statistisch signifi- kant, wenn die Zahlen der jeweils ermittelten Pflanzen durch unterschiedliche Buchstaben ge- kennzeichnet sind. Tabelle 2: Einfluss einer Saatgutbehandlung mit einem Pilzpulver, enthaltend die cfu eines aus Striga hermonthica isolierten Pilzstammes, auf den Maiserträge bei starker Verseuchung der Versuchsparzellen mit Striga hermonthica *) Ertragsunterschiede zwischen den jeweils unbehandelten und behandelten Parzellen eines

Standortes sind bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % statistisch signifikant, wenn die jeweiligen Ertragswerte durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet sind.

Beispiel 5 Selektion eine Fusarium -oxysporum-Stammes mit einer erhöhten Aminosäure-Produktion

Zur Selektion von Fusarium-oxysporum-Stämmen mit einer erhöhten Aminosäureproduktion können Aminosäure-Analoga verwendet werden (Sands C.D., Pilgram A.L., 2009: Methods for selecting hypervirulent biocontrol agents of weed: why and how. Wiley Interscience, https://onlinelibrarv.wiley.com/action/doSearch?AIIField=10. 1002%2Fps.1739). Diese Methode wurde verwendet, um die Produktion der Aminosäuren Methionin, Leucin und Tyrosin durch die gewonnenen Einsporisolate (Beispile 1) deutlich zu erhöhen und ist hier beispielhaft anhand der Aminosäure Methionin beschrieben.

Ein Czapek-Dox Agar (Difco, St Louis, MO) wurde mit Ammoniumsulfat (0,5 g/L), Uracil (20 mg/L), Thiamin (4 mg/L) und 100 mg/L von pulverisierten Multivitamintabletten ergänzt. Das Agarmedium wurde in 90 mm Petrischalen gegossen. Nach Abkühlung wurden 100 μl einer Fusarium-oxysporum-Konidiensuspension (ca. 1 x 10 ⁶ cfu pro Platte) mit Hilfe eines Drigalski- Spatels auf der Oberfläche des Agarmediums ausplattiert. Nach Abtrocknung der Agaroberflä- che wurde aus der Mitte des Mediums mit Hilfe eines sterilen Korkbohrers ein Agarzylinder (Durchmesser 6 mm) ausgestochen, so dass ein zylindrisches Loch entstand. In dieses wurden 0,1 ml einer sterilen Selenomethionin-Lösung gefüllte. Die Konzentration der Lösung betrug 1000 ppm. Selenomethionin ist ein Analogon der Aminosäure Methionin. Die Platten wurden dann 4 Stunden unter dem Laminarstrom einer Sicherheitswerkbank inkubiert. Danach wurden erneut 0,1 ml der Selenomethionin-Lösung in die zylindrische Vertiefung gefüllt, bevor die Plat- ten bei 28 °C in einem Brutschrank inkubiert wurden. Um die zylindrische Vertiefung herum ent- stand eine Hemmzone, in der, wenn überhaupt, nur sehr vereinzelt Pilzwachstum zu verzeich- nen war. Lediglich einzelne Kolonien konnten detektiert werden. Es wurde angenommen, dass es sich bei diesen um Mutanten mit einer erhöhten Methionin-Produktion handelt. Insgesamt wurden 18 solcher Kolonien auf insgesamt 50 Petrischalen in unterschiedlichen Abständen von der zylindrischen Vertiefung in der Mitte der Petrischale gefunden. Je dichter die jeweilige Kolo- nie an der zylindrischen Vertiefung wuchs, desto höher sollte die Methionin-Produktion der Mu- tante sein. Die so erzeugten Kolonien wurden entnommen und auf Kartoffel-Dextrose-Agar wei- ter kultiviert. Der Nachweis einer verstärkten Methionin-Produktion erfolgte mit Hilfe eines spe- ziellen Bakterienstammes (Leuconostoc mesenteroides, ATCC 4043) der für Methionin auxo- troph ist. Der Bakterienstamm kann sich daher auf einem Methionin-freien Agarmedium nicht entwickeln. Ein Bakterienwachstum war nur in Anwesenheit einiger der selektierten Fusarium- oxysporum-lsolate nachweisbar, von denen daher angenommen werden musste, dass sie Methionin in das Agarmedium ausscheiden. Dies konnte bei 13 der 18 neu gewonnenen Isolate beobachtet werden. Damit wurde der Beweis erbracht, dass es sich bei den selektierten Isola- ten tatsächlich um Mutanten handelt, die verstärkt Methionin in das Agarmedium ausscheiden.

Mit den selektierten Fusarium-oxysporum-\so\ater\ wurden weitere 4 Selektionszyklen durchge- führt, wobei die Konzentration der Selenomethionin-Lösung jeweils verdoppelt wurde.

Am Ende des Selektionsprozesses wurden 3 neue Fusarium-oxysporum-Siämme ausgewählt, bei denen eine besonders hohe Methionin-Produktion nachgewiesen werden konnte.

Beispiel 6

Selektion eines Isolates mit einer erhöhten Captan-Resistenz

Fünf Captan-haltige Kartoffel-Dextrose-Agarmedien wurden durch die Zugabe von 0,04; 0,1; 0,25; 0,6 und 1 ,5 g/L Captan 50WP zubereitet. Zunächst wurde das Medium mit der geringsten

Captan-Konzentration verwendet. Jeweils 25 ml davon wurde in 90 mm Petrischalen gegossen. Nach Abkühlung wurden mit Hilfe eines Drigalski-Spatels 100 pl einer Fusarium-oxysporum- Konidiensuspension (ca. 1 x 10 ⁶ cfu pro Platte) der zuvor selektierten (siehe Beispiel 5) Amino- säure-produzierenden Fusarium-oxysporum-Stämme auf der Oberfläche des Agarmediums ausplattiert. Es wurden 10 Petrischalen je Stamm verwendet

Nach 7 Tagen wurden vereinzelt Pilzkolonien auf der Oberfläche des Agarmediums sichtbar, von denen angenommen werden musste, dass Sie bei der verwendeten Captan-Konzentration entwicklungsfähig sind, also bereits einen gewissen Grad der Resistenz gegenüber dem Fungi- zid erreicht haben. Diese wurden mit Hilfe eines sterilen Skalpells abgenommen und auf einem identischen Medium in anderen Petrischalen weiter kultiviert. Die selektierten Isolate wurden dann unter Verwendung der gleichen Methode auf das Medium mit der nächsthöheren Captan- Konzentration überführt. Erneut konnten Kolonien gefunden werden, die auf dem Captan-halti- gen Medium wuchsen. Die daraus gewonnenen Pilzisolate wurden weiterkultiviert und erneut dem Selektionsprozess unterzogen. Dies wurde bis zur Erreichung einer Captan-Konzentration von 0,75 mg/L Agarmedium oder 1 ,5 mg/L Agarmedium Captan 50WP fortgeführt (das Produkt

Captan 50WP enthält 50 % des Wirkstoffes Captan). Von diesem Medium konnte noch ein Iso- lat gewonnen werden, das die interne Bezeichnung DSSN 6 erhielt. Dieses wurde bei der DSMZ Braunschweig unter der Stammbezeichnung DSM 33471 hinterlegt. Beispiel 7

Laqerstabilität

Es wurde ein Produktmuster aus dem Stamm DSM 33471 hergestellt wie in Beispiel 3 beschrie- ben. Die Konzentration betrug 5,2 x 10 ⁷ cfu pro Gramm. Je 10 g des Produktes wurden in Alu- minium beschichtete Plastiktüten verschweißt und im Anschluss daran entweder im Brutschrank bei 25 °C, im Kühlschrank bei 5 °C oder im Gefrierschrank bei -10 °C gelagert. Die Anzahl der noch keimungsfähigen Einheiten pro Gramm Produkt wurde nach 3, 6, 9 und 12 Monaten be- stimmt. Das Ergebnis der Untersuchung ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3: Lagerstabilität eines Pilzsporenpulvers, hergestellt unter Verwendung des Pilzstam- mes DSM 33471 , bei einer Ausgangskeimfähigkeit von 5,2 x 10 ⁷ cfu/g und Lagerung bei ver- schiedenen Temperaturen

Es konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass das Produkt bei Lagerung im Kühi- schrank (+5 °C) und bei Lagerung im Gefrierschrank (-10 °C) eine sehr gute Lagerstabilität in Bezug auf die Keimfähigkeit der formulierten pilzlichen cfu besitzt.

Beispiel 8

Wirkung des Pilzstammes DSM 33471 auf Striga hermonthica Das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Pilzstammes hergestellte Produkt wurde mit Hilfe einer Zuckerlösung an Maissaatgut angebunden. Es wurde je Kilogramm Maissaatgut ein Gramm Sporenpulver verwendet. Das Pulver hatte eine Keimfähigkeit von 5,2 x 10 ⁷ cfu pro Gramm. Es wurden insgesamt 17 Versuche in 4 verschiedenen Bezirken in Kenia durchgeführt. Die Versuche, die von an den Versuchsstandorten ansässigen Landwirten durchgeführt wur- den, bestanden aus je einer behandelten und einer unbehandelten Parzelle von je 100 m ² . Die Versuchsstandorte können wie folgt spezifiziert werden:

Bungoma (6 Landwirte)

Kakamega (5 Landwirte)

Siaya (4 Landwirte)

Vihiga (2 Landwirte) Dabei handelte es sich in allen Fällen um hochgradig mit Striga hermonthica verseuchte Flä- chen. Die Versuchsparzellen wurden in der langen Regenzeit 2021 im März angelegt und im August abgeerntet. Im Juni wurde die Zahl der voll entwickelten Striga-Pflanzen pro Parzelle er- mittelt. Dabei wurden nur die Pflanzen berücksichtigt, die bereits Samenkapseln gebildet hatten. Die Ergebnisse der Auszählung sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Saatgutbehandlung führte zu einer deutlichen Reduzierung des Striga-Befalls.

Die Kornerträge pro Parzelle wurden im August ermittelt. Es wurden die in Tabelle 5 dargestell- ten Erträge erzielt. Tabelle 4: Einfluss der Behandlung von Maissaatgut mit einem Pilzpuiver, enthaltend die cfu des Pilzstammes Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 , auf die Anzahl der Pflanzen des parasitären Unkrautes Striga hermonthica

*) Unterschiede im Bekämpfungserfolg zwischen den jeweils unbehandelten und behandelten Parzellen eines Standortes sind bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % statistisch signifi- kant, wenn die Zahlen der jeweils ermittelten Pflanzen durch unterschiedliche Buchstaben ge- kennzeichnet sind. Tabelle 5: Einfluss einer Saatgutbehandlung mit einem Pilzpulver, enthaltend die cfu des Pilzstammes Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 , auf die Maiserträge bei starker

Verseuchung der Versuchsparzellen mit Striga hermonthica *) Ertragsunterschiede zwischen den jeweils unbehandelten und behandelten Parzellen eines

Standortes sind bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % statistisch signifikant, wenn die je- wieligen Ertragswerte durch unterschiedliche Buchstaben gekennzeichnet sind.

Durch die Behandlung des Maissaatgutes mit dem Pilz Fusarium oxysporum f. sp. strigae, DSM 33471 konnte an allen Standorten ein deutlich erhöhter Maisertrag pro Parzelle erzielt werden.

Die Unterschiede waren an 3 von 4 Standorten statistisch signifikant. Der erfindungsgemäße Pilzstamm hatte eine höhere Wirkung als das in Beispiel 4 getestete Pilzisolat.