MATERIAU BIOLOGIQUE IMPREGNE D'UNE SOLUTION COMPRENANT DES EXOSOMES

[0001] La présente invention concerne le domaine des matériaux biologiques imprégnés d'exosomes et leurs utilisations dans des traitements thérapeutiques.

[0002] Les exosomes sont une forme de vésicules extracellulaires d'un diamètre compris entre 30 et 100 nm. Ils sont entourés d'une bicouche lipidique et flottent à une densité de 1,13-1,19 g/ml dans des gradients de saccharose. Des vésicules présentant les caractéristiques des exosomes ont été isolées à partir de multiples fluides corporels différents, notamment le sperme, le sang, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique, le liquide d'ascite, le liquide céphalo-rachidien ou la bile. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses recherches ont été effectuées sur les exosomes en tant que mode de communication intercellulaire puisque les exosomes sont sécrétés par divers types de cellules, y compris les cellules souches. Certaines études indiquent que les cellules souches mésenchymateuses sécrètent des exosomes in vitro et que ces exosomes possèdent des propriétés thérapeutiques.

[0003] Les exosomes contiennent de nombreuses protéines ou acides nucléiques d'intérêt tels que des facteurs de croissance, des cytokines, des protéines de choc thermique (HSP), des acides aminés, des acides nucléiques (ADN, ARN), des métabolites, enzymes etc. Ils comprennent également des protéines membranaires pouvant agir comme récepteurs/ligands dans différentes voies de signalisation cellulaire.

[0004] Dans la publication Bakhtyar et al. Stem Cell Research & Therapy (2018) 9 :193 il est décrit que des exosomes issus de cellules mésenchymateuses présentes dans la gelée de Wharton possèdent des propriétés bénéfiques sur la cicatrisation.

[0005] De nombreuses autres applications thérapeutiques des biothérapie vésiculaires sont notamment listées dans la publication Aubertin et la médecine/science 2021 ;37 : 1146-57, qui décrit de plus les défis actuels liés aux moyens d'administrations des vésicules extracellulaires, et en particulier des exosomes, les méthodes actuelles consistant en l'injection du sécrétome des cellules d'intérêt, ces technique étant cependant limitées par la demi-vie extrêmement courte des vésicules extracellulaires dans la circulation.

[0006] De la même façon, la demande de brevet US2020/397945 divulgue une formulation comprenant un matériau biologique sous forme hydratée, notamment de la gelée de Wharton, et des exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses, pour une administration dans le traitement des dommages des structures cardiaques. Ladite formulation est administrée par cathéter, injection ou par l'intermédiaire d'une prothèse. Dans cette demande, le matériau biologique étant simplement juxtaposé avec les exosomes, il ne permet donc pas la capture et la libération prolongée desdits exosomes.

[0007] La demande de brevet US2018/228848 divulgue une composition biologique comprenant un mélange de composés non cellulaires, notamment des exosomes, issus de tissus placentaires pour une administration thérapeutique. La méthode selon cette demande ne permet cependant pas d'obtenir moyen d'administration des exosomes qui n'étaient pas présents dans le tissu placentaire de départ. Elle ne permet pas non plus de disposer d'un moyen d'administration à libération prolongée des exosomes.

[0008] La demande de brevet W02020/231702 divulgue une composition comprenant des cellules différenciées, un matériau adhésif sous forme hydratée et des exosomes pouvant provenir de cellules mésenchymateuses. Dans cette demande, les exosomes sont retenus à la surface du matériel adhésif et non pas imprégnés à l'intérieur de celui-ci. La composition doit ensuite être formulée avec des excipients pharmaceutiques et/ou cosmétiques avant application. [0009] La demande de brevet W02017/140914 déposée par la demanderesse divulgue un procédé de préparation d'un matériau d'allogreffe formant une membrane viro-inactivée, lyophilisée et stérile issue de tissus placentaires de mammifère. Elle ne divulgue pas de matériaux imprégnés d'une solution comprenant des exosomes ni de moyens de les administrer.

[00010] Il existe donc un intérêt pour la mise au point de nouvelles formes d'administration améliorées de ces exosomes. De plus, il existe un besoin de disposer de nouvelles formes d'administration à libération prolongée, permettant de réduire la fréquence d'administration et/ou d'éviter les concentrations trop élevées dans un court laps de temps.

[00011] La demanderesse a mis en évidence qu'en présence d'un matériau biologique hydraté, la mise en contact avec une solution comprenant des exosomes ne permet pas l'imprégnation du matériau biologique par ladite solution.

[00012] Ainsi, aucun matériau biologique de l'art antérieur n'est imprégné d'une solution comprenant des exosomes. [00013] La demanderesse a réussi à mettre au point un procédé d'imprégnation d'un matériau biologique lyophilisé sans dégradation du matériau biologique. La lyophilisation permet d'éliminer l'eau liée dans le matériau biologique et rend ainsi possible l'absorption et l'imprégnation de la solution comprenant des exosomes. En particulier, la lyophilisation permet d'éliminer l'eau retenue par les protéoglycanes du matériau biologique et l'imprégnation dans ce réseau de protéoglycanes.

[00014] De plus, le procédé d'imprégnation mis au point par la demanderesse présente l'avantage de permettre également l'imprégnation des tissus décellularisés ou dévitalisés. En raison de la faible porosité des tissus dévitalisés, l'imprégnation de ces tissus constituent un véritable défi comme cela est décrit par DUBUS M, et al. (Antibacterial and Immunomodulatory Properties of Acellular Wharton's Jelly Matrix. Biomedicines vol. 10,2 227. 21 Jan. 2022).

[00015] Le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention permet donc de disposer d'une forme d'administration des exosomes utilisable en thérapie.

[00016] Ce matériau biologique imprégné présente également une cinétique de relargage des exosomes inédite, rendant ledit dispositif particulièrement intéressant pour des applications thérapeutiques. En effet, le matériau biologique imprégné mis au point par la demanderesse constitue un réservoir d'exosomes permettant une libération progressive et prolongée desdits exosomes après l'administration.

[00017] Le matériau biologique imprégné selon la présente invention présente également l'avantage de pouvoir être utilisé directement en thérapeutique, c'est à dire sans nécessiter une étape de formulation ou de préparation supplémentaire.

[00018] La demanderesse a notamment réussi à imprégner avec des exosomes des matériaux issus de placenta et/ou issus de cordon ombilical, notamment de la membrane amniotique ou de gelée de Wharton, possédant eux même des propriétés biologiques d'intérêt.

[00019] La membrane chorioamniotique, qui sépare le fœtus de l'endomètre de la mère chez les mammifères, inclut la membrane amniotique, ou amnios, et la membrane choriale, ou chorion. Ces deux membranes sont reliées par une membrane tissulaire spongieuse, aussi appelée couche spongieuse, constituée entre autres de collagène et de protéoglycanes, la membrane tissulaire spongieuse comportant des ponts protéiques, attachés de part et d'autre à l'amnios d'une part, et au chorion, d'autre part.

[00020] La membrane amniotique est la couche la plus interne de la membrane chorioamniotique. Elle a pour rôle de protéger le fœtus et de maintenir autour de lui le liquide amniotique. Cette membrane amniotique est un tissu très fin, transparent qui comporte plusieurs couches, à savoir une couche épithéliale, une membrane basale, une couche compacte et une couche fibroblastique. [00021] Non vascularisée et non innervée, la membrane amniotique est riche en collagène et en divers facteurs de croissance, et présente des propriétés participant au processus de cicatrisation.

[00022] La membrane amniotique, obtenue à partir du placenta après un accouchement, est un tissu utilisé depuis plus de cent ans dans le traitement des brûlures et des blessures. En effet, dès 1910, Davies utilisait des membranes fœtales tant sur des brûlures que sur des tissus ulcérés. Trelford et Trelford-Sauder rapportent qu'en 1935 des auteurs ont publié des applications cliniques de la membrane amniotique en vaginoplastie, reconstruction conjonctivale, traitement des brûlures ou des blessures, et traitements relatifs à l'adhérence intra-abdominale. Trelford et al. rapportent aussi qu'en 1952 Douglas a utilisé de l'amnios pour traiter des blessures étendues. Pour la première fois, il fut indiqué que la couche stromale de la membrane amniotique, comprenant la couche compacte et la couche fibroblastique, permettait une adhérence plus importante de la greffe, et donc de son efficacité. En 1972, les travaux de Trelford et al. ont confirmé ce fait. Gindraux et al. rapportent qu'à partir de 1972, et surtout depuis sa redécouverte en 1995, d'autres auteurs ont confirmé toutes les applications cliniques présentées précédemment, et ont également signalé de nouvelles indications telles que le tractus génito-urinaire, l'estomac, le larynx, la cavité orale, la tête et le cou, que ce soit dans des essais cliniques ou des rapports de cas.

[00023] La membrane amniotique est particulièrement riche en facteurs de croissance de type EGF (Epidermal Growth Factor), TGF (Transforming Growth Factor) et KGF (Kératinocyte Growth Factor), ainsi qu'en acide hyaluronique. Ces facteurs de croissance, l'acide hyaluronique et le collagène présents dans la membrane amniotique sont particulièrement adaptés pour promouvoir les processus biologiques de cicatrisation.

[00024] La gelée de Wharton est un tissu conjonctif gélatineux entourant la veine et les deux artères du cordon ombilical des mammifères. La gelée de Wharton est une substance particulièrement riche en éléments constitutifs de la matrice extracellulaire des tissus conjonctifs, notamment en glycosaminoglycanes et protéoglycanes ; ainsi qu'en fibres de collagène (types I, III, IV et V). La gelée de Wharton comprend également de nombreux facteurs de croissance tels que, notamment, les facteurs de croissance des fibroblastes (FGF), les facteurs de croissance I ressemblant à l'insuline (IGF-I), les facteurs de croissance transformant (TGF), les facteurs de croissance dérivés des plaquettes (PDGF) et les facteurs de croissance épidermique (EGF).

[00025] Ces propriétés structurelles de la gelée de Wharton peuvent être utilisées pour leurs propriétés d'aide à la cicatrisation des lésions, notamment des lésions cutanées ou des lésions de la surface oculaire. En effet, ces éléments constitutifs de la gelée de Wharton participent à l'amélioration des processus biologiques de cicatrisation et de réduction de l'inflammation chez un patient. [00026] Les matériaux biologiques issus de cordon ombilical ou de placenta peuvent servir de matrices idéales pour l'imprégnation de principes actifs qui seront ensuite relargués lors de l'utilisation de ces tissus pour différents traitements thérapeutiques.

[00027] La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un matériau biologique imprégné comprenant les étapes de : a) On dispose d'un matériau biologique lyophilisé, et d'une solution comprenant des exosomes, b) On met en contact le matériau biologique lyophilisé avec la solution comprenant des exosomes, c) On obtient un matériau biologique imprégné selon l'invention.

[00028] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique lyophilisé est tel que ci-après défini.

[00029] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes est telle que ci-après définie.

[00030] Dans un mode de réalisation, le procédé comprend une étape préalable de lyophilisation d'un matériau biologique de départ.

[00031] Dans un mode de réalisation, le procédé comprend une étape préalable de culture des cellules d'intérêt suivie d'une étape de collecte des exosomes dans le milieu de culture des cellules d'intérêt.

[00032] Dans un mode de réalisation, la collecte des exosomes dans le milieu de culture des cellules d'intérêt est effectuée par centrifugation. [00033] Dans un mode de réalisation, la mise en contact de l'étape b) est réalisée par dépôt de la solution comprenant les exosomes à la surface du matériau biologique lyophilisée.

[00034] Dans un mode de réalisation, la durée de la mise en contact de l'étape b) est d'au moins 15 secondes.

[00035] Dans un mode de réalisation, la durée de la mise en contact de l'étape b) est d'environ 1 minute.

[00036] Dans un mode de réalisation, le procédé comprend en outre une étape de lyophilisation du matériau biologique imprégné après l'étape c).

[00037] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de stérilisation après l'étape c).

[00038] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable de stérilisation du matériau biologique de départ et/ou du matériel biologique lyophilisé avant l'étape a).

[00039] Dans un mode de réalisation, les étapes de stérilisation sont effectuées par irradiation.

[00040] Dans un mode de réalisation, les étapes de stérilisation sont effectuées par irradiation gamma par exposition de ce dernier à des rayonnements gamma à 25-32 kGy.

[00041] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable de viro-inactivation du matériau biologique de départ et/ou du matériel biologique lyophilisé avant l'étape a).

[00042] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique lyophilisé des étapes a) et/ou b) est viro-inactivé et/ou stérile.

[00043] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de dévitalisation.

[00044] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend avant l'étape a), une étape de dévitalisation.

[00045] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre avant l'étape a), une étape de mise en forme du matériau biologique lyophilisé.

[00046] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de mise en forme du matériau biologique imprégné. [00047] Dans un mode de réalisation, prend en outre après l'étape c), une étape de mise en forme du matériau biologique imprégné par moulage.

[00048] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de parallélépipède, de disque, de cylindre, de cône ou de sphère.

[00049] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de parallélépipède dont la longueur et la largeur sont comprises entre 0,2 cm et 10 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[00050] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de parallélépipède dont la longueur et la largeur sont comprises entre 0,1 cm et 10 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,1 cm et 1,0 cm.

[00051] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de disque dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 10,0 cm.

[00052] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 10,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[00053] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,15 cm et 2,0 cm et dont la hauteur est comprise de 0,5 cm à 3 cm.

[00054] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,1 cm et 10,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,1 cm et 10,0 cm.

[00055] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de sphère dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[00056] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de sphère dont le diamètre est compris entre 0,1 cm et 1,0 cm.

[00057] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est mis en forme de cône dont le diamètre du plan est compris entre 0,2 cm et 1,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[00058] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que le matériau biologique lyophilisé et/ou le matériau biologique imprégné est sous forme de poudre.

[00059] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de préparation du matériau biologique imprégné dans une forme adaptée pour une administration par voie parentérale. [00060] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de préparation du matériau biologique imprégné dans une forme adaptée pour une application à la surface de la peau et/ou d'une muqueuse et/ou de l'œil et/ou dans une fistule anale.

[00061] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de préparation du matériau biologique imprégné dans une forme adaptée pour une application dans le vitré de l'œil ou en injection sous conjonctival.

[00062] Dans un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre après l'étape c), une étape de préparation du matériau biologique imprégné dans une forme adaptée pour une administration sous forme d'implant.

[00063] Au sens de la présente invention, on entend par « matériau biologique de départ », tout matériau issu et/ou isolé de tissus humains, animaux ou végétaux. Par convention, on désignera par « matériau biologique de départ » un matériau n'étant ni lyophilisé ni imprégné.

[00064] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ comprend des protéoglycanes. [00065] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est un tissu conjonctif comprenant des protéoglycanes.

[00066] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est un tissu conjonctif riche en protéoglycanes.

[00067] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ a une consistance solide ou gel.

[00068] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ n'est pas liquide.

[00069] Dans un mode de réalisation, les cellules du matériau biologique de départ sont dévitalisées.

[00070] Au sens de la présente invention, on entend par « cellule dévitalisé » une cellule dont la continuité des membranes cellulaires et/ou nucléaires est altérée par un procédé physique et/ou chimique mais dont le contenu cellulaire, en particulier l'ADN ou l'ARN, n'est pas éliminé.

[00071] Dans un mode de réalisation, la dévitalisation des cellules est réalisée par au moins un cycle de congélation/décongélation.

[00072] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est décellularisé.

[00073] La taille du matériau biologique de départ selon l'invention sera choisie de manière appropriée par l'Homme du métier, notamment dans le cas d'utilisation thérapeutique dudit matériau biologique de départ, de sorte que celui-ci ait une taille adaptée à la zone à traiter.

[00074] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est caractérisé en ce que ledit matériau biologique de départ est issu d'un ou plusieurs tissus d'origine humaine.

[00075] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est choisi dans la liste consistant en la membrane amniotique ou un matériau biologique de départ issu de placenta humain ou de cordon ombilical humain, notamment la gelée de Wharton humaine et/ou la membrane amniotique humaine.

[00076] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est caractérisé en ce qu'il est issu de placenta ou de cordon ombilical.

[00077] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ comprend de la paroi de cordon ombilical.

[00078] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est de la gelée de Wharton.

[00079] Par « gelée de Wharton », on entend le tissu biologique gélatineux présent dans le cordon ombilical des mammifères dont la veine et les deux artères naturellement incluses au sein dudit tissu biologique gélatineux ont été retirées. Dans la présente invention, le terme « gelée de Wharton » peut être entendu comme comprenant ou non la membrane amniotique entourant la gelée de Wharton du cordon ombilical.

[00080] Dans un mode de réalisation, le terme « gelée de Wharton » est entendu comme ne comprenant pas de fibres de collagène épaisses et/ou de lacunes et parois vasculaires (villosités et chambres intervilleuses).

[00081] Dans un mode de réalisation, ledit matériau biologique de départ sous forme de gelée de Wharton est caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé décrit dans W02019/038411.

[00082] Dans un mode de réalisation, la gelée de Wharton est obtenue selon un procédé comprenant les étapes de : a) on dispose d'un segment de gelée de Wharton dont la veine et les artères ont été ôtées ; b) on effectue un traitement de viro-inactivation du segment de gelée de Wharton pour obtenir un segment de gelée de Wharton viro-inactivée ; c) on effectue un broyage du segment de gelée de Wharton viro-inactivée pour obtenir un broyât homogène de gelée de Wharton viro-inactivée.

[00083] Dans un mode de réalisation, la gelée de Wharton ne comprend pas de vaisseaux ombilicaux.

[00084] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ comprend de la gelée de Wharton et la membrane amniotique qui l'entoure. [00085] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est une membrane amniotique et/ou est issu d'une membrane amniotique.

[00086] Par « membrane amniotique », on entend l'enveloppe tissulaire qui se développe autour de l'embryon, puis du fœtus, chez le mammifère durant la grossesse. Elle a pour rôle de protéger l'organisme en développement en maintenant autour de lui le liquide amniotique. Elle s'accole à la deuxième membrane qui est le chorion. La membrane amniotique inclut les sous-couches physiologiques suivantes : la couche cellulaire épithéliale, la membrane basale, la couche compacte, la couche fibroblastique, la couche spongieuse.

[00087] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ comprend la couche spongieuse de la membrane amniotique.

[00088] La couche spongieuse de la membrane amniotique présente l'avantage d'être très riche en protéoglycanes. [00089] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ sous forme de membrane amniotique est caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé décrit dans W02017/140914.

[00090] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est stérile.

[00091] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est viro- inactivé.

[00092] Par « viro-inactivation », on entend une technique qui permet de réduire fortement ou totalement, et définitivement, la capacité d'action des virus. Ceux-ci, définis comme inactivés, perdent leurs capacités pathogéniques et de réplication par une diminution de leur population de 4 log lors des titrages résiduels qui suivent une ou deux étapes chimiques indépendantes, que ce soit sur des virus enveloppés, ou non enveloppés, ADN ou ARN.

[00093] Un tel procédé est par exemple décrit dans les documents WO20 17/140914 ou W02019/038411 au nom de TBF GENIE TISSULAIRE. [00094] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que ledit matériau biologique de départ est viro-inactivé selon les deux étapes de viro-inactivation chimiques du procédé décrit dans WO20 17/140914 ou W02019/038411.

[00095] Dans un mode de réalisation, les deux étapes sont une étape de traitement chimique avec un alcool particulièrement efficace envers les virus à enveloppes et une étape de traitement chimique avec un peroxyde particulièrement efficace envers les virus nus.

[00096] Dans un mode de réalisation, la première étape de traitement chimique viro-inactivant est l'application d'un lavage, ou le séjour de cette dernière dans un bain, composé d'un premier agent viro-inactivant qui est de l'éthanol. Un lavage par de l'eau purifiée ou un séjour dans un bain d'eau purifiée peut être avantageusement effectué après cette étape.

[00097] Selon un mode de réalisation, le premier agent de viro-inactivation est l'éthanol à une teneur en alcool comprise entre 50% et 80%, et de préférence à 70% v/v.

[00098] Selon un autre mode de réalisation, la première étape de viro- inactivation est effectuée en traitant avec de l'éthanol à 70% v/v pendant environ 60 minutes.

[00099] La deuxième étape du traitement chimique viro-inactivant est l'application d'un lavage, ou le séjour de cette dernière dans un bain, composé d'un deuxième agent de viro-inactivation qui est le peroxyde d'hydrogène. [000100] Comme exposé ci-dessus, il est connu que le traitement par des solutions de peroxyde d'hydrogène n'est efficace sur les virus sans enveloppés qu'à des concentrations supérieures à 10 %.

[000101] Le deuxième agent de viro-inactivation est le peroxyde d'hydrogène sous une forme choisie parmi une solution aqueuse, et un gaz.

[000102] Selon un mode de réalisation, le deuxième agent de viro-inactivation est le peroxyde d'hydrogène sous forme de solution aqueuse dans une concentration comprise entre 3% et 30% p/v.

[000103] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique de départ est stérile.

[000104] Au sens de la présente invention, on entend par « stérile » un matériau dépourvu de germe naturellement ou parce qu'il a été stérilisé. [000105] La stérilisation pourra être réalisée par toute méthode classiquement connue de l'Homme du métier.

[000106] Dans un mode de réalisation, la stérilisation sera réalisée en irradiation gamma.

[000107] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique lyophilisé est stérilisé.

[000108] Au sens de la présente invention, on entend par « matériau biologique lyophilisé » un matériau biologique de départ ayant subi au moins une étape de lyophilisation et n'étant pas réhydraté, ni imprégné.

[000109] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique lyophilisé est stérile et/ou viro inactivé.

[000110] Dans un mode de réalisation, les cellules du matériau biologique lyophilisé sont dévitalisées.

[000111] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique lyophilisé est décellularisé.

[000112] Au sens de la présente invention, on entend par « lyophilisation » une technique visant à dessécher un produit préalablement surgelé par sublimation. Plus précisément, le liquide à ôter du produit est dans un premier temps transformé en glace par congélation ; puis par une dessiccation primaire, sous vide, la glace est sublimée ; enfin par une dessiccation secondaire, les molécules d 'eau à la surface du produit sont extraites par désorption. [000113] Dans un mode de réalisation, la lyophilisation est réalisée dans les conditions suivantes :

• une congélation en deux étapes :

- la première étape de congélation s'effectuant à une température d'acclimatation choisie pour ne pas endommager l'intégrité structurelle, fonctionnelle et biologique du matériau biologique,

- la deuxième étape de congélation s'effectuant à la température finale de congélation qui est inférieure à la température d'acclimatation ;

• une lyophilisation en deux étapes principales, dites primaire et secondaire :

- l'étape de lyophilisation primaire s'effectuant par application d'un vide à environ 200 microbars et d'un profil de température ascendant ;

- l'étape secondaire de lyophilisation s'effectuant par application d'un vide à environ 50 microbars et d'un profil de température descendant.

[000114] Dans un mode de réalisation la température d'acclimatation est comprise entre - 5 et - 20°C et la température finale de congélation est comprise entre - 40 et - 60 °C.

[000115] Le profil de température ascendant est avantageusement un profil selon lequel la température de lyophilisation est initialement réglée à une température initiale basse puis augmentée vers une température finale de lyophilisation primaire, en une ou plusieurs étapes de température ascendantes intermédiaires. Le profil de température descendant est avantageusement un profil selon lequel la température de lyophilisation est initialement réglée à une température supérieure à la température finale de l'étape de lyophilisation primaire, puis qui est ensuite descendue vers une température finale de lyophilisation secondaire supérieure à la température initiale de l'étape de lyophilisation primaire.

[000116] Dans un mode de réalisation le matériau biologique lyophilisé est viro inactivé et/ou stérile.

[000117] [00062] Les traitements de viro-inactivation ainsi que la lyophilisation détruisent les membranes des exosomes qui seraient naturellement présents dans les tissus servant de matrices, l'environnement de ces matrices après ces traitements est donc propice pour être imprégné par des solutions comprenant des exosomes, ces exosomes pouvant provenir de nombreux types cellulaires différents. [000118] Le contenu des exosomes selon la présente invention est dépendant du type de cellules à partir desquelles ils ont été isolés.

[000119] Il est possible que le matériau biologique de départ comprenne des exosomes avant l'imprégnation. Ainsi, par convention, on fera référence aux « exosomes selon l'invention » pour désigner les exosomes qui n'étaient pas présents dans le matériau biologique de départ et/ou le matériau biologique lyophilisé avant l'imprégnation par la solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000120] Les exosomes selon la présente invention peuvent être isolés à partir de différents types cellulaires d'intérêt en fonction de la pathologie à traiter. L'isolement peut être réalisé par n'importe quelle technique connue de l'Homme du métier.

[000121] Dans un mode de réalisation, les exosomes selon la présente invention sont isolés par centrifugation, filtration, ultrafiltration et/ou l'immunoprécipitation du milieu de culture des cellules d'intérêt.

[000122] Les exosomes selon la présente invention peuvent provenir d'un seul type cellulaire ou d'un mélange de différents types cellulaires.

[000123] Dans un mode de réalisation, les cellules d'intérêt sont choisies dans le groupe consistant en les macrophages, plaquettes sanguines, cellules dendritiques, cellules souches mésenchymateuses, cellules souches pluripotentes induites, de cellules de la moelle osseuse, du tissu adipeux et/ou de cordon ombilical et/ou sont purifiées à partir de fluides biologiques. [000124] Dans un mode de réalisation, les cellules d'intérêt sont des cellules génétiquement modifiées.

[000125] Dans un mode de réalisation, les exosomes selon l'invention proviennent du patient traité (autologue) ou d'un ou plusieurs donneurs (allogénique).

[000126] Dans un mode de réalisation, lesdits exosomes selon l'invention sont issus de cellules souches mésenchymateuses.

[000127] Dans un mode de réalisation, lesdits exosomes selon l'invention sont issus de cellules souches mésenchymateuses humaines.

[000128] Dans un mode de réalisation, les cellules souches mésenchymateuses humaines selon l'invention sont obtenues à l'aide d'une méthode ne nécessitant pas la destruction de l'embryon.

[000129] Dans un mode de réalisation, lesdites cellules souches mésenchymateuses selon l'invention sont issues de cordon ombilical. [000130] Dans un mode de réalisation, les cellules souches mésenchymateuses selon l'invention sont issues de cordon ombilical humain.

[000131] Au sens de la présente invention, on emploiera indifféremment « la solution comprenant des exosomes selon l'invention » ou « la solution selon l'invention ».

[000132] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes selon l'invention comprend une quantité thérapeutiquement efficace d'exosomes selon l'invention.

[000133] Au sens de la présente invention, on entend par « quantité thérapeutiquement efficace d'exosomes » la quantité d'exosomes selon l'invention qui élimine, atténue ou soulage les symptômes pour lesquels elle est administrée.

[000134] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes selon l'invention comprend une quantité d'au moins 10 ⁶ exosomes selon l'invention.

[000135] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes selon l'invention comprend une quantité d'au moins 10 ⁹ exosomes selon l'invention.

[000136] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes selon l'invention comprend une quantité d'au moins 10 ¹¹ exosomes selon l'invention.

[000137] Dans un mode de réalisation, la solution comprenant des exosomes selon l'invention est une solution aqueuse.

[000138] Dans un mode de réalisation, la solution selon l'invention comprend en outre le milieu de culture des cellules d'intérêt duquel les exosomes ont été extraits.

[000139] Dans un mode de réalisation, la solution selon l'invention comprend en outre du tampon phosphate salin.

[000140] Dans un mode de réalisation, la solution selon l'invention comprend en outre un autre principe actif.

[000141] Au sens de la présente invention, par « imprégnation » et/ou « imprégné » on entend que la solution comprenant des exosomes pénètre dans le matériau biologique lyophilisé et s'y répand, s'y diffuse. [000142] L'imprégnation consiste donc à faire entrer la solution comprenant les exosomes selon l'invention dans le matériau biologique lyophilisé selon l'invention. Ledit matériau biologique lyophilisé est donc au moins partiellement réhydraté et les exosomes selon l'invention sont enchâssés dans le réseau de protéoglycanes du matériau biologique imprégné selon l'invention de sorte qu'il puisse être à nouveau lyophilisé pour être conservé sans perdre son contenu en exosomes selon l'invention.

[000143] Ainsi, l'imprégnation selon l'invention permet d'ajouter une quantité définie d'exosomes selon l'invention qui n'était pas présente dans le matériau biologique avant imprégnation.

[000144] La quantification de l'imprégnation pourra être réalisée par toute méthode classiquement connue de l'Homme du métier.

[000145] Dans un mode de réalisation, la quantification de l'imprégnation est réalisée par une méthode immuno-enzymatique ELISA de détection des exosomes dans le milieu d'imprégnation en utilisant un matériau biologique avant imprégnation selon l'invention comme témoin négatif.

[000146] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 10 ⁶ exosomes selon l'invention.

[000147] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 10 ⁹ exosomes selon l'invention.

[000148] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 10 ¹¹ exosomes selon l'invention.

[000149] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 90% des exosomes présents dans la solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000150] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 95% des exosomes présents dans la solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000151] Dans un mode de réalisation, il s'agit d'une imprégnation d'au moins 98% des exosomes présents dans la solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000152] La présente invention a également pour objet un matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes. [000153] Dans un mode de réalisation, ledit matériau biologique imprégné est issu de l'imprégnation d'un matériau biologique lyophilisé par une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000154] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une consistance solide ou gel.

[000155] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention n'est pas liquide.

[000156] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné comprend des protéoglycanes.

[000157] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est un tissu conjonctif comprenant des protéoglycanes.

[000158] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est un tissu conjonctif riche en protéoglycanes.

[000159] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une forme adaptée pour une administration par voie parentérale.

[000160] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une forme adaptée pour une administration in situ.

[000161] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une forme adaptée pour une administration péritonéale.

[000162] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une forme adaptée pour une administration sous forme d'implant.

[000163] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention a une forme adaptée pour une application à la surface de la peau et/ou d'une muqueuse et/ou de l'œil et/ou dans une fistule anale.

[000164] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention comprend une quantité thérapeutiquement efficace d'exosomes selon l'invention.

[000165] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est imprégné d'une quantité de 10 ⁶ exosomes selon l'invention.

[000166] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est imprégné d'une quantité de 10 ⁹ exosomes selon l'invention.

[000167] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est imprégné d'une quantité de 10 ¹¹ exosomes selon l'invention. [000168] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de parallélépipède, de disque, de cylindre, de cône ou de sphère, ou de poudre.

[000169] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de parallélépipède dont la longueur et la largeur sont comprises entre 0,1 cm et 10 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,1 cm et 1,0 cm.

[000170] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de parallélépipède dont la longueur et la largeur sont comprises entre 0,2 cm et 10 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[000171] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de disque dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 10,0 cm. [000172] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,1 cm et 10,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,1 cm et 10,0 cm.

[000173] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 10,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[000174] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de cylindre dont le diamètre est compris entre 0,15 cm et 2,0 cm et dont la hauteur est comprise de 0,5 cm à 3 cm.

[000175] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de sphère dont le diamètre est compris entre 0,1 cm et 1,0 cm.

[000176] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de sphère dont le diamètre est compris entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[000177] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné a une forme de cône dont le diamètre du plan est compris entre 0,2 cm et 1,0 cm et dont la hauteur est comprise entre 0,2 cm et 1,0 cm.

[000178] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique est imprégné d'au moins un second principe actif.

[000179] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des antibiotiques, des antiseptiques, des antiviraux, des anticorps monoclonaux, des inhibiteurs semi-synthétiques des métalloprotéases, des agents immunosuppresseurs, des anti-inflammatoires, des antifongiques, des anti-allergiques, des anesthésiques, ou des protéines immunoadhésives, des agents permettant d'éviter les sécheresses oculaires, seuls ou en combinaisons.

[000180] Le au moins second principe actif peut être un principe actif qui est naturellement présent ou non dans ledit matériau biologique de départ. [000181] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des antibiotiques. Quelques exemples d'antibiotiques utilisables sont donnés ci-après : tétracyclines (daunomycine, tétracycline, chloretetracycline, oxytétracycline, etc.), glycopeptides (vancomycine, etc.), aminoglycosides (gentamycine, etc.), aminosides (tobramycine, néomycine, etc.), fluoroquinolones (ciprofloxacine, moxifloxacin, etc.), quinolones (gatifloxacine, etc.), polypeptides (bacitracine, polymyxine, etc.), phénicolés (chloramphénicol, etc.), macrolides (érythromycine, etc.), sulfonamides (sulfacétamide, sulfaméthoxazole, sulfisoxazole, etc.), céphalosporines (céfradoxil, céfoxitine, etc.), et tout autre antibiotique.

[000182] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des anti-inflammatoires stéroïdiens (AIS) et/ou non- stéroïdiens (AINS). Quelques exemples d'AIS sont donnés ci-après : triamcinolone, dexaméthasone, prednisolone, hydrocortisone, corticostérone, fluocinolone, prednisolone, méthylprednisolone, fluorométholone, betaméthasone, tétrahydrocortisol, riméxolone, etc. Quelques exemples d'AINS sont donnés ci-après : indométacine, népafénac, diclofénac, bromfénac, kétorolac, suprofène, etc.

[000183] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des immunosuppresseurs, une liste non-limitative est donnée ci-après : déxaméthasone, bétaméthasone, etc.

[000184] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des antiviraux, une liste non-limitative est donnée ci-après : ganciclovir, trifluorothymidine, aciclovir, DDI, AZT, foscarnet, vidarabine, trifluorouridine, idoxuridine, ribavirine, inhibiteurs de protéase, agent anti cytomégalovirus, etc.

[000185] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des antifongiques, une liste non-limitative est donnée ci- après : fluconazole, nitrofurazone, amphotéricine B, kétoconazole, etc. [000186] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des antiallergiques, une liste non-limitative est donnée ci- après : méthapyriline, chlorpheniramine, pyrilamine, prophenpyridamine, etc. [000187] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des anesthésiques, une liste non-limitative est donnée ci- après : lidocaïne, mépivacaïne, etc.

[00054] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est caractérisé en ce que ledit au moins un second principe actif est choisi dans le groupe constitué des agents permettant d'éviter les sécheresses oculaires, une liste non-limitative est donnée ci-après : azithromycine, ciclosporine, lubrifiants etc...

[000188] Dans un mode de réalisation, les cellules du matériau biologique imprégné sont dévitalisées.

[000189] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné est décellularisé.

[000190] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention est stérile et/ou viro-inactivé.

[000191] Dans un mode de réalisation, le matériau biologique imprégné selon l'invention est lyophilisé.

[000192] Kit d'imprégnation de matériau biologique comprenant au moins deux moyens indépendants : a) Un matériau biologique lyophilisé, b) Une solution comprenant des exosomes.

[000193] Dans un mode de réalisation, le kit d'imprégnation selon l'invention comprend un matériau biologique lyophilisé, tel que décrit ci-dessus.

[000194] Dans un mode de réalisation, le kit d'imprégnation selon l'invention comprend une solution comprenant des exosomes selon l'invention, telle que décrite ci-dessus.

[000195] Un autre objet de la présente invention concerne un dispositif de d'administration d'exosomes comprenant le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention. [000196] Dans un mode de réalisation, le dispositif d'administration selon l'invention consiste en un matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000197] Dans un mode de réalisation, le dispositif d'administration selon l'invention est un dispositif d'administration à libération prolongée d'exosomes.

[000198] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention permet une libération des exosomes pendant au moins 4 heures à compter de l'administration.

[000199] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention permet une libération des exosomes pendant au moins 24 heures à compter de l'administration.

[000200] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention permet une libération des exosomes pendant une durée de 24 à 72 heures à compter l'administration.

[000201] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention permet une libération des exosomes pendant au moins 72 heures à compter de l'administration.

[000202] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention permet une libération des exosomes pendant une durée de 4 heures à 1 semaine à compter de l'administration.

[000203] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon la présente invention est appliqué à la surface de la peau et/ou d'une muqueuse et/ou de l'œil et/ou dans une fistule anale.

[000204] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention est un dispositif implantable.

[000205] Dans un mode de réalisation, le dispositif selon l'invention est un collyre.

[000206] Un autre objet de la présente invention concerne un matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention pour son utilisation thérapeutique.

[000207] Un mode de réalisation de la présente invention concerne également ledit matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention pour son utilisation thérapeutique en médecine régénérative et/ou pour le traitement et/ou la prévention de la maladie de Crohn et/ou les fistules et/ou des maladies chroniques de l'intestin et/ou de la maladie du greffon contre l'hôte et/ou les inflammation de l'intestin et/ou l'accident vasculaire cérébral et/ou l'arthrose et/ou le syndrome de détresse respiratoire et/ou les brûlures et/ou les myopathies cardiaques et/ou des sténoses de l'œsophage et/ou de l'insuffisance cardiaque chronique et/ou du cancer, notamment du côlon et/ou du sein et/ou du poumon et/ou du pancréas et/ou des mélanomes, et/ou des maladies de surcharge lysomales notamment de la maladie de Gaucher et/ou la maladie de Fabry, et/ou de la maladie mucopolysaccharididose de type III et/ou de la maladie de San-fillipo et/ou de la dysplasie broncho-pulmonaire e/ou de l'insuffisance rénale chronique et/ou de la mucite post traitement chimio ou radiothérapeutique, et/ou le diabète de type I et/ou les ulcères gastroduodénal et/ou la pneumopathie et/ou les ulcères veineux et/ou du syndrome de détresse respiratoire aigu et/ou de la démence liée à Alzheimer et/ou de l'infarctus aigu du myocarde et/ou de l'inflammation chronique de l'os temporal post-chirurgical et/ou de la parodontite et/ou de la sécheresse oculaire et/ou des déficits de la macula et/ou de la névralgie et/ou de la dépression et/ou de la démence et/ou de l'épidermolyse bulleuse dystrophique.

[000208] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique comprenant une étape d'administration dudit matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000209] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique en médecine régénérative et/ou pour le traitement et/ou la prévention de la maladie de Crohn et/ou les fistules et/ou des maladies chroniques de l'intestin et/ou de la maladie du greffon contre l'hôte et/ou les inflammation de l'intestin et/ou l'accident vasculaire cérébral et/ou l'arthrose et/ou le syndrome de détresse respiratoire et/ou les brûlures et/ou les myopathies cardiaques et/ou des sténoses de l'œsophage et/ou de l'insuffisance cardiaque chronique et/ou du cancer, notamment du côlon et/ou du sein et/ou du poumon et/ou du pancréas et/ou des mélanomes, et/ou des maladies de surcharge lysomales notamment de la maladie de Gaucher et/ou la maladie de Fabry, et/ou de la maladie mucopolysaccharididose de type III et/ou de la maladie de San-fillipo et/ou de la dysplasie broncho-pulmonaire e/ou de l'insuffisance rénale chronique et/ou de la mucite post traitement chimio ou radiothérapeutique, et/ou le diabète de type I et/ou les ulcères gastroduodénal et/ou la pneumopathie et/ou les ulcères veineux et/ou du syndrome de détresse respiratoire aigu et/ou de la démence liée à Alzheimer et/ou de l'infarctus aigu du myocarde et/ou de l'inflammation chronique de l'os temporal post-chirurgical et/ou de la parodontite et/ou de la sécheresse oculaire et/ou des déficits de la macula et/ou de la névralgie et/ou de la dépression et/ou de la démence et/ou de l'épidermolyse bulleuse dystrophique comprenant une étape d'administration dudit matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000210] Un autre objet de la présente invention concerne dispositif de d'administration d'exosomes comprenant le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention pour son utilisation thérapeutique.

[000211] Un mode de réalisation de la présente invention concerne également ledit dispositif de d'administration d'exosomes comprenant le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention pour son utilisation thérapeutique en médecine régénérative et/ou pour le traitement et/ou la prévention de la maladie de Crohn et/ou les fistules et/ou des maladies chroniques de l'intestin et/ou de la maladie du greffon contre l'hôte et/ou les inflammation de l'intestin et/ou l'accident vasculaire cérébral et/ou l'arthrose et/ou le syndrome de détresse respiratoire et/ou les brûlures et/ou les myopathies cardiaques et/ou des sténoses de l'œsophage et/ou de l'insuffisance cardiaque chronique et/ou du cancer, notamment du côlon et/ou du sein et/ou du poumon et/ou du pancréas et/ou des mélanomes, et/ou des maladies de surcharge lysomales notamment de la maladie de Gaucher et/ou la maladie de Fabry, et/ou de la maladie mucopolysaccharididose de type III et/ou de la maladie de San-fillipo et/ou de la dysplasie broncho-pulmonaire e/ou de l'insuffisance rénale chronique et/ou de la mucite post traitement chimio ou radiothérapeutique, et/ou le diabète de type I et/ou les ulcères gastroduodénal et/ou la pneumopathie et/ou les ulcères veineux et/ou du syndrome de détresse respiratoire aigu et/ou de la démence liée à Alzheimer et/ou de l'infarctus aigu du myocarde et/ou de l'inflammation chronique de l'os temporal post-chirurgical et/ou de la parodontite et/ou de la sécheresse oculaire et/ou des déficits de la macula et/ou de la névralgie et/ou de la dépression et/ou de la démence et/ou de l'épidermolyse bulleuse dystrophique.

[000212] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique comprenant une étape d'administration dudit dispositif de d'administration d'exosomes comprenant le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

[000213] Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique en médecine régénérative et/ou pour le traitement et/ou la prévention de la maladie de Crohn et/ou les fistules et/ou des maladies chroniques de l'intestin et/ou de la maladie du greffon contre l'hôte et/ou les inflammation de l'intestin et/ou l'accident vasculaire cérébral et/ou l'arthrose et/ou le syndrome de détresse respiratoire et/ou les brûlures et/ou les myopathies cardiaques et/ou des sténoses de l'œsophage et/ou de l'insuffisance cardiaque chronique et/ou du cancer, notamment du côlon et/ou du sein et/ou du poumon et/ou du pancréas et/ou des mélanomes, et/ou des maladies de surcharge lysomales notamment de la maladie de Gaucher et/ou la maladie de Fabry, et/ou de la maladie mucopolysaccharididose de type III et/ou de la maladie de San-Fillipo et/ou de la dysplasie broncho-pulmonaire e/ou de l'insuffisance rénale chronique et/ou de la mucite post traitement chimio ou radiothérapeutique, et/ou le diabète de type I et/ou les ulcères gastroduodénal et/ou la pneumopathie et/ou les ulcères veineux et/ou du syndrome de détresse respiratoire aigu et/ou de la démence liée à Alzheimer et/ou de l'infarctus aigu du myocarde et/ou de l'inflammation chronique de l'os temporal post-chirurgical et/ou de la parodontite et/ou de la sécheresse oculaire et/ou des déficits de la macula et/ou de la névralgie et/ou de la dépression et/ou de la démence et/ou de l'épidermolyse bulleuse dystrophique comprenant une étape d'administration dudit dispositif de d'administration d'exosomes comprenant le matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation d'un matériau biologique lyophilisé selon l'invention consistant en de la membrane amniotique :

[000214] Un donneur proprement informé et consentant en accord avec les exigences de la Déclaration d'Helsinki offre en don le tissu placentaire issu d'un accouchement. Par exigence sanitaire relative aux dons de tissus et de cellules d'origine humaine, une qualification en amont du donneur est systématique. Cette qualification implique une recherche de virus HIV, hépatites B, C, HTLV et de la bactérie tréponème pâle responsable de la syphilis.

[000215] Le tissu placentaire est récupéré le plus tôt possible en salle d'accouchement suite à un accouchement. Il peut être avantageusement placé dans une boîte stérile puis congelé à une température de -20°C. [000216] Au laboratoire, en salle stérile, la procédure suivante est appliquée : [000217] La membrane amniotique avec la couche spongieuse est isolée du placenta et le chorion est retiré et est nettoyée.

[000218] Ce tissu isolé est conservé à sec à une température de -20°C ou - 80°C jusqu'à une durée de deux ans ou être directement traité [000219] La membrane amniotique subit une succession de bains assurant un traitement chimique de celle-ci. Ce traitement a pour objectif une désinfection de la membrane amniotique, et tout particulièrement sa viro-inactivation. Une agitation douce à environ 30 rotations par minute (rpm) du milieu liquide est appliquée lors de chaque bain afin d'assurer une pénétration homogène des solvants dans les tissus.

[000220] Dans un premier temps, la membrane amniotique est déposée dans un bain d'eau purifiée à température ambiante pendant environ 3 heures. Cette étape assure tant la décongélation du tissu physiologique qu'une première étape de lyse cellulaire par pression osmotique.

[000221] Puis, la membrane amniotique est transférée dans un bain décontaminant composé d'éthanol 70% v/v en volume d'éthanol par rapport au volume total de la solution à température ambiante pendant environ 1 heure. [000222] Un lavage est effectué dans de l'eau purifiée pendant environ 15 minutes à température ambiante pour retirer l'éthanol.

[000223] Afin d'assurer la seconde étape de traitement décontaminant, la membrane amniotique est transférée dans un bain composé de peroxyde d'hydrogène à 30% p/v en poids de peroxyde d'hydrogène par rapport au volume total de la solution à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000224] Puis la membrane amniotique est transférée dans un bain décontaminant composé de peroxyde d'hydrogène à 3% p/v en poids de peroxyde d'hydrogène par rapport au volume total de la solution à température ambiante pendant environ 1 heure.

[000225] L'action chimique appliquée à la membrane amniotique peut ensuite être neutralisée deux bains comportant de l'hydroxyde de sodium dilué à un pH de 8,5. Les bains de neutralisation s'effectuent à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000226] Afin d'assurer un rééquilibrage du pH et pour éliminer au mieux les résidus organiques se détachant du tissu d'intérêt, la membrane amniotique est transférée dans deux bains de de tampon phosphate salin afin d'assurer son rééquilibrage physiologique. Les bains s'effectuent à température ambiante pendant environ 15 minutes. [000227] Enfin, la membrane amniotique est transférée dans un dernier bain à l'eau purifiée, à température ambiante, pendant au moins 15 minutes et jusqu'à environ 1 heure.

[000228] On obtient une membrane amniotique avec couche spongieuse désinfectée et viro-inactivée.

[000229] Suite à cette partie relative aux traitements chimiques, la membrane amniotique subit un traitement de lyophilisation.

[000230] Sur un plateau en inox, la membrane amniotique est placée entre deux couches de filtres support en méthylcellulose maillée pour faciliter les échanges de vapeur d'eau.

[000231] L'ensemble précédemment décrit est transféré dans un lyophilisateur où une étape de congélation suivie d'une étape de lyophilisation sont effectuées selon les modalités suivantes :

Congélation :

[000232] La première étape de congélation s'effectue à une température de - 10°C pendant 5 minutes, puis à -15°C pendant 90 minutes ;

[000233] la deuxième étape de congélation s'effectue à une température de - 50°C pendant 125 minutes ;

Lyophilisation :

[000234] Une étape de lyophilisation primaire s'effectue par application d'un vide à 200 microbars et par application d'une température de +10°C pendant 8 heures, suivie par une température de +25°C pendant 150 minutes ;

[000235] Une étape secondaire de lyophilisation s'effectue par application d'un vide à 50 micro-bars et par application d'une température de +35°C pendant 5 heures, suivie par une température de +25°C pendant 1 heure.

[000236] Une dernière étape de stérilisation est effectuée par exposition de la membrane amniotique à des rayonnements gamma à 25-32 kGrays.

[000237] On obtient un matériau biologique viro-inactivé, lyophilisé et stérilisé consistant une membrane amniotique avec couche spongieuse.

Exemple 2 : Préparation d'un matériau biologique lyophilisé selon l'invention consistant en un disque de gelée de Wharton :

[000238] Un donneur proprement informé et consentant en accord avec les exigences de la Déclaration d'Helsinki offre en don le cordon ombilical issu d'un accouchement. Par exigence sanitaire relative aux dons de tissus et de cellules d'origine humaine, une qualification en amont du donneur est systématique. Cette qualification implique une recherche de virus HIV, hépatites B, C, HTLV et de la bactérie tréponème pâle responsable de la syphilis. [000239] Le cordon ombilical est récupéré le plus tôt possible en salle d'accouchement. Il est avantageusement placé dans une boite stérile, comprenant une solution de NaCI à 4°C.

[000240] Au laboratoire, en salle stérile, la procédure suivante est appliquée : [000241] Un segment de 20 cm à 50 cm de longueur est isolé par section du cordon ombilical.

[000242] Le cordon ombilical est rincé et hydraté dans des bains d'eau purifiée successifs, sous agitation douce, pendant 4 heures.

[000243] Les vaisseaux sanguins du segment de cordon ombilical sont identifiés et séparés du reste du segment afin de conserver uniquement la gelée de Wharton et la membrane amniotique qui l'entoure. La gelée de Wharton et la membrane amniotique sont utilisées dans la suite du procédé sous l'appellation générale de gelée de Wharton, car la quantité en poids de membrane est négligeable par rapport à la quantité en poids de gelée de Wharton.

[000244] La gelée de Wharton est congelée à sec à une température de -20°C ou -80°C.

[000245] Lors du traitement chimique, la gelée de Wharton est décongelée à l'air libre, à température ambiante, pendant une durée de 5 minutes. Cette étape de congélation, suivie d'une décongélation, assure une dévitalisation importante du matériau biologique.

[000246] La gelée de Wharton subit une succession de bains assurant un traitement chimique de celle-ci. Ce traitement a pour objectif une désinfection de la gelée de Wharton, et tout particulièrement sa viro-inactivation. Une agitation linéaire douce du milieu liquide est appliquée lors de chaque bain afin d'assurer une pénétration homogène des solvants dans les tissus.

[000247] Dans un premier temps, la gelée de Wharton est déposée dans un bain d'eau purifiée à température ambiante pendant environ 3 heures. Cette étape assure tant la fin de la décongélation du tissu physiologique, qu'une étape de lyse cellulaire par pression osmotique.

[000248] Puis, la gelée de Wharton est transférée dans un bain décontaminant composé d'éthanol 70 % v/v à température ambiante pendant environ 1 heure. [000249] Un lavage est effectué dans de l'eau purifiée pendant environ 15 minutes à température ambiante pour retirer l'éthanol.

[000250] Afin d'assurer la seconde étape de traitement décontaminant, la gelée de Wharton est transférée dans un bain composé de peroxyde d'hydrogène à 30 % p/v à température ambiante pendant environ 15 minutes. [000251] Puis, la gelée de Wharton est transférée dans un bain décontaminant composé de peroxyde d 'hydrogène à 3 % p/v à température ambiante pendant environ 1 heure. La gelée de Wharton obtenue est viro-inactivée. L'action chimique appliquée à la gelée de Wharton viro-inactivée est ensuite neutralisée, dans un bain comportant de l'hydroxyde de sodium dilué autour d'un pH de 8,5. Le traitement du bain de neutralisation s'effectue à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000252] Afin d'assurer un rééquilibrage du pH et pour éliminer au mieux les résidus organiques se détachant du tissu d'intérêt, la gelée de Wharton viro- inactivée est transférée dans un bain de tampon physiologique (PBS), afin d'assurer son rééquilibrage physiologique. Le bain s'effectue à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000253] Enfin, la gelée de Wharton est transférée dans deux bains successifs à l'eau purifiée, à température ambiante, pendant au moins 15 minutes et jusqu'à environ 1 heure.

[000254] A cette étape, on peut considérer que la gelée de Wharton obtenue selon ce traitement chimique est une gelée de Wharton en grande partie désinfectée, notamment viro-inactivée.

[000255] Suite à cette partie relative aux traitements chimiques, la gelée de Wharton viro-inactivée subit une étape de broyage.

[000256] La gelée de Wharton est insérée dans un broyeur vibrant à billes Retsch MM400, équipé avec un bol en oxyde de zirconium de 35 mL. La gelée de Wharton occupe un espace d'environ 1/3 du bol. Une bille en oxyde de zirconium d'un diamètre de 20 mm est ajoutée dans le bol avec la gelée de Wharton. Un broyage de 1 minute est effectué à une fréquence de 3 Hz. La bille d'un diamètre de 20 mm est récupérée, et 9 billes en oxyde de zirconium d'un diamètre de 10 mm sont ajoutées dans le bol. Un deuxième broyage de 3 minutes est réalisé à une fréquence de 30 Hz. Un troisième broyage est effectué avec 60 billes de 5mm pendant 3 minutes à une fréquence de 30 Hz.

[000257] La substance obtenue est une substance liquide gélifiée homogène. [000258] La substance obtenue est ensuite répartie dans un moule en inox. Cette répartition est effectuée à l'aide d'une seringue de 2,5 mL.

[000259] La substance obtenue est alors sous forme de disque.

[000260] Suite à cette partie relative au broyage et à la mise en forme, la gelée de Wharton viro-inactivée et broyée subit une lyophilisation.

[000261] La gelée de Wharton viro-inactivée et broyée est placée sur un plateau en inox. [000262] L'ensemble est transféré dans un lyophilisateur, où une étape de congélation suivie d'une étape de lyophilisation sont effectuées selon les modalités suivantes :

Congélation :

[000263] La première étape de congélation s'effectue à une température d'acclimatation choisie pour ne pas endommager l'intégrité structurelle, fonctionnelle et biologique de la gelée de Wharton viro-inactivée et broyée ; [000264] la deuxième étape de congélation s'effectue à la température finale de congélation qui est inférieure à la température d'acclimatation ; Lyophilisation :

[000265] Une étape de lyophilisation primaire s'effectue par application d'un vide à environ 200 micro-bars et par application d'un profil de température ascendant ;

[000266] Une étape secondaire de lyophilisation s'effectue par application d'un vide à environ 50 microbars et par application d'un profil de température descendant.

[000267] Suite à cette étape de lyophilisation, le produit obtenu est un broyât de gelée de Wharton, désinfectée, notamment viro-inactivée et lyophilisée. De plus, le produit obtenu est défini par une forme de cylindre d'un diamètre de 2 cm et d'une hauteur de 0,3 cm, qui est conférée par le support suite à l'étape de lyophilisation.

[000268] Chacun des broyats de gelée de Wharton, viro-inactivée, et lyophilisée ainsi formés est détaché aisément de son support et repositionné dans le même support et mis dans un conditionnement primaire qui est un sachet TYVEK® en copolymère PE-PET.

[000269] Une dernière étape de stérilisation du broyât de gelée de Wharton, viro-inactivée et lyophilisée est effectuée par exposition de ce broyât à des rayonnements gamma à 25-32 kGrays. Tous les sachets comprenant les broyats obtenus à partir de la substance biologique initiale sont traités simultanément lors de cette étape de stérilisation par rayonnements gamma.

[000270] Les broyats de gelée de Wharton viro-inactivée et lyophilisée et stérilisée sont récupérés à l'aide d'une spatule en inox et d'une pince inox fine courbe.

[000271] On obtient un matériau biologique viro-inactivé, lyophilisé et stérilisé consistant un disque de gelée de Wharton.

[000272] Alternativement, le matériel biologique obtenu est broyé à l'aide d'un broyeur, puis passé dans deux tamis successifs de diamètre de pores inférieur à 200 microns et 90 microns puis conditionné dans des flacons en verre.

Exemple 3 : Préparation d'un matériau biologique lyophilisé selon l'invention consistant en un vaisseau de cordon ombilical :

[000273] Un donneur proprement informé et consentant en accord avec les exigences de la Déclaration d'Helsinki offre en don le cordon ombilical issu d'un accouchement. Par exigence sanitaire relative aux dons de tissus et de cellules d'origine humaine, une qualification en amont du donneur est systématique. Cette qualification implique une recherche de virus HIV, hépatites B, C, HTLV et de la bactérie tréponème pâle responsable de la syphilis.

[000274] Le cordon ombilical est récupéré le plus tôt possible en salle d'accouchement. Il est avantageusement placé dans une boite stérile, comprenant une solution de NaCI à +4°C.

[000275] Au laboratoire, en salle stérile, la procédure suivante est appliquée : Le segment retourné pour avoir la gelée de Wharton à l'intérieur et monté sur le guide rigide est décongelé à l'air libre, à température ambiante, pendant une durée de 5 minutes. Le support rigide en PETG est ôté. Cette étape de congélation, suivie d'une décongélation, assure une dévitalisation importante du matériau biologique.

[000276] Le segment retourné subit une succession de bains assurant un traitement chimique de celui-ci. Ce traitement a pour objectif une désinfection de l'artère et de la gelée de Wharton, et tout particulièrement sa viro- inactivation. Une agitation linéaire douce du milieu liquide est appliquée lors de chaque bain afin d'assurer une pénétration homogène des solvants dans les tissus.

[000277] Dans un premier temps, le segment retourné est déposé dans un bain d'eau purifiée à température ambiante pendant environ 3 heures. Cette étape assure tant la fin de la décongélation du tissu physiologique, qu'une étape de lyse cellulaire par pression osmotique.

[000278] Puis, le segment retourné est transféré dans un bain décontaminant composé d'éthanol 70 % v/v à température ambiante pendant environ 1 heure. [000279] Un lavage est effectué dans de l'eau purifiée pendant environ 15 minutes à température ambiante pour retirer l'éthanol.

[000280] Afin d'assurer la seconde étape de traitement décontaminant, le segment retourné est transféré dans un bain composé de peroxyde d'hydrogène à 30 % p/v à température ambiante pendant environ 15 minutes. [000281] Puis, le segment retourné est transféré dans un bain décontaminant composé de peroxyde d'hydrogène à 3 % p/v à température ambiante pendant environ 1 heure. Le segment obtenu est viro-inactivé.

[000282] L'action chimique appliquée au segment viro-inactivé est ensuite neutralisée, dans au moins un bain comportant de l'hydroxyde de sodium dilué autour d'un pH de 8,5. Le traitement d'au moins un bain de neutralisation s'effectue à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000283] Afin d'assurer un rééquilibrage du pH et pour éliminer au mieux les résidus organiques se détachant du tissu d'intérêt, le segment viro-inactivé est transféré dans au moins un bain de tampon physiologique (PBS), afin d'assurer son rééquilibrage physiologique. Le au moins un bain s'effectue à température ambiante pendant environ 15 minutes.

[000284] Enfin, le segment viro-inactivé est transféré dans deux bains successifs à l'eau purifiée, à température ambiante, pendant au moins 15 minutes et jusqu'à environ 1 heure.

[000285] A cette étape du procédé, on peut considérer que le segment obtenu selon ce traitement chimique est un segment en grande partie désinfecté, notamment viro-inactivé.

[000286] Suite à cette partie relative aux traitements chimiques, le segment viro-inactivé subit une lyophilisation.

[000287] Un support rigide en PETG stérile est inséré dans la lumière du segment viro-inactivé. Ce dernier est placé sur un plateau en inox.

[000288] L'ensemble est transféré dans un lyophilisateur, où une étape de congélation suivie d'une étape de lyophilisation sont effectuées selon les modalités suivantes :

[000289] Congélation :

[000290] La première étape de congélation s'effectue à une température d'acclimatation choisie pour ne pas endommager l'intégrité structurelle, fonctionnelle et biologique du segment viro-inactivé ;

[000291] la deuxième étape de congélation s'effectue à la température finale de congélation qui est inférieure à la température d'acclimatation ;

[000292] Lyophilisation :

[000293] Une étape de lyophilisation primaire s'effectue par application d'un vide à environ 200 microbars et par application d'un profil de température ascendant ;

[000294] Une étape secondaire de lyophilisation s'effectue par application d'un vide à environ 50 microbars et par application d'un profil de température descendant. [000295] Suite à cette étape de lyophilisation, le segment retourné est un segment désinfecté, notamment viro-inactivé et lyophilisé.

[000296] Une dernière étape de stérilisation est effectuée par exposition de celui-ci à des rayonnements gamma à 25-32 kGrays.

[000297] On obtient un matériau biologique viro-inactivé, lyophilisé et stérilisé consistant en une gelée de Wharton dans la lumière d'un vaisseau de cordon ombilical.

Exemple 4 : Procédé d'obtention d'exosomes issues de cellules souches mésenchymateuses :

[000298] Des cellules souches mésenchymateuses issues de cordon ombilical humain sont multipliées avec du sérum bovin fœtal jusqu'à confluence. [000299] Les milieux sont collectés à l'aide d'une pipette dans des tubes de filtration Amicon ^® Ultra 0.5 (Merk ^® ) et sont soumis à une centrifugation à 4400 rpm 30 minutes.

[000300] Le concentré d'exosomes est ainsi collecté.

[000301] La bonne récupération des exosomes est validée à l'aide d'un test ELISA. Une quantité supérieure à 4.10 ⁹ exosomes est ainsi obtenue.

Exemple 5 : Démonstration de la capacité de relaraaae d'un matériau biologique imprégné d'une solution comprenant des exosomes selon l'invention :

[000302] Une quantité de 150 pL de concentré d'exosomes obtenus selon le protocole décrit à l'exemple 4 est déposée à la surface d'un demi-disque de gelée de Wharton obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 2, l'autre demi- disque servant de témoin.

[000303] Après une minute, l'ensemble du concentré d'exosomes est imprégné dans le demi-disque.

[000304] Les demi-disques sont ensuite mis en immersion dans lmL de tampon phosphate salin.

[000305] Aux temps 15 minutes, 30 minutes, 1 heure, 4 heures après immersion, le milieu est totalement extrait pour analyse et est remplacé par un nouveau millilitre de tampon phosphate salin.

[000306] La quantité d'exosomes relarguée dans le milieu est mesurée à l'aide d'un Exo ELI SA- ULTRA Complété Kit (CD63 Détection). La valeur maximale de dosage à l'aide de ce kit est de 4,06 x 10 ⁹ .

[000307] Le matériau biologique consistant en un demi-disque de gelée de Wharton imprégné d'une solution comprenant des exosomes a permis la libération prolongée des exosomes pendant 4 heures dans le milieu.