Domaine de l’invention

L’invention porte sur le domaine des molécules de biocontrôle et la valorisation de déchets agricoles. L’invention porte notamment sur la valorisation du coproduit de poireau comme produit de biocontrôle, et son procédé d’obtention.

Etat de l’art

La culture des céréales, des fruits et légumes est sujette à des attaques par des nuisibles (insectes, mauvaises herbes, microorganismes...) qui affectent les rendements des récoltes et réduit ainsi les gains des producteurs. Afin de pallier à ces inconvénients, les agriculteurs utilisent régulièrement pour ne pas dire massivement des pesticides afin de protéger les cultures et ainsi augmenter leurs rendements. Pour autant l’utilisation des pesticides n’est pas sans risques sur la santé ou la pérennité des sols cultivés. De plus leur sélectivité fait également défaut, les nuisibles sont certes détruits efficacement, mais d’autres espèces d’insectes ou de microorganismes utiles aux plantes peuvent être affectés. Il est à noter que depuis leur utilisation, certains pesticides sont dorénavant interdits à la vente.

Pour remédier aux défauts des pesticides, les agriculteurs ont cherché des alternatives et se sont tournés vers des produits dits de biocontrôle, plus sélectifs moins toxiques pour l’environnement. Le plus souvent il s’agit de produits naturels présents dans des plantes ou des microorganismes, dans la demande WO2022047396 il est démontré que des compositions microbiennes présentent des effets bénéfiques sur le plan agricole. Bien que performants, la production de produits naturels par les microorganismes reste encore faible et les quantités dont les cultures ont besoin pour être protégées peuvent ne pas suffire.

Dans la demande WO2021236799 il est fait référence à une composition de lutte biologique à base d’une minicellule intacte contenant un acide nucléique qui cible un produit de transcription codant pour un polypeptide et un procédé pour lutter contre des nuisibles et des pathogènes avec de nouveaux systèmes et compositions pour administrer des molécules d'ARN au sein des cultures. Là encore l’utilisation d’une minicellule intacte bien qu’efficace peut se heurter à des soucis de stabilité d’utilisation au sein des sols.

Ainsi il y a un besoin évident d’alternative aux pesticides et les produits de biocontrôle sont une de ces alternatives solutionnant les inconvénients desdits pesticides. Pour autant la quantité d’agents de biocontrôle obtenue et la stabilité de ceux-ci reste un problème que l’on se doit de résoudre pour en faire un usage quotidien impactant de façon positive le rendement des cultures tout en préservant celles-ci et l’environnement.

En particulier, il existe un besoin pour des agents de biocontrôle effectifs pour faire face aux maladies fongiques impliquées dans de nombreuses maladies de plantes, et à l’origine de pertes importantes de production. Par exemple, des maladies telles que la pourriture grise, l’alternariose, et les fusarioses affectent différentes productions végétales, et ceci de la semence au produit post-récolte.

Les extraits végétaux permettent de répondre au moins partiellement à ces besoins. Par exemple, la famille allium, et notamment l’ail est connu depuis de nombreuses années pour ces effets antibactériens, ainsi que son activité antifongique et insecticide. Son efficacité ayant largement été mise en évidence, l’extrait d’ail est maintenant reconnu en France dans la liste des produits phytopharmaceutiques de biocontrôle, au titre de l’article L. 253-5 et L. 253-7 du code rural et de la pêche maritime. L’extrait d’ail est commercialisé dans des concentrations de 45%p/p comme produit de biocontrôle.

Il reste toutefois souhaitable d’avoir d’autres produits de biocontrôle permettant de lutter efficacement contre les maladies fongiques et les moisissures aux différentes étapes de la production agricole. Il est également souhaitable d’avoir des nouveaux agents de biocontrôle accessibles à des grands volumes, à un bas coût, et sans monopoliser les terrains agricoles pour leur production.

Résumé de l’invention

Un but de l’invention est donc de proposer un nouveau produit de biocontrôle efficace contre les maladies fongiques, productible en grands volumes et à un prix modéré.

A cette fin l’invention propose un produit de biocontrôle comprenant ou étant constitué de la poudre de poireau (Allium porrum) dont la granulométrie moyenne est égale ou inférieure à 700 pim, et de préférence comprise entre 10 pm et 700 pm. La granulométrie moyenne de la poudre peut également être de 90 à 500pm, de 90pm à 300 pm, ou préférablement 90 pm à 180 pm. Dans un mode de réalisation la granulométrie est comprise entre 90 et 700 pm.

En effet, il est le mérite des inventeurs d’avoir démontré que le poireau sec sous forme de poudre avec une granulométrie < à 700 pm présente des propriétés antifongiques contre un spectre significatif de moisissures pathogènes et leurs spores. De manière surprenante, les inventeurs ont constaté qu’à une même dose de poudre de poireau testé, une granulométrie supérieure à 700 pm limite fortement l’activité antifongique et n’empêche pas la croissance des moisissures.

L’effet antifongique peut être obtenu par l’utilisation de la poudre de poireau mise en contact directement avec un produit agricole à protéger, tel qu’une semence, une culture ou un fruit récolté. La poudre de poireau selon l’invention constitue donc à elle-même un produit de biocontrôle, ou bien elle peut être incorporée dans une formulation comprenant des excipients, des conservateurs et/ou d’autres principes actifs, soit être utilisé sous forme d’extrait.

Le produit de biocontrôle selon l’invention est issu de la partie supérieure et/ou de la partie inférieure du poireau. La partie supérieure correspond aux feuilles de la partie verte du poireau et la partie inférieure correspond aux feuilles de partie blanche du poireau valorisée typiquement comme aliment.

Avantageusement, le produit de biocontrôle de l’invention est issu du coproduit de la récolte de poireau, et est composé essentiellement, majoritairement ou exclusivement de la partie verte. Il sera ainsi possible de valoriser un déchet végétal dont la source est pérenne et abondante. En effet, la production annuelle de poireau en France est d’environ 165 000 tonnes et on estime que 15% ou 20% de la production est perdue comme coproduit résultant de l’épluchage post-récolte. La présente invention permet donc de valoriser comme produit de biocontrôle cette partie de la récolte du poireau qui est actuellement inexploitée.

Afin de faciliter l’application du produit de biocontrôle, l’invention propose d’effectuer un extrait aqueux à partir de la poudre de poireau décrite ci-avant. Avantageusement, un simple extrait aqueux présente une grande activité antifongique lorsqu’il est mis en contact avec le produit à traiter. D’ailleurs, à la différence des extraits d’ail, l’extrait aqueux de l’invention ne présente pas une activité antifongique lorsqu’il se trouve à distance du produit à traiter.

Dans un mode de réalisation, l’invention propose un extrait aqueux dont la concentration de poudre de poireau sur volume de solvant est comprise entre 5 g/L et 50 g/L, préférablement 10 g/Là 25 g/L. En particulier, une concentration comprise entre 10 g et 50 g de poudre de poireau pour 1 L d’eau permet d’extraire environ 60 à 90 % de l’activité antifongique de la poudre. L’extrait peut être utilisé avec la poudre de poireau en suspension dans l’eau ou comme un filtrat afin de faciliter l’utilisation de l’extrait.

Le pH de l’extrait aqueux simple est compris entre 6 et 7 sans ajustement de pH, notamment entre 6,5 et 6,8 et présente une activité antifongique. De préférence, le pH de l’extrait est compris entre 3,5 et 5,5, et de préférence entre 3,7 et 4,7. L’activité antifongique peut être ainsi augmentée significativement. Avantageusement, l’extrait comprend un acide organique, tel que l’acide acétique, pour acidifier le pH et améliorer d’avantage l’activité antifongique.

L’invention concerne également une composition de biocontrôle, insecticide ou antifongique comprenant un produit de biocontrôle selon l’invention ou un extrait aqueux dudit produit de biocontrôle.

De manière avantageuse, les inventeurs ont mis en évidence l’effet synergique de la poudre de poireau ou de son extrait selon l’invention avec d’autres agents de biocontrôle, tel que les sels de cuivre, les détergents cationiques et anioniques, les lipopeptides et l’acide acétique. L’invention propose donc une composition comprenant un produit de biocontrôle selon l’invention ou un extrait aqueux dudit produit de biocontrôle et comprenant également l’un des composés ci-après ou toute combinaison de ces composés :

-un sel de cuivre choisi parmi le sulfate cuivre, l’oxyde cuivreux, l’hydroxyde de cuivre, l’oxychlorure de cuivre, le sulfate de cuivre tribasique, l’acétate de cuivre, le tallate de cuivre et le carbonate de cuivre déployé ou leurs mélanges, et permettant d’envisager une réduction d’au moins par 2 les quantités utilisées conventionnellement dans le traitement des cultures par le cuivre ;

- un tensioactif antiseptique ou désinfectant, de préférence un composé tensio-actif anionique par exemple le lauryl sulfate de sodium, et/ou un tensio-actif cationique par exemple le bromure de cétrimonium, et permettant d’envisager une réduction d’au moins par 5 de l’utilisation de la biomasse de co-produit de poireau et par 2 la quantité de détergent requise ;

- un composé de type lipopeptide présentant des propriétés antimicrobiennes, de préférence une activité antifongique, par exemple la caspofungine, ou les surfactines, les iturines, et les fengycines produites par différentes souches de Bacillus sp, et permettant d’envisager une réduction d’au moins par 5 l’utilisation de la biomasse de co-produit de poireau tout en réduisant d’au moins 2 fois les concentrations requises de lipopeptides pour atteindre un effet antifongique.

- un acide organique choisi parmi l’acide acétique, l’acide propionique ou leurs mélanges et permettant d’envisager une réduction d’au moins par 5 l’utilisation de la biomasse de coproduit de poireau tout en réduisant d’au moins 2 fois les concentrations requises de pour atteindre un effet antifongique.

Bien entendu, l’invention concerne également l’utilisation combiné du produit de biocontrôle de l’invention ou de l’extrait aqueux de l’invention avec l’un des composés cités ci-avant et leurs mélanges, notamment lorsqu’ils sont appliqués comme traitement antifongique sur des cultures, semences et/ou des végétaux.

En raison de l’effet synergique du produit de biocontrôle de l’invention avec d’autres produits de biocontrôle, la concentration respective du sel de cuivre, du tensioactif antiseptique et/ou du composé lipopeptide présente dans la composition est inférieure à la dose active requise pour l’utilisation seule desdits composés en tant que produits de biocontrôle. Des concentrations antifongiques efficaces peuvent donc être envisagées à partir de 0,5% à 5% m/V (5 à 50g/L si V= 1 L), préférablement 1% à 2.5% (10 g/L à 25 g/L si V= 1 L) pour la poudre de vert de poireau selon l’invention ou l’extrait aqueux issu de ladite concentration. La poudre de poireau peut être également associée à des composés tensioactifs tel que le lauryl sulftate de sodium à une quantité comprise entre 0,01 % à 0.1 % de la masse de poudre de poireau comprise dans la composition de biocontrôle. La poudre de poireau peut être également associée à des composés fongicides tels que lessels de cuivre pouvant être présent à une quantité comprise entre 5% à 20% de la masse de poudre de poireau comprise dans la composition biocontrôle La poudre de poireau peut être également associée à un mélange de fongicides et de tensioactifs aux concentrations précitées.

De manière empirique, l’utilisation combinée de l’extrait de l’invention avec un sel de cuivre sur une culture permet d’appliquer une dose de cuivre inférieure à 4 kg/ha/an (dose autorisée par an tel que préconisé par la Commission Européenne), et de préférence inférieure à 3 kg/ha/an ou à 2 kg/ha/an. La dose par application de sel de cuivre pourra bien entendu être réduite également par au moins un facteur 2.

Dans des modes de réalisations préférés, la composition ou utilisation comporte l’une des combinaisons ci-après :

- un extrait aqueux selon l’invention, du sulfate de cuivre et un tensioactif choisi parmi le lauryl sulfate de sodium et le bromure de cétrimonium ;

- un extrait aqueux selon l’invention, du lauryl sulfate de sodium, et un lipopeptide choisi parmi l’iturine, la surfactine, la fengycine ou leurs mélanges.

La composition de l’invention est sous forme liquide, soit peut-être présentée sous forme d’une poudre à incorporer dans un solvant aqueux avant son utilisation, soit sous forme de kit comprenant les différents agents de biocontrôle à mélanger et à dissoudre dans l’eau dans un ordre prédéfini pour son utilisation.

L’invention propose l’utilisation d’un produit de biocontrôle selon l’invention, d’un extrait issu d’un produit de biocontrôle selon l’invention et/ou de la composition selon l’invention à des fins de biocontrôle, d’insecticide ou antifongique. En particulier, l’invention propose ladite utilisation sur des semences, des cultures ou des végétaux tels que des fruits ou légumes post-récoltes.

L’invention concerne également une semence recouverte par pelliculage ou pulvérisation d’un produit de biocontrôle, un extrait ou une composition selon l’invention.

L’invention concerne également un procédé d’obtention d’un produit de biocontrôle selon l’invention, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :

1 ) Récolte des parties vertes ou vertes et blanches du poireau ;

2) Découpe des parties selon 1 ) ;

3) Séchage des dites parties du poireau ;

4) Broyage des parties après séchage pour obtenir une granulométrie moyenne

< à 700 pim, et de préférence comprise entre 10 pm et 700 pm, préférablement 90 pm et 500 pm, encore plus préférablement 90 pm et 180 pm.

5) Optionnellement Tamisage de l’extrait obtenu à l’étape 4.

De manière avantageuse, l’invention propose d’optimiser l’étape de séchage de l’obtention dudit extrait par une ou toutes les actions ci-après : -découpe en tronçons ou en lamelles des parties vertes ou vertes et blanches du poireau avant l’étape 2) séchage. De préférences les tronçons sont d’environ 1 à 5 cm, et les lamelles de 0,5 cm par 2 cm. Au contraire une perte d’activité est observée lorsque les parties de poireau sont directement mises à sécher.

-l’étape 2) de séchage est réalisée à une température inférieure à 70°C, de préférence inférieure à 60°C et de manière plus préférentielle à une température comprise entre 30 et 50° C ou entre 30 et 40°C. Au contraire, une perte d’activité est observée avec une température de séchage supérieure à 70°C.

- l’étape 2) de séchage est réalisée pour une durée de séchage variant d’environ 24h à 72h, au moyen d’un déshydrateur ventilé. Avantageusement, l’étape de séchage peut être ainsi effectuée avec un moyen disponible chez les exploitations agricoles, et de sorte à conserver une activité optimale du produit de biocontrôle de l’invention.

- l’étape 2) de séchage est réalisée jusqu’à obtenir une teneur en humidité de l’ordre du 5% (± 1 % ou 2%) et de sorte à stabiliser les composants présentant une activité antimicrobienne dans le produit de biocontrôle de l’invention.

Le procédé de l’invention comporte une étape d’extraction aqueuse afin d’obtenir l’extrait aqueux de la poudre de poireau de l’invention. De préférence, la durée de l'étape d’extraction est inférieure à 60 minutes, et de préférence est comprise entre 2 et 30 minutes.

Optionnellement, le procédé comporte également une étape d’ajustement du pH entre 3.5 et 5.5, de préférence 3.7 à 4.7 par ajout d’un acide organique tel que l’acide acétique

Optionnellement, le procédé comporte une étape de filtration pour recueillir un filtrat de ladite extraction et faciliter ainsi l’utilisation de l’extrait. L’extrait non filtré pourra être utilisé également avec la poudre en suspension.

Définitions

Dans la présente invention, on entend par poudre une forme de la matière constituée par des particules solides sèches plus au moins fines, en état libre ou aggloméré.

Par partie blanche ou inférieure du poireau, ou par blanc de poireau on entend les feuilles de couleur blanche d’Allium porrum connu aussi sous le nom d’ Allium ampeloprasum var. porrum.

Par partie verte ou supérieure du poireau, ou par vert du poireau on entend les feuilles de couleur verte dAllium porrum connu aussi sous le nom d’Allium ampeloprasum var. porrum.

Sur les figures, on entend par traitement l’utilisation de la poudre de poireau ou de l’extrait aqueux selon l’invention.

Par extrait aqueux on entend le liquide d’une macération de la poudre de poireau dans l’eau éventuellement filtré, et sa concentration est exprimée comme la quantité de poudre de poireau par volume de solvant utilisé dans ladite macération, et avant filtration. Dans la partie expérimentale, l’extrait aqueux est obtenu à partir de la poudre de vert de poireau sans que cela soit limitatif pour l’invention.

Figures

Fig. 1 Activité antifongique de la poudre de vert de poireau selon l’invention sur des phytopathogènes fréquents. Fig. 2 Impact de la granulométrie sur l’activité antifongique. Granulométries supérieures à 700 pm (A), comprises entre 180 et 700 pm (B), 90 et 180 pm (C) et inférieures à 90 pm (D).

Fig. 3 (A) Effet sporicide et fongicide de l’extrait de poireau sur Alternaria. (B) Efficacité antifongique en fonction du stade de croissance.

Fig. 4 Traitement post-récolte de fruits infectés. (A) Traitement de clémentines par la poudre de vert de poireau, (B) traitement de clémentines par l’extrait aqueux, et (C) traitement de tomates par l’extrait aqueux.

Fig. 5 Traitement de semences de brocoli par un extrait aqueux de vert de poireau. (A) Des graines de brocoli ont été infectées par des spores d’ Alternaria alternate ou Botrytis cinera puis traitées par l’extrait de vert de poireau avant germination et croissance pendant 7 jours. (B) Mesure des plantules à 7 jours

Fig. 6 Activité antifongique de l’extrait aqueux en combinaison avec un détergent. (A) Extrait + détergent anionique, lauryl sulfate de sodium, (B) Extrait 50g/L dilué par 5 ou 10 + détergent cationique CTAB. Les puits ont été ensemencés avec une souche d’A. Alternata pour une incubation à température ambiante pendant 5 jours.

Fig. 7 Activité antifongique de l’extrait aqueux en combinaison avec un produit de biocontrôle. (A) Extrait + sulfate de cuivre, (B) Extrait 50g/L dilué par 5 ou 10 + un lipopeptide, surfactine (Bacillus Subtilis). Les puits ont été ensemencés avec une souche d’A. Alternata pour une incubation à température ambiante pendant 4 à 6 jours.

Fig. 8 Impact du pH sur l’activité antifongique de l’extrait aqueux. (A) Effet du pH du milieu de culture. (B) Activité antifongique de l’extrait aqueux préparé dans l’eau à2 mM d’acide acétique (0,012%).

Fig. 9 Effets antifongiques combinés de l’extrait aqueux avec un détergent (0,01 % lauryl sulfate) et du sulfate de cuivre. Concentration initiale de l’extrait 50g/L. Les puits ont été ensemencés avec une souche d’A. Alternata pour une incubation à température ambiante de 3 jours.

Fig. 10 Effets antifongiques combinés de l’extrait aqueux avec un détergent (lauryl sulfate 0,01 %) et un lipopeptide (fengycine 50mg/mL). Concentration initiale de l’extrait 50g/L. Les puits ont été ensemencés avec une souche d’A. Alternata pour une incubation à température ambiante. (A) Observation par microscopie après 20h de traitement, (B) Observations macroscopique après 6 jours de traitement.

Fig. 1 1 Effets antifongiques combinés de l’extrait aqueux avec un détergent (lauryl sulfate 0,01 %) et un lipopeptide (Iturine A 25pg/ml). Concentration initiale de l’extrait 50g/L. Les puits ont été ensemencés avec une souche d’A. Alternata pour une incubation à température ambiante de 24 heures, suivie d’une observation par microscopie.

Fig. 12 Impact du procédé de transformation sur l’activité antifongique. (A) Impact de la méthode de découpe sur l’activité antifongique. Les feuilles de poireaux sont découpées par les approches indiquées, puis soumises aux étapes suivantes du procédé (séchage à 40°C, broyage et extraction). La croissance d’ Alternaria est évaluée par quantification au crystal violet après une incubation de 4h30 à 5 h en présence d’extrait (3,125 à 50%) dans le milieu de culture puis comparée au contrôle négatif. (B) Impact de la température de séchage sur l’activité antifongique. Les feuilles de poireaux sont découpées par tronçons puis séchées à différentes températures avant d’être soumises aux étapes suivantes du procédé. La croissance d’ Alternaria est évaluée par quantification au crystal violet. Fig. 13 Impact de la concentration en poudre (10, 20 et 50 g/L) lors de la macération sur l’efficacité d’extraction de l’activité antifongique. L’activité antifongique est quantifiée par mesure de la croissance radiale d’une souche de Trichoderma après incorporation de poudre de poireau dans un milieu nutritif gélosé. L’activité résiduelle après extraction est comparée à l’activité initiale pour en déduire le pourcentage d’activité extraite.

Fig. 14 A et 14B Impact de la durée de macération sur le niveau d’extraction de l’activité antifongique. (A) Quantification par mesure de la croissance après coloration au crystal violet. (B) Germination d’Alternaria en présence de 12,5% d’extrait obtenu après macération de 2 (panel B), 30 (panel C), 60 (panel D) et 120 (panel E) min.

Description détaillée de l’invention

La présente invention a pour but la valorisation de coproduits maraichers, notamment du poireau comme produit de biocontrôle. En particulier, l’invention a pour but de proposer une forme de poireau assurant l’obtention des effets de biocontrôle, ainsi que de proposer des formes de préparation du poireau permettant d’obtenir ledit effet et facilitant son application sur des produits végétaux tels que des cultures, des semences et des récoltes.

A ces fins l’invention propose un produit de biocontrôle comprenant ou étant constitué de poudre de poireau ayant une granulométrie inférieure à 700 pim. En effet, les inventeurs ont constaté que l’utilisation de la poudre de poireau avec une telle granulométrie permet l’obtention des effets antifongiques contre un large spectre des moisissures phytopathogènes. La poudre de poireau de l’invention peut donc être directement utilisée en tant que produit de biocontrôle en saupoudrant ou pulvérisant un produit à protéger. Par produit de biocontrôle on entend un produit d’origine biologique utilisée comme traitement dans la protection de végétaux contre les maladies d’origine microbienne et les insectes.

En particulier, l’invention propose de valoriser la partie verte du poireau car il s’agit d’un coproduit de la récolte du poireau. La partie blanche du poireau est également active et peut être utilisée aux fins de l’invention, elle aura l’avantage de présenter une activité supérieure à la partie verte. En effet, la poudre de blanc de poireau présente une activité antifongique d’environ 5 à 10 fois supérieure à la poudre de vert de poireau (résultats non présentés). Un mélange de parties blanches et vertes de poireau peut donc être envisagé, et le ratio sera fonction du pourcentage de chaque partie dans le coproduit à valoriser. Les résultats expérimentaux présentés ci-après sont basés exclusivement sur la poudre de vert de poireau.

Afin de faciliter l’utilisation du poireau, l’invention propose d’effectuer un extrait aqueux de la poudre de poireau selon l’invention. De manière surprenante, une simple macération aqueuse permet d’obtenir un extrait présentant une grande efficacité antifongique, et ne requiert pas l’utilisation de co-solvants particuliers ou d’une étape d’ajustement de pH. L’extrait de l’invention peut donc être obtenu très facilement, et avec un équipement basique disponible dans les exploitations agricoles. L’extrait de vert de poireau se montre actif à partir des concentrations 5 g/L et sera utilisé préférablement à une concentration de 10 g/L à 25 g/L. Un extrait de vert de poireau concentré d’environ 50 g/L peut être également envisagé pour être dilué avant son utilisation comme traitement sur des produits végétaux. Afin d’optimiser l’activité de l’extrait, il est suggéré d’ajuster son pH entre 3,5 et 5,5 de préférence au moyen d’un acide organique tel que l’acide acétique.

Les inventeurs ont également mis en évidence l’effet synergique de la combinaison de la poudre de poireau selon l’invention et d’autres agents de contrôle dont il est souhaité de réduire les doses utilisées pour des raisons environnementales. Une synergie a notamment été trouvée avec les sels de cuivre, les détergents et les lipopeptides présentant une activité antimicrobienne. L’invention permet ainsi de diminuer fortement les closes utilisées desdits agents lorsqu’ils sont combinés aux effets antifongiques de la poudre de poireau ou de son extrait.

L’invention concerne également l’optimisation du procédé d’obtention de la poudre de poireau et de l’extrait aqueux de l’invention. Tel qu’il a été déjà mentionné, la granulométrie <700pm est essentielle pour obtenir un effet antifongique efficace avec une faible dose de poudre de poireau. D’autre part, l’utilisation d’une poudre, c’est-à-dire une forme des particules à l’état sec, implique nécessairement le séchage de la forme fraiche du poireau avant ou après son broyage.

Le séchage du poireau est en effet une étape du procédé d’obtention du produit de biocontrôle selon l’invention. Les inventeurs ont mis en évidence l’importance de cette étape de séchage dans la stabilisation de l’activité antifongique. Par conséquent, l’invention propose l’utilisation du poireau sous forme de poudre comme produit de biocontrôle et d’un extrait obtenu à partir de cette poudre.

L’invention propose notamment un procédé d’obtention du produit de biocontrôle comprenant ou étant constitué de la poudre de poireau avec une granulométrie <700pm. Ce procédé propose d’optimiser l’étape de séchage pour maintenir l’activité la plus haute possible. L’étape de séchage peut notamment être optimisée par la découpe préalable en tronçons ou lamelles des parties fraîches du poireau, et le séchage desdites parties prédécoupées jusqu’à environ 5 % de taux d’humidité, l’utilisation des températures inférieures à 70° C, et par une durée de 24 à 72h. Le broyage est réalisé ensuite de manière à obtenir la granulométrie souhaitée. Pour préparer l’extrait il suffira de faire une macération aqueuse à température ambiante pour une durée de 2 à 30 minutes de la poudre de poireau ainsi obtenue. L’extrait peut être utilisé avec la poudre en suspension ou être filtré pour faciliter son utilisation.

La partie expérimentale ci-après démontre les nombreux avantages de la valorisation du coproduit de poireau lorsqu’il est mis sous forme de poudre et une granulométrie spécifique, ou d’un extrait obtenu à partir de cette poudre. Le potentiel comme produit de biocontrôle a été mis en évidence au moyen de l’activité antifongique, mais une utilisation en tant qu’insecticide est également envisagée.

PARTIE EXPERIMENTALE

I. Transformation de poireaux

1. 1 Obtention de la poudre de poireau

Les feuilles vertes de poireaux sont séparées et lavées avant d’être mises à sécher à température douce ou moyenne. Le séchage sera fait de sorte à préserver l’activité des molécules sensibles à sa dégradation et les conditions seront variables selon la méthode de séchage choisie. Selon un mode de réalisation non limitatif, l’étape de séchage est réalisée au moyen d’un déshydrateur ventilé permettant un séchage graduel des feuilles de poireaux en moins de 72h, à une température inférieure à 70°C et jusqu’à obtenir un taux d’humidité préférentiel de l’ordre de 5%.

Les feuilles de poireaux sont ensuite écrasées grossièrement puis broyées indifféremment à l’aide d’un broyeur à marteau ou d’un broyeur à lame jusqu’à la réduction sous forme de poudre. De préférence, ce broyage s’effectue par cycle (généralement 3 fois 15 sec) avec une courte période de repos pour limiter réchauffement de la poudre et jusqu’à une granulométrie inférieure à 700pm. L’objectif est ici de réduire la taille de la biomasse dans le but d’augmenter la surface de contact avec le milieu et d’atteindre un niveau d’extraction des principes actifs optimal, soit de diffusion de principes actifs à partir de la poudre vers le produit à traiter, tout en conservant l’activité des principes actifs. Afin d’optimiser l’étape de séchage et la préservation des molécules actives, l’invention propose de découper les parties de poireau en tronçons d’environ 1 à 5 cm ou en lamelles d’environ 0,5 à 2 cm de large pour garantir une activité antifongique optimale. Cette étape de découpe permet d’obtenir un séchage plus rapide à faible température et conduit à une stabilisation des formes actives. Les lamelles ou tronçons sont ensuite mis à sécher de 24h à 72h dans un déshydrateur ventilé à une température, inférieure à 70°C et idéalement comprise entre 30 et 50°C. Dans le cadre de la présente invention il n’est pas recommandé de procéder à un broyage des parties fraîches aussi nommé « broyé frais » des parties du poireau car dans ce cas l’activité antifongique diminue plus que significativement, voire risque de disparaître.

I.2 Extrait aqueux

L’activité antifongique peut être extraite par macération dans l’eau à des concentrations en poudre de vert de poireau variant de 10 à 50 g/L afin d’obtenir une fraction renfermant des principes actifs suffisamment concentrés pour ne pas ajouter d’étape supplémentaire. Les concentrations de 20 à 25g/L sont généralement employées pour envisager des dilutions ultérieures tout en maintenant un rendement d’extraction important (de l’ordre de 90%) (Figure 4). La durée de macération optimale pour préserver l’activité antifongique est inférieure à 1 h, et de préférence de 2 minutes à 30 minutes.

La macération est généralement suivie d’une étape de filtration sous vide ou à pression atmosphérique afin d’éliminer les résidus insolubles et faciliter l’utilisation de l’extrait. De manière générale, il est conseillé d’utiliser l’extrait rapidement après sa préparation.

II. Matériels et méthodes

2. 1 Détermination de l’activité antifongique de la forme sèche

Les souches utilisées Penicillum digitatum, Fusarium oxysporum, Penicillum expansum, Alternaria alternata, Botrytis cinera et/ou Trichoderma sont mises en culture sur milieu PDA de 4 à 5 jours à 25 ou 30°C avant récolte dans une solution de Tween à 0,05%, puis ajustées à la concentration de 10 ⁵ spores/ml.

La poudre de poireau est pesée puis mélangée à du milieu Potato Dextrose Agar (PDA) amené à une température comprise entre 40 et 50°C afin d’obtenir des concentrations en poudre variant de 5 à 50 g/L. Après homogénéisation, le mélange est placé dans une boîte de Pétri. 10 pL de spores à une concentration de 10 ⁵ spores/ml sont déposés au centre de la boîte de Pétri avant incubation pendant 1 à 5 jours à température ambiante. L’efficacité antifongique est évaluée par mesure du diamètre de croissance en suivant la formule suivante :

% inhibition de croissance = (Diamètre contrôle négatif- Diamètre radial sur PDA contenant la poudre de poireau) *100 / Diamètre contrôle négatif.

Le contrôle négatif correspond à une culture sur PDA sans traitement.

2.2 Détermination de l’activité antifongique de l’extrait a) Quantification au crystal violet

Le protocole mis en place est adapté aux champignons phytopathogènes présentant une capacité d’adhésion aux surfaces de polystyrene, par exemple les genres Alternaria ou Botrytis. Le crystal violet interagit avec les structures protéiques et l’ADN et permet de corréler l’intensité de coloration à la biomasse produite. L’extrait de poireau est préparé selon la méthode décrite à partir d’une concentration en poudre de 25 g/L.

100 pl de spores en suspension dans le milieu Potato Dextrose Broth (PDB) à une concentration de 10 ⁵ spores/mL sont réparties dans une plaque de 96 puits puis placées 50 minutes à 25°C. Les cellules planctoniques sont ensuite éliminées par un lavage avec 100 pL de PBS puis 100 pL de PDB2X sont ajoutés et mélangés à 100 pL d’extrait brut ou dilué pour obtenir des pourcentages d’extrait variant dans le milieu de 3,125% à 50%. Les cultures sont placées 4h30 à 25°C avant une première observation au microscope et quantification au crystal violet. Celle dernière peut également être mise en place après une incubation de 20h.

Pour la quantification au crystal violet, un lavage avec 100 pL de PBS est effectué puis la culture est fixée par 100 pL de méthanol avant une étape de coloration de 20 minutes avec 0,5% de crystal violet. Les cultures sont ensuite lavées de façon extensive pour éliminer l’excès de crystal violet. 150pL d’une solution à 33% d’acide acétique est ajouté pour resolubiliser le crystal violet avant une mesure d’absorbance à 590 nm. La croissance est comparée à celle d’une culture non traitée puis quantifiée :

% croissance = (Absorbance point expérimental - Absorbance contrôle positif) x 100/ Absorbance contrôle négatif

Le contrôle négatif correspond à une culture sans traitement

Le contrôle positif correspond à une culture contenant 50% d’extrait de poireau, condition sporicide.

2.3 Traitement des fruits post récolte

• Traitement avec l’extrait

Des mandarines issues de culture biologique ont subi un nettoyage de surface à l’eau claire puis une incision de 1 cm a été réalisée au scalpel dans la peau du fruit avant de l’inoculer avec 3pL d’une suspension comprenant 1000 spores de Pénicillium Digitatum dans une solution physiologique à 0,9% de NaCI. La poudre de vert de poireau hydratée (50 g/L) dans une solution véhicule (solution physiologique à 0,9% de NaCI) ou la solution véhicule a été introduite dans la blessure puis le fruit a été incubé à température ambiante dans une enceinte hermétique transparente.

La pulpe de tomates tranchées en deux a été inoculée avec un mélange comprenant 1000 spores de Rhizopus Stolonifer. Les spores ont été pré-incubés pendant 24h dans un mélange constitué de milieu PDB et d’un extrait de blanc de poireau ou d’une solution véhicule (0,9% NaCI) avant d’être ensemencées. Les tomates ont été incubées dans un récipient plastique scellé et transparent.

• Traitement avec la poudre

Des tranches de mandarines de 0,5cm d’épaisseur ont été inoculées avec une suspension de spores de Pénicillium Digitatum dans une solution physiologique (1000 spores/tranche). La poudre de vert de poireau a ensuite été répartie en surface du fruit tranché puis incubée à température ambiante dans un récipient plastique scellé et transparent.

2.4 Traitement des semences

Les graines de brocoli ont été choisies pour leur sensibilité aux deux pathogènes Alternaria agent causal d’alternariose et Botrytis agent causal de la pourriture grise. Les graines de brocoli sont mises à tremper 3 minutes dans une solution d’eau de javel à 2% puis rincées 3 fois dans l’eau. 500 pL d’une solution de spores d’ Alternaria ou Botrytis à 10 ⁴ spores/mL diluée dans l’eau stérile sont ajoutées à environ 70 graines de Brocoli qui sont infectées pendant 1 h - 1 h30 à température ambiante sous agitation douce. Après élimination de la solution, 1 mL d’eau ou d’extrait préparé à partir d’une macération aqueuse de poudre à 25 g/L est ajouté aux graines de brocoli puis laissé environ 4h à température ambiante. L’eau ou l’extrait est retiré puis les graines sont déposés à la surface d’une boîte de Pétri contenant 1 ,5% d’agar. Elles sont ensuite mises à germer dans une enceinte à l’abri de la lumière pendant 2 jours puis à la lumière ambiante 5 jours supplémentaires. Après 7 jours de culture, les plantules sont isolées puis mesurées (tiges et racines).

2.5 Evaluation des effets antifongiques de substances actives en milieu solide

Les lipopeptides ont été préalablement solubilisés dans les solvants recommandés par les fournisseurs. Brièvement, la surfactine et l’Iturine A ont été solubilisées dans de l’éthanol absolu à 10g/L. La Fengycine a été mise en solution à 1 g/L dans un tampon phosphate comprenant 0,1% de DMSO. La caspofungine a été solubilisée à 10 g/L dans de l’eau distillée. Les conditions contrôle de croissance ont été réalisées en présence des quantités adéquates de solvants lorsque nécessaire afin d’exclure d’éventuels effets synergiques attribuables à ceux-ci. Le sulfate de cuivre a été dissout dans de l’eau distillée à 200 g/L.

Afin d’évaluer les activités antifongiques de substances d’intérêt utilisées en combinaison, les différents agents ont été pré-mélangés dans l’ordre suivant : eau, extrait, SDS (si nécessaire), solvant (si nécessaire) puis lipopeptide. L’ensemble est ensuite mélangé à une gélose nutritive (PDA) puis déposé dans des plaques de culture cellulaire de 24 puits. Après solidification, les milieux sont ensemencés en surface avec 1000 spores d ’Alternaria alternata (en solution dans un mélange d’eau et de tween 80 à 0,05%). Les plaques sont incubées à température ambiante pour les différentes durées indiquées puis photographiées. Lorsque cela a été possible, le diamètre de croissance du champignon a été mesuré. Pour l’évaluation des effets combinés en milieu solide, les concentrations en extrait de poireau, en lipopeptide et en lauryl sulfate sélectionnées sont subtoxiques lorsque ces substances sont appliquées individuellement.

III. Résultats

3. 1 Activité antifongique de la poudre sèche

La figure 1 présente l’efficacité de la poudre dispersée dans un milieu de culture gélosé contre Pénicillium digitatum et expansum, Fusarium oxysporum et Alternaria alternata. La croissance radiale des moisissures est ralentie en présence de 1 g/L de poudre de vert de poireau (traitement) montrant une sensibilité différente d’un agent phytopathogène à l’autre, elle est complètement inhibée à partir de 5 g/L de poudre dans le milieu gélosé.

3.2 Effet de la granulométrie

A la figure 2, aucune germination de spores d Alternaria n’est observée par microscopie optique (X20) après un traitement par un extrait obtenu à partir de fractions comprises entre 90 pm et 700 pm (images B, C, et D) alors qu’une germination de spores est comparable au contrôle négatif (non traité) après traitement par un extrait obtenu à partir d’une fraction sèche de granulométrie supérieure à 700 pm (image A). Les flèches noires signalent la germination.

3.3 Effet sporicide et fongicide de l’extrait aqueux

La figure 3 montre l’effet sporicide de l’extrait de poireau sur Alternaria alternata observé après 4h de traitement d’un milieu de culture contenant des spores, ainsi qu’un effet fongicide obtenu après initiation de l’élongation des hyphes (Figure 3, panel A). Il est à noter que l’extrait présente une activité antifongique supérieure s’il est ajouté aux spores et que cette efficacité diminue lorsque l’extrait est ajouté après la germination et l’initiation de la croissance de la moisissure. La figure 3, panel B montre ainsi une inhibition complète de la germination des spores d Alternaria lorsque 12,5% d’extrait sont ajoutés au milieu de culture alors qu’à cette concentration, la croissance n’est inhibée que d’environ 50% à des stades de développement plus avancé (tubes germinatifs, hyphes précoces et hyphes tardifs). De façon similaire, une concentration de 25% d’extrait ne permet plus une inhibition totale de croissance sur des hyphes tardifs. Ces résultats laissent donc supposer qu’une application précoce de l’extrait est souhaitable pour optimiser son effet protecteur.

3.4 Traitement des fruits post-récolte

La figure 4 montre les effets protecteurs de la poudre de poireau saupoudrée sur des tranches de clémentines infectées par Pénicillium digitatum, puis laissées à température ambiante 4 à 5 jours (voir panel A). Des observations similaires sont réalisées si l’extrait aqueux de poireau est appliqué sur les clémentines infectées par introduction des spores au niveau d’une incision (Figure 4, panel B). Une protection de tomates infectées par Rhizopus stoloniferes également observée lorsque l’extrait est co-appliqué avec les spores sur des tomates (Figure 4, panel C).

3.5 Traitement des semences

L’infection de graines de brocoli par des agents infectieux fréquents tels qu’Alternaria ou Botrytis cinerea, agents causant respectivement les alternarioses et la pourriture grise peut être fortement limitée par un traitement par un extrait de poireau préparé à partir de 25g/L de poudre dans l’eau. La figure 5 montre (panel A et B) les dommages causés par les deux agents infectieux sur le développement des plantules, en particulier Botrytis qui limite fortement la germination des graines et la croissance de la plantule. Un traitement de quelques heures par trempage des graines dans l’extrait permet aux plantules de présenter une croissance et une répartition de la longueur des plantules comparable à celle du contrôle.

3.6 Potentialisation de l’effet antifongique avec d’autres produits

Pour en augmenter l’efficacité, l’extrait peut être formulé en combinaison avec différents composés qui potentialisent son activité. Il peut s’agir par exemple de substances capables de déstabiliser la paroi cellulaire des moisissures (Fait et al., 2019; Gonçalves et al., 2017; Jahan et al., 2020). Ces combinaisons peuvent permettre de réduire l’utilisation de la biomasse et/ou d’agents antifongiques exploités pour le biocontrôle dans le domaine de l’agriculture. i) Combinaison avec des détergents

L’extrait peut être utilisé à des concentrations réduites lorsqu’il est combiné à des détergents. Il peut notamment s’agir de détergents anioniques. Par exemple, lorsqu’il est employé avec 0,05% de lauryl sulfate de sodium, les concentrations requises en extrait pour atteindre une activité antifongique maximale peuvent être réduites de 10 fois par rapport à la concentration nécessaire pour atteindre un même effet par un traitement consistant à utiliser l’extrait seul (Figure 6, panel A).

Les détergents cationiques peuvent aussi être utilisés pour former avec l’extrait de poireau des combinaisons de traitements antifongiques efficaces. C’est par exemple le cas du CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) qui en combinaison avec l’extrait de poireau peut être exploité à des doses plus faibles tout en réduisant significativement les quantités de la biomasse de coproduit de poireau utilisées (Figure 6, panel B). Le profil écotoxique négatif du CTAB peut donc être diminué grâce à l’extrait de l’invention, notamment si l’utilisation de ce détergent s’avère nécessaire pour une application en tant qu’agent de contrôle. ii) Combinaison avec les sels de cuivre

Le cuivre est le traitement de biocontrôle le plus exploité dans l’agriculture. Bien qu’efficace, ce traitement est à l’origine de problèmes environnementaux lorsqu’il s’accumule dans les sols ou est lessivé dans les nappes phréatiques. L’exploitation de ce produit fait par conséquent l’objet d’une limitation règlementaire stricte des doses et des fréquences d’applications autorisées en champs (règlement d’exécution (UE) n° 2018/1981 du 13/12/18) Cette règlementation réduit la possibilité d’exploiter par les agriculteurs ce produit pourtant efficace. Les résultats démontrent que l’extrait aqueux de l’invention peut être exploité afin de réduire les doses de cuivre nécessaires pour atteindre un effet antifongique complet. (Figure 7, panel A). ill) Combinaison avec des lipopeptides

Les lipopeptides sont des peptides possédant des propriétés antimicrobiennes d’intérêt pour le domaine du biocontrôle. Cependant, leur utilisation est actuellement freinée par les quantités élevées de peptides devant être utilisées pour atteindre un effet antifongique significatif conduisant à des coûts d’exploitation excessifs (Comont et al., 2021 ).

L’extrait aqueux de l’invention peut être utilisé afin de potentialiser les effets de lipopeptides possédant des propriétés de biocontrôle. Par exemple, l’extrait aqueux de la poudre de poireau potentialise les effets antifongiques de la surfactine. La surfactine utilisée en traitement seul aux concentrations étudiées ne produit aucun effet antifongique significatif. En combinaison avec de l’extrait aqueux, la surfactine permet un gain d’efficacité antifongique supplémentaire (croissance du radiale du mycélium réduite de 40%) par rapport à la combinaison de l’extrait aqueux (Figure 7, panel B). iv) Combinaison avec des acides organiques

Les propriétés antifongiques d’acides organiques tels que l’acide lactique, l’acide acétique, l’acide propionique ont été montrées (Chaves et al., 2021 ; Hassan et al., 2015) et certains d’entre eux ont été ajoutés à la liste des produits de biocontrôle autorisés en agriculture.

L’effet antifongique de l’extrait de vert de poireau étant positivement corrélé à l’acidité du pH (Figure 8, panel A), la potentialisation de l’activité de l’extrait par les acides organiques a été évaluée. Il a ainsi été montré, par exemple, qu’une extraction réalisée par 0,012% (2 mM) d’acide acétique permet un gain d’efficacité de l’extrait. La figure 8 (panel B) montre qu’avec 6,25% d’un extrait aqueux préparé dans 0,012% d’acide acétique, aucun développement des spores d’Alternaria et croissance de la moisissure n’est détectable après 5 heures d’incubation alors que 12,5% d’extrait dans le milieu de culture sont nécessaires pour atteindre une inhibition complète de germination des spores d’Alternaria si l’extraction est réalisée dans l’eau. Une extraction réalisée par l’acide acétique permet donc d’augmenter l’efficacité de l’extrait de poireau d’un facteur 2 au minimum. v) Triple combinaison comprenant un extrait de poireau, un détergent et du sulfate de cuivre

Les résultats montrent une synergie des effets antifongiques sur A. Alternata lorsque l’extrait de poireau, un détergent et le sulfate de cuivre sont combinés. Une forte réduction de la concentration de sulfate de cuivre nécessaire à produire cet effet antifongique (Figure 9). En effet, aucune croissance n’est observée à partir d’une concentration de sulfate de cuivre de 1 g/L lorsqu’il est combiné avec 0,01% de lauryl sulfate et l’extrait aqueux à 5g/L ou à 10g/L. vi) Combinaison de l’extrait de poireau, d’un détergent et de lipopeptides

Une triple combinaison comprenant l’extrait de poireau, un détergent et des lipopeptides permet de réduire significativement les concentrations de lipopeptides et d’extrait nécessaires à produire un effet antifongique (Fig. 10 et 1 1 ). En effet, ces substances ont été utilisées à des concentrations sub-toxiques permettant une certaine croissance de A alternata lorsqu’elles sont testées seules, mais résultent en une réduction significative de la germination des spores et de la croissance de leurs hyphes lorsqu’elles sont combinées.

En conclusion, l’extrait aqueux de poudre de poireau peut être combiné à des produits de biocontrôle tels que les sels de cuivre ou des lipopeptides, des détergents en particulier les détergents anioniques, des acides organiques, en particulier l’acide acétique permettant un gain d’efficacité antifongique tout en diminuant les doses d’extrait et d’agent de combinaison.

3.6 Impact du procédé de transformation sur l’activité antifongique i) Effet de la découpe et de la température de séchage

La figure 12, montre l’impact de l’étape de découpe (Panel A) et de la température de séchage (Panel B) sur l’activité antifongique évaluée par mesure de croissance de la moisissure phytopathogène Alternaria par quantification au crystal violet. Les feuilles de poireaux sont découpées par les approches indiquées, puis soumises aux étapes suivantes du procédé (séchage à 40°C, broyage et extraction). Les résultats montrent qu’avec un extrait préparé à partir de lamelles ou tronçons séchés, aucune croissance n’est observable dès 6,25% d’extrait dans un milieu de culture. Lorsqu’un broyage des feuilles fraîches (fig. 12, panel A, « broyé frais ») de poireau se substitue à la découpe, l’activité antifongique diminue plus que significativement, voire risque de disparaître., elle n’est que d’environ 50% avec un extrait au 50 %, montrant ainsi un effet inhibiteur très altéré. Cette baisse d’activité pourrait s’expliquer par une oxydation, une volatilisation ou dégradation de certains composés actifs potentiellement associée à l’intervention d’enzymes spécifiques. Ce type de mécanisme a été précédemment décrit pour les composés organosoufrés ou les glucosinolates d’alliacées et de brassicacées (Miekus et al., 2020 ; Putnik et al., 2019; Sikorska-Zimny & Beneduce, 2021 ). Une absence de découpe conduit également à une perte d’activité notable (50% de croissance observée avec 50% d’extrait préparé à partir de feuilles entières) qui pourrait résulter d’une difficulté de séchage, puisque le taux d’humidité est de 14% après 48 heures de séchage.

En ce qui concerne la température de séchage, les résultats montrent que l’activité antifongique est affectée à partir de 60°C. Par exemple, la figure 12 (panel B) montre une absence de croissance d’ Alternaria traité par un extrait préparé à partir de tronçons séchés à 30 et à 40°C dès 6,25% d’extrait alors que cette inhibition est observable à partir de 25% d’extrait préparé à partir de tronçons séchés à 60°C. Un séchage à température modérée, tel que de 30° à 50° C, conduit donc à un taux d’humidité de l’ordre de 5 % permettant de garantir une activité antifongique optimale. En effet, des expériences supplémentaires (résultats non présentés) ont mis en évidence la perte d’activité antifongique de la poudre de poireau stockée dans un environnement saturé en humidité. Au contraire, un stockage de la poudre de poireau dans un environnement sec et à un pourcentage d’humidité d’environ 5% permet de conserver l’activité antifongique pendant des mois. En particulier, presque aucune perte d’activité n’a été relevée après un stockage à 4°C, 5% de taux d’humidité pendant 36 mois. ii) Effet de la concentration en poudre de poireau

La figure 13 montre l’impact de la concentration de l’extrait, notamment de la concentration de masse sèche utilisé pour l’élaboration de l’extrait et l’activité antifongique. Les concentrations de 10 à 20g de poudre de poireau par litre de solvant montrent une activité de l’ordre de 90% et sont donc préférées pour réaliser l’extrait. iii) Effet de la durée de macération de l’extrait

Comme illustré aux figures 14A et 14B, une inhibition complète de la germination des spores d’Alternaria peut être observée lorsque des spores sont incubées avec 12,5% d’extrait obtenu après une macération de 2 à 30 minutes de 25g/L de poudre alors qu’une germination partielle (flèches noires) est observée pour une macération prolongée à 1 h et 2h (Figure 14 B).

Toutefois, une activité antifongique conduisant à une inhibition complète de croissance est retrouvée à des concentrations supérieures en extrait lors de macérations de 1 et 2 heures (25% et 50% d’extrait dans le milieu nutritif) (Figure 14A).