Микробиологический препарат, предназначен для санации почвы и ремедиации загрязненной природной среды (грунт, почва, акватории) от диоксинов, стойких органических загрязнителей хлорароматического и фенольного профиля.

Из уровня техники известен препарат для биодеградации нефтепродуктов и способ его получения. Препарат включает ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС- 1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в количестве 1О ⁸ -1О ¹⁰ клеток/г. Способ получения препарата предусматривает раздельное культивирование вышеуказанных штаммов до содержания 10 ^п -10 ¹² мкл/мл. Готовят микробную ассоциацию смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов при соотношении Bacillus megaterium ВКМ В-396 - 15%, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328 - 15%, Pseudomonas putida ВКМ В- 1301 - 20%, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624 - 20%, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС-1269 - 30% до содержания бактерий 10 ¹² мкл/мл. Осуществляют напыление ассоциации в виде аэрозоля на глауконитсодержащий сорбент. Содержание глауконита в сорбенте составляет не менее 60%. Дальнейшее обезвоживание смеси проводят путем подачи подогретого до 40°С воздуха со скоростью 3-5 м/с до достижения влажности в конечном биопрепарате 5% и содержания клеток 10 ⁹ мкл/мл препарата (RU 2571219, опубл. 20.12.2015).

Также из уровня техники известен препарат для биодеградации нефтепродуктов, включающий ассоциацию бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС- 1269, иммобилизованную на глауконитсодержащем носителе в заданном количестве, и способ его получения. Способ получения препарата предусматривает раздельное культивирование штаммов бактерий Bacillus megaterium ВКПМ В-607, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ АС- 1269 до содержания клеток 10 ^п -10 ¹² мкл/мл. Проводят смешивание культуральных жидкостей в соотношении 2: 1 : 1 : 1 соответственно с последующим напылением клеток в виде аэрозоля на глауоконитсодержащий носитель при подаче подогретого до 40°С воздуха до достижения влажности в конечном препарате 4%. При достижении влажности в конечном биопрепарате 4% процесс прекращают. При этом в качестве носителя используют фракцию глауконита со средним диаметром частиц 600 мкм, подвергнутую термообработке при температуре 190°С до остаточной влажности 4%. Группа изобретений позволяет повысить степень очистки почв, грунта, морских, пресных и минеральных вод от нефти и нефтепродуктов (RU 2681831 опубл. 12.03.2019). В качестве наиболее близкого аналога выбран биопрепарат для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4, 5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси-а-пропионовой кислоты, 2- метил-4-хлорфенокси-а-пропионово� � кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси-а-пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси-а-масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]- 1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола. Биопрепарат представляет собой ассоциацию штаммов бактерий Pseudomonas putida ВКПМ В-10997, Bacillus cubtilis ВКПМ В-10999 u Rhodococcus erythropolis ВКПМ - Ас-1882 в массовом соотношении (1-2): (1-2): 1 . При этом биопрепарат, как правило, содержит дополнительно сорбент, органические, минеральные и стимулирующие добавки и обладает стимулирующей рост растений активностью и фунгицидными свойствами. Полученный биопрепарат вводят в виде водного раствора путем дождевания в загрязненный грунт, почву или промышленный сток в эффективном количестве (RU 2484131 опубл. 20.01.2013).

В настоящее время одной из важных проблем является очистки почвы и воды от стойких органических загрязнителей и нефтепродуктов, особо загрязненных промышленных зон, территорий, загрязненных пестицидами и промышленными особо опасными химическими отходами, утилизация химических могильников, восстановление почв после интенсивного химического сельского хозяйства.

Большую группу загрязнителей составляют хлорированные ароматические соединения. Они способны накапливаться в воде, почве, растениях, в живых организмах и передаваться по трофическим цепям. Хлорароматики обладают канцерогенными и мутагенными свойствами. Попадая в окружающую природную среду, хлорированные фенолы вызывают аллергические реакции, снижают иммунитет, нарушают обмен веществ, нарушают ход процессов в естественных экосистемах вплоть до уровня биосферы в целом. Хлорорганические соединения являются кумулятивными ядами, передаются по пищевым цепям, вызывая поражение следующих поколений. Хлорированные производные признаны международным сообществом веществами, представляющими значительную опасность для здоровья человека и окружающей среды. При этом даже малые концентрации некоторых СОЗ (POP) могут приносить существенный вред.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового бактериального препарата «КлинСойл» (CleanSoil), предназначенного для санации почвы и ремедиации загрязненной природной среды (грунт, почва, акватории) от диоксинов, стойких органических загрязнителей фенольного и хлорароматического профилей. Препарат применяется для биодеградации диоксинов (ПХДД и ПХДФ) и близких к ним по структуре веществ, фенольных и хлорароматических соединений, используемых в промышленности. (2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4,5,-Т), хлорфеноксиуксусной кислоты (ХФУК), фенола, 2,4-дихлорфенола, гексахлорфенола (ГХЦГ), тетраметилтиурамдисульфида (ТМТД) и дихлоральмочевины), при загрязнении ими почв, естественных водоемов и акваторий, сточных вод предприятий и территории промышленных зон химических, нефтехимических предприятий и полигонов ТКО и ТБО. Биопрепарат применяется для интенсификации процесса восстановления загрязненных компонентов окружающей среды, сокращения сроков их рекультивации и разложения загрязняющих веществ в стоках промпредприятий. Применение биопрепарата должно осуществляться как на основе визуального, так и химико- аналитического контроля степени загрязнения конкретного объекта. Используется биомасса клеток и культуральной жидкости в жидкой и сухой формах.

Технический результат заявленного изобретения заключается в высокой скорости очистки почв.

Технический результат достигается при использовании препарата бактериального в соответствии с описанной далее технологией применения для деградации диоксинов, очистки почвы и воды от стойких химических фенольных и хлорароматических соединений.

Препарат «КлинСойл» (CleanSoil) является ассоциацией штаммов бактерий-деструкторов, использующих диоксины, стойкие химические фенольные и хлор-ароматические соединения, углеводороды нефти и нефтепродуктов в качестве питательной среды и разлагающих их до нетоксичных метаболитов, воды и углекислого газа. В состав препарата входят депонированные во Всероссийской коллекции микроорганизмов:

1. Bacillus subtilis VKM B-3613D, На LB агаре формируют колонии от белого до кремового цвета, диаметром 2-3 мм. Края колоний ровные, поверхность выпуклая. На Триптон-соевом агаре образует колонии кремового цвета со складчатым краем. Грамположительные подвижные палочки (0,5x2, 0-3,0 мкм), размножаются бинарным делением, спорообразующие, споры овальные, не превышающие размер клетки, расположены центрально. Каталазоположительные и оксидазоотрицательные палочки. Строгий аэроб. Оптимально растут при температуре 28-30°С, pH 7,0-7, 5. Используют глюкозу, маннозу, фруктозу, сахарозу, сорбит. Штамм устойчив к нистатину, канамицину. Штамм применяется для деструкции пестицидов и гербицидов. Не патогенен для людей, животных и растений, идентифицирован секвенированием гена 16S рРНК.

2. Rhodococcus erythtropolis VKM Ac-2920D, Ha LB агаре формируют колонии кремового цвета, диаметром 2-3 мм. Колонии ровные, блестящие, выпуклые с ровным краем. Грамположительные неподвижные палочки (0,5-0, 7x1, 0-1, 5 мкм), неспорообразующие, возможно образование кокковой формы. Каталазо- и оксидазоположительные. Строго аэробные. Оптимально растут при температуре 28- 30°С. Используют маннит, сахароза, трегалоза, сорбит. Штамм устойчив к ампициллину, амоксициллину, амоксициллин/клавулоновой кислоте, азитромицину, левомицетину. Штамм является деструктор нефти и нефтесодержащих соединений, хлорароматических производных, фенола. Не патогенен для людей, животных и растений, идентифицирован секвенированием гена 16S рРНК.

3. Pseudomonas putida VKM B-3612D, На LB агаре формируют колонии кремового цвета, диаметром 2-3 мм. Колоний ровные, блестящие, выпуклые с ровным краем, выделяют флуоресцирующий пигмент. Грамотрицательные подвижные палочки (0,5-1, Ох 1,5-5, 0 мкм), неспорообразующие, размножаются бинарным делением. Каталазо- и оксидазоположительные. Строго аэробные. Оптимально растут при температуре 26-28°С, pH 6, 5-7, 5. Используют глицерин, глюкозу, мальтозу, фруктозу, этанол, бутанол, метанол, сукцинат, ацетат, малонат, лактат, цитрат и др. Сероводород не выделяют. Крахмал, желатин, Твин-80 не гидролизуют. Штамм устойчив к ампициллину, амоксициллину, нистатину, амоксициллин/клавулоновой кислоте, азитромицину, левомицетину, клотримазолу, цефазолину, цефиксиму, фурадонину. Штамм является стимулятором роста растений, деструктором пестицидов. Не патогенен для людей, животных и растений, идентифицирован секвенированием гена 16S рРНК.

Заявленный бактериальный препарат «КлинСойл» (CleanSoil) по сравнению с аналогами имеет более высокое содержание бактерий в жидкой и сухой форме, а также предполагает более низкий расход препарата 200-400 гр на гектар. Концентрация действующего вещества: титр не менее 1 х 10 ⁹ КОЕ/мл.

Препаративная форма (внешний вид): однородный порошок, возможны мелкокристаллические включения (сухая форма) или жидкость, может содержать осадок или пленки белого цвета (жидкая форма) (в соответствии и. 4.2. требованиям ТУ 20.15.79- 002-77521117-2019).

Период эффективного действия:

Период биологической деградации загрязняющих веществ действует с момента обработки, в течение теплого периода, при условии отсутствия источников повторного загрязнения. При необходимости повторить обработку в следующие сезоны положительных температур окружающей среды.

В настоящее время на рынке не представлено ни одного бактериального препарата близкого своим действием к заявленному изобретению, применения его для интенсификации процесса восстановления загрязненных компонентов окружающей среды, сокращения сроков их рекультивации и разложения загрязняющих веществ в стоках промпредприятий. Очистка препаратом «КлинСойл» (CleanSoil) реализуется путем внесения продукта в грунт с помощью прямого впрыскивания (инъектирования) при глубинном загрязнении от 1.5 метров, либо полива (дождевания) при поверхностном загрязнении до 1.5 метров. Применение препарата CleanSoil путем впрыскивания осуществляется инъектированием требуемой дозы на нескольких глубинах через специальный инжектор в столб целевых грунтовых вод.

В зависимости от конкретного объекта могут быть разработаны отдельные рекомендации по инъекциям в целях максимизации распределения продукта по течению грунтовых вод. Важной задачей является разработка эффективных инъекций, которые при этом остаются в целевой области загрязнения, не размываются и не распространяются дальше необходимого радиуса.

Расстояние перемещения препарата от точки впрыскивания является радиусом действия. Радиус действия зависит от проницаемости почв, в которые происходит впрыскивание, так, в случае более проницаемых песка и гравия, радиус действия препарата больше.

Инъектирование препарата CleanSoil, как правило, происходит в те же проницаемые зоны почвогрунта, по которым происходит контаминация. Эти слои высокого потока загрязняющих веществ известны как градиент загрязнения. Инъектирование препаратом CleanSoil в соответствии с градиентом загрязнения позволяет, во-первых, остановить и локализовать контаминацию, а во-вторых, ликвидировать загрязнение в принципе. Точное определение вертикальных и горизонтальных профилей градиента загрязнения позволяет осуществлять более эффективные и недорогостоящие работы по ремедиации. По мере распространения препарата, он смешивается с грунтовыми водами, что позволяет начать процесс восстановления. Максимальный радиус действия можно рассматривать как расстояние, на котором можно наблюдать действие инъекции препарата. Однако из-за неоднородности почв маловероятно, что препарат будет распределяться равномерно во всех направлениях. На внешнем контуре радиуса действия количество активных частиц препарата будет ниже, чем в центре радиуса. Расстояние, на которое распространяется препарат, будет также изменяться как по вертикали, так и по горизонтали в зависимости от точки инъектирования. Таким образом, если инъекции разрабатываются с использованием максимального радиуса действия, то области между точками инъектирования могут получить меньше активных клеток препарата и, соответственно, меньше восстановления.

Для достижения равномерного и эффективного горизонтального распределения препарата в целевой зоне разрабатываются определенные «перекрещивающиеся» радиусы действия. Это гарантирует, что все области получают эффективную для полного восстановления дозу препарата. «По вертикали» каждая инъекция так же имеет определенный радиус действия, который будет регулироваться дозой препарата и его степенью смешения и разбавления. Если же при проектировании прямого впрыскивания интервал между инъекциями будет слишком широк, недодозирование между точками инъекций в некоторых случаях может привести к «прорыву» загрязнения и дальнейшей контаминации территорий. Обеспечивая правильное пересечение радиусов действия инъекций, равномерная доза препарата распространяется по всей площади как градиента загрязнения, так и по всей загрязненной территории. При быстром течении грунтовых вод или чрезвычайно сильной концентрации поллютантов в градиенте загрязнения может потребоваться большее количество рядов для создания более обширной зоны обработки вдоль потока загрязняющих веществ. Эти ряды инъекций также должны перекрываться и создавать так называемый «шахматный порядок» инъекций для дальнейшего обеспечения равномерного распределения препарата и эффективной ремедиации.

Если восстановление требует применения на всей площади территорий, то проектируется так называемая «сетка инъекций». В случае, если сетка спроектирована так, что радиусы действия препарата только соприкасаются и не перекрывают друг друга, то это может привести к появлению зон, которые могут не получить активных клеток препарата и обработки в принципе. Используя комбинацию блокирующих и пересекающихся радиусов действия, можно добиться равномерного и эффективного распределения препарата по всей целевой области контаминации. Такой метод прямого впрыскивания (инъектирования) позволяет произвести эффективную очистку практически любого объекта накопленного вреда окружающей среде или другой загрязненной территории вне зависимости от типа и сложности почвогрунтов.

Микроорганизмы в составе препарата «КлинСойл» (CleanSoil) выделяют в окружающую среду ряд гидролитических ферментов, активно расщепляющих молекулы загрязнителей на нейтральные метаболиты, при полном разложении до углекислого газа и воды.

Действие биопрепарата оценивается как на основе органолептических изменений, так и химико- аналитического контроля степени загрязнения конкретного объекта.

Были проведены испытания подтверждающие высокую активность препарата.

Проведены лабораторные исследования проб почвогрунта, сточной воды и содержимого шламонакопителя, расположенного на бывшей территория ОАО «Химпром». По результатам работ в настоящий момент можно сделать следующие выводы:

1. Изучение проб жидкой фазы шламонакопителя №6 после обработки препаратом CleanSoil обнаружило существенное снижение суммарной концентрации ПХДД/Ф, выраженной в эквивалентах токсичности TEQ с 7155 иг / кг до 7, 2 иг / кг в системе 1- TEQ (международная) или с 10649 до 10, 6 иг / кг в системе WHO-TEQ (ВОЗ).

2. Исследование сточной воды резервуара усредненного потока насосной показало, что суммарная концентрация фенолов составляет 1,9 мг/ дм ³ . При воздействии препарата «КлинСойл» (CleanSoil) суммарная концентрация фенолов снижается до 0,01 мг/ дм ³ .

3. По результатам анализа почвогрунта цеха фасовки гербицидов суммарная концентрация ПХДД/Ф, выраженная в диоксиновом эквиваленте токсичности I-TEQ равна 1385 иг / кг в системе 1- TEQ (международная), что соответствует 1556 иг / кг в системе WHO-TEQ (ВОЗ).

Изучение проб почвогрунта после обработки препаратом «КлинСойл» (CleanSoil) обнаружило снижение суммарной концентрации ПХДД/Ф, выраженной в эквивалентах токсичности TEQ с 1385 нг/кг до 814 нг/кг в системе 1- TEQ (международная).

Экспериментальные лабораторные исследования подтверждают эффективность применения технологии «КлинСойл» (CleanSoil) для очистки от профильных загрязнений территории бывшего ОАО «Химпром». Место отбора и характеристика проб

В пробе сточной воды резервуара усредненного потока насосной станции (проба №2) суммарная концентрация фенолов составила 1,9 мг/ дм ³ . В образце пробы №2, подвергнутом воздействию препарата «Клинсойл» (CleanSoil), суммарная концентрация фенолов снижалась до 0,01 мг/ дм ³ .

Анализ образца почвогрунта песколовки насосной станции (проба №5) и образца почвогрунта, отобранного возле цеха фасовки гербицидов (проба №9), обнаружил большое валовое содержание алюминия, железа, кадмия, марганца, меди, мышьяка, никеля, ртути, свинца, хрома и цинка.

Исследование образца жидкого содержимого из шламонакопителя №6 (проба № 6) на содержание полихлорированных дибензо-п-диоксинов и дибензофуранов (ПХДД/Ф) с определением высокотоксичных 2,3,7,8-замещенных конгенеров и суммарных концентраций конгенеров со степенью хлорирования от 4 до 8 показало, что суммарная концентрация ПХДД/Ф выраженная в эквивалентах токсичности TEQ равна 7155 пг / кг в системе 1- TEQ (международная), что соответствует 10649 пг / кг в системе WHO-TEQ (ВОЗ).

В образце жидкой фазы шламонакопителя №6 после обработки препаратом «КлинСойл» (CleanSoil), обнаружено существенное снижение суммарной концентрации ПХДД/Ф, выраженной в эквивалентах токсичности TEQ с 7155 пг / кг до 7, 2 пг / кг в системе 1- TEQ (международная) или с 10649 до 10, 6 пг / кг в системе WHO-TEQ (ВОЗ).

Следует отметить, что полихлорированные дибензо-п-диоксины и дибензофураны относятся к веществам 1 класса опасности. Обнаруженные в ходе работы концентрации диоксинов существенно превышают норматив для опасного загрязнения 1 пг/ л в воде (ПКД/ОДУ химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водоспользования. ГН 2.1.5.1315-03/2.1.5.2307-07. Гигиенические номативы. - М.: Минздрав РФ, 2003, 2008).

Результаты проведенного анализа также указывают на сложный состав ПХДД/Ф шламонакопителя №6, что свидетельствует о наличии нескольких источников диоксинового загрязнения территории.

Изучение пробы почвогрунта цеха фасовки гербицидов (проба № 9) на содержание полихлорированных дибензо-п-диоксинов и дибензофуранов (ПХДД/Ф) с определением 2,3,7,8-замещенных конгенеров и суммарных концентраций конгенеров со степенью хлорирования от 4 до 8 показали, что суммарная концентрация ПХДД/Ф, выраженная в диоксиновом эквиваленте токсичности I-TEQ равна 1385 пг/кг в системе 1- TEQ (международная), что соответствует 1556 пг / кг в системе WHO-TEQ (ВОЗ).

В пробе почвогрунта цеха фасовки гербицидов (проба №9) после обработки препаратом обнаружено существенное снижение суммарной концентрации ПХДД/Ф, выраженной в эквивалентах токсичности TEQ с 1385 пк/кг до 814 пк/кг кг в системе 1- TEQ (международная). Экспериментальные данные по эффективности применения препарата «КлинСойл» (CleanSoil) в лабораторных условиях суммированы в таблице 1.

Таблица 1. Эффективность применения бактериального препарата «КлинСойл» (CleanSoil) Таким образом на примере лабораторных исследований образцов № 6 и № 2 можно увидеть, что применение предложенного препарата «КлинСойл» (CleanSoil) снижает концентрацию профильных загрязнителей территории бывшего ОАО «Химпром».

Были проведены испытания в ООО «Научно-исследовательский институт безопасности жизнедеятельности» (ООО НИИ БЖД).

Наименование образца испытаний: Грунт

Цель испытания, основание: Выполнение лабораторных исследований природных вод, почв, грунтов, донных отложений, атмосферного воздуха

Наименование объекта заказчика: Территория предприятия Уфанефтехим

Место отбора пробы: Контроль, проба грунта, загрязненная нефтепродуктами без очистки, гл. 0-20 см

Дата проведения анализа: 18.11.2021 - 07.12.2021

Результаты анализа:

Проба 1.

Проба 2.

Сведения о средствах измерений и испытательном оборудовании: В результате испытаний было зафиксировано снижение концентрации нефтепродуктов в 4 и более раз.

Отработанный состав бактериального препарата «КлинСойл» (CleanSoil), а также высокая совместимость бактериальных штаммов, входящих в состав сухой и жидкой формы, обеспечивает высокую синергическую активность бактерий на почвах, сточных и грунтовых водах, загрязненных ПХБ.

Оптимальное соотношение микроорганизмов и более простой состав компонентов препарата обуславливают простоту применения и обеспечивают эффективную деградацию пестицидов и других поллютантов, относительно которых применяется препарат.