1. Hintergrund der Erfindung Als Angiogenese wird der morphogenetische Prozess bezeichnet, bei dem neue Kapillaren gebildet werden, die bei (höheren) multizellulären Tieren zur Versorgung der Gewebe mit Blut dienen. Dieser Prozess, der sowohl bei physiologischen Vorgängen wie der Gewebebildung als auch bei pathophysiologischen Veränderungen wie dem Wachstum von Tumoren abläuft, wird über eine Reihe von Signaltransduktionswegen gesteuert (Übersicht : Harris AL : Current status of antiangiogenetic factors. Br J Haematol 109 : 477-489,2000). Obwohl der zugrunde liegende Mechanismus bereits seit 1971 bekannt ist (Folkman J : Tumor angiogenesis : tumor implications. N Engl J Med 285 : 1182-1186,1971), wurden darauf aufbauende therapeutische Strategien erst in den letzten Jahren intensiv entwickelt (Übersicht : Brower V : Tumor angiogenesis-new drugs on the block. Nature Biotechnology 17 : 963-968, 1999). Heute stellt die Beeinflussung von angiogenetischen Prozessen ein bevorzugtes Forschungsfeld für biotechnologisch ausgerichtete Untersuchungen dar, die das Ziel verfolgen, neue Tumortherapeutika aufzufinden.

Eine Reihe von niedermolekularen, meist synthetisch hergestellten organischen Substanzen lassen eine anti-angiogenetische Potenz sowohl in In-vitro-

als auch in In-vivo-Modellen vermuten und sind deshalb von therapeutischem Interesse. Der Vorteil, den bioaktive Naturprodukte, die als sogenannte Sekundär- Metabolite insbesondere von Schwämmen-den ursprünglichsten Tieren-gebildet werden, ist offenbar. Schwämme sind als sessile Filtrierer in besonders hohem Maße auf Bildung von Sekundär-Metaboliten angewiesen. Diese Tiere benutzen diese Substanzen nicht nur zur Abwehr von Mikroorganismen, sondern auch von multizellulären Tieren, die ein Blutgefäßsystem ausbilden, und offenbar auch zur morphogenetischen Steuerung der Ausbildung ihres eigenen "Vaskularisierungssystems", des Wasserkanalsystems. Die letztgenannte Wirkung war überraschend.

Erst nachdem in Schwämmen Gene aufgefunden worden waren, die für Liganden und deren Rezeptoren codieren, die an der Regulation der Angiogenese bei höheren Tieren beteiligt sein können, konnte ein rationales Screening zum Auffinden derartiger Substanzen angegangen werden. Naturprodukte (Sekundär-Metabolite), die bioaktive Wirkung zeigen, scheinen synthetisch hergestellten Chemikalien meist überlegen zu sein. So konnten die bioaktiven Sekundär-Metabolite von Schwämmen, die bereits vor über 800 Millionen Jahren auftraten, während dieser langen Zeit auf optimale Wirkung hin selektioniert werden. Die Evolution hat damit die aufwendigen Synthese-und Selektionsverfahren, die bei der Entwicklung neuer Leitstrukturen mit Hilfe der kombinatorischen Chemie benötigt werden, übernommen.

Die Angiogenese wird von intrazellulären Molekülen/Liganden gesteuert, die mit ihren entsprechenden Rezeptoren wechselwirken. Als Beispiele seien die Proteine aus der Reihe der Angiostatine (endogene Inhibitoren der Angiogenese) genannt, welche die Funktion von Wachstumsfaktoren (die z. B. an den VEGF/VEGF-Rezeptor binden) hemmen, sowie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (der mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zusammenwirkt) oder der vaskuläre, endotheliale Wachstumsfaktor (mit dem entsprechenden Rezeptor). Das aufeinander abgestimmte Wechselspiel dieser Systeme kontrolliert die physiologische/ pathophysiologische Ausbildung der Gefäße und Kapillaren.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, neue bioaktive Substanzen bereitzustellen, die sich zum Einsatz gegen Tumoren und/oder zurVerhinderung der Angiogenese allgemein, insbesondere aber der Angiogenese bei Tumoren eignen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Verbindung der allgemeinen Formel 2 :

wobei Rl entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Cl- Cis-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein monosubstituiertes oder polysubstituiertes, gerades, verzweigtes oder cyclisches C1- Cis-Alkenyl oder eine Acylgruppe, wie z. B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder Heteroatom-oder arylsubstituierte Acylgruppen sein kann, und R bis R6 unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Cl-Cl8-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl-oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z. B.

Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom-oder arylsubstituierte Acylgruppe, ein Alkoxysubstituent, wie z. B.-OMe,-OEt,-OnPr,-iPr,-OnBu,-OiBu,-OsecBu,- OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie z. B. -SMe,-SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B.-S03H,-SO2Me,-S02CF3,-S02C6H4CH3 oder S02C6H4CH2Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z. B.-NH2,-NHR,-NRR' (mit R, R'= Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkenyl),-NC oder-N02, oder Fluor, Chlor, Brom, Iod, - CN oder ein Heterosubstituent sind, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder Solvate der Verbindung.

In einer Ausführungsform ist Rl = CH3 und R2-R6 = H.

In einer anderen Ausführungsform ist Rl = CH3, R2 = SCH3 und R3-R6 = H.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist Rl =-CH2-CH (CH3) 2 und R2-R6= H. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist Rl =-C (CH3) 3 und R2-R6 = H.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassend das Züchten eines Bakteriums in Kulturmedium, wobei besagtes Bakterium mit dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 verwandt ist, 99% Sequenzidentität hinsichtlich der rDNA zu dem alpha- Proteobakterium MBIC3368 aufweist und mit dem marinen Schwamm Dysidea avara assoziiert vorkommt, und Isolieren mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 aus dem Kulturmedium und/oder der Bakterienbiomasse, wobei das Isolieren mindestens einen der folgenden Schritte umfaßt : a) Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem Cl-C6-Alkohol, bevorzugter n-Butanol, b) Gelfitration.

Bevorzugt umfaßt das Verfahren weiterhin eine anschließende synthetische Derivatisierung der isolierten Verbindung.

In einer anderen Ausführungsform wird eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung aus einem Schwamm der Spezies Suberites domuncula isoliert, bevorzugt durch Extrahieren in an sich bekannter Weise, oder eine erfindungsgemäße Substanz wird durch Züchten eines Bakteriums, das mit dem Schwamm Suberites domuncula assoziiert ist, und anschließendes Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel und/oder Gelfiltrieren isoliert.

Ebenso wird die Aufgabe gelöst durch eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als Medikament, ebenso wie durch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zusammen mit geeigneten Zusatz-oder Hilfsstoffen.

Bevorzugt liegt die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vor.

In einer Ausführungsform liegt die Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit vor, wobei eine Dosierungseinheit die Verbindung nach einem der

Ansprüche 1-5 in einer Menge enthält, die im Bereich von 5 ig bis 50 u. g, bevorzugt von 10 ug bis 40 ug, bevorzugter von 15 llg bis 30 ug, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 u. g liegt.

In einer Ausführungsform liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge vor, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich 0,3 bis 3,0 pg/ml liegt.

Bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung weitere Chemotherapeutika.

In einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vor.

Die Aufgaben der Erfindung werden ebenso gelöst durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Infektionen durch gram-negative Bakterien, ebenso wie durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung von Angiogenese, wobei bevorzugt wird, daß die Angiogenese bei Tumorerkrankungen verhindert oder gehemmt wird.

Die Aufgaben der Erfindung werden ebenso gelöst durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung der neointimalen Proliferation, wobei bevorzugt wird, daß die Verbindung auf einen Stent aufgebracht wird, bevorzugt als Beschichtung.

In einer Ausführungsform liegt die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer vor, zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung in einer Menge eingesetzt, die im

Bereich von 5) g bis 50 ug, bevorzugt von 10 llg bis 40 ug, bevorzugt von 15 ug bis 30 ug, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 llg liegt.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung in einer Menge eingesetzt, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich von 0, 3 bis 3,0 pg/ml liegt.

Das phylogenetisch älteste Liganden/Rezeptor-System, das die Angiogenese kontrolliert, ist das CD36-Thrombospondin-System (TSP-System) (Calvo D ; Dopazo J, Vega MA : The CD36, CLA-1 (CD36L1), and LIMPII (CD36L2) gene family : cellular distribution, chromosomal location, and genetic evolution. Genomics 25 : 100- 106,1995). CD36, zuerst auch Glycoprotein IV genannt, wurde zunächst auf den Membranen von Blutplättchen nachgewiesen. Wenn der spezifische Ligand, das Thrombospondin (TSP), an den CD36-Rezeptor bindet, kommt es zur Hemmung der Angiogenese. Von den Erfindern konnte unter Zuhilfenahme molekularbiologischer Methoden nachgewiesen werden, dass auch die Schwämme-als die phylogenetisch ältesten Tiere-bereits ein Mitglied aus der CD36-Rezeptor-Familie besitzen. Als Untersuchungsmodell diente der Meeresschwamm Suberites domuncula. Darauf aufbauend wurde erfolgreich ein Screening nach dem entsprechenden Liganden durchgeführt, der dann auch mit Hilfe der PCR-Technik aufgefunden wurde. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Ligand das für das TSP spezifische Bindungsmotiv aufweist. Durch Funktionsanalysen und unter Anwendung eines rekombianten TSP-verwandten Polypeptids konnte gezeigt werden, dass dieses Molekül in S. domuncula als Modellsystem die Ausbildung des Kanalsystems, durch welches das umgebende Meerwasser durch den Schwamm geleitet wird, hemmt. Die chemische Struktur diese Substanz ist ein 2-Methylthio-1, 4-naphthochinon (MTN).

Aufbauend auf diesem In-vivo-Modell konnte nun ein Naturstoff identifiziert werden, der von einem in einem Schwamm vorkommenden Mikroorganismus (Bakterium) gebildet wird. Es kann angenommen werden, dass dieses Bakterium eine Co- Evolution mit. dieser ursprünglichen Tierspezies (Schwamm) durchgemacht hat.

Daraus kann man ableiten, dass dabei MTN als funktionell hochaktiver und hochspezifischer Wirkstoff herausselektioniert wurde.

Nach der Aufklärung der Wirkungsweise von MTN im homologen System (d. h. S. domuncula) wurde geprüft, ob MTN auch eine Wirkung in einem heterologen Modellsystem besitzt ; hierzu wurde das als sehr geeignet angesehene Modell der Chorioallantois-Membran (CAM) des Hühnchenembryos (Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kubai L, Akhtar N : Angiogenesis assays : a critical overview. Clinical Chem. 49 : 32-40,2003) ausgewählt. Überraschenderweise wurde hierbei gefunden, daß die erfindungsgemäßen Substanzen, insbesondere MTN ebenso wie DMTN und die Derivate der Ansprüche 4-5 das Wachstum der Kapillaren, die von dem zentralen Blutgefäß ausgehen, schon bei sehr niedrigen Dosen hemmen.

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäßen Substanzen, insbesondere MTN, DMTN und die Derivate der Ansprüche 4-5 bei höheren Konzentrationen eine Hemmung der Zellteilung von Tumorzellen bewirken.

Diese Zelltoxizität ist sogar tumorspezifisch ; am empfindlichsten werden lymphatische Tumoren gehemmt.

Auf Grund dieser Daten stellen MTN und seine Derivate sehr vielversprechende Substanzen zur Therapie von Tumoren dar, speziell von solchen, die nur aufgrund einer intensiven Vaskularisierung an Größe zunehmen können.

Insbesondere ist zu erwarten, dass das Wachstum von solchen Tumoren (z. B.

Karzinomen) gehemmt wird, die aus der TNM/Tl-Phase in die TNM/T2-und insbesondere die TNM/T3-Phase übergehen. Während dieses Prozesses kommt es zu einer intensiven Vaskularisierung. Verstärkt wird die Vaskularisierung-abhängige Hemmung des Tumorwachstums durch den zytotoxischen Effekt (bei höheren Dosen eintretende Proliferationshemmung von Tumorzellen) von MTN und seinen Derivaten.

Als weitere Anwendung dieser überraschenden Hemmung der Vaskularisierung kommt die Anwendung bei der Beschichtung von Stents in Betracht.

Ziel einer medikamentösen Stent-Beschichtung ist es, die neointimale Proliferation zu

hemmen, um über. diesen Weg eine Wiederverengung der Blutgefäße nach Implantation eines (Edelstahl) stents zu verhindern. Die bisherigen Versuche zur neointimalen Proliferations-Hemmung durch Gold oder weitere anorganische Materialien haben sich als nicht erfolreich erwiesen. Jedoch scheint sich eine Anwendung von Stent-Beschichtungen mit organischen bioaktiven Substanzen, wie Rapamycin, als potentiell erfolgversprechend zu erweisen. Ziel der Stent- Beschichtung ist es, die Thrombozytenadhäsion zu vermindern und die Proliferation der glatten Muskelzellen zu hemmen. Deshalb ist hier auch ein Weg aufgezeigt, durch kovalente Verbindung der zur Patentierung vorgeschlagenen Substanzen mit Polymeren einen Überzug für die Stents herzustellen.

Zur kovalenten Bindung der zum Patent vorgeschlagenen Substanzen an das polymere. Trägermaterial ist es möglich, die Verbindungen zum jeweiligen Hydrochinon zu reduzieren und über die 4-OH-Gruppe durch eine Esterbindung mit einer langkettigen Carbonsäure zu verknüpfen (siehe Abbildung), deren anderes Ende mit dem Polymer verbunden ist. Das im Körper durch Lipasen freigesetzte Hydrochinon wird spontan zum Naphthochinon, dem eigentlichen Wirkstoff, oxidiert.

Über die Kettenlänge der als"Spacer"verwendeten Carbonsäure lässt sich die Geschwindigkeit der hydrolytischen Freisetzung des Wirkstoffs, und somit dessen Konzentration, regulieren. 0 Polymer o Spacer 4 SMe OH Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die stark bioaktive Substanz aus einem marinen Organismus bzw. einem assoziierten Mikroorganismus zur potentiellen Therapie von Tumoren darzustellen. Dazu werden dessen Herstellung und dessen Verwendungen dargelegt.

2. MTN und MTN-Derivate Erfindungsgemäß wird die oben genannte Aufgabe zunächst durch die Substanz MTN und die MTN-Derivate als bioaktive Substanzen gelöst. Es ist überraschend, dass in

den hier angewandten Tumorsystemen eine so stark ausgeprägte Antitumor-Aktivität, wie weiter unten diskutiert, nachgewiesen werden konnte. Weiterhin war unbekannt, dass MTN oder dessen Abkömmlinge anti-angiogenetische Aktivität aufweisen.

Dieser Effekt tritt überraschenderweise bereits bei sehr geringen Dosen bzw. beim Einsatz von kleinen Mengen im Bereich von 0,2 ng-2 ng auf, die lokal bereits zu einer Hemmung bzw. vollständigen Verhinderung der Angiogenese führen.

Weiterhin wurde gefunden, dass MTN und die abgeleiteten MTN-Derivate der allgemeinen Formel 2 ausgeprägte Antitumor-Eigenschaften besitzen.

Erfindungsgemäß sind somit Verbindungen der allgemeinen Formel 2 : worin Rl entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1- Cis-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein monosubstituiertes oder polysubstituiertes, gerades, verzweigtes oder cyclisches Cl- Cis-Alkenyl oder eine Acylgruppe, wie z. B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder Heteroatom-oder arylsubstituierte Acylgruppen sein kann, und R2 bis R6 unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes Ci-Cis-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl-oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z. B.

Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom-oder arylsubstituierte Acylgruppe, ein Alkoxysubstituent, wie z. B.-OMe,-OEt,-OnPr,-iPr,-OnBu,-OiBu,-OsecBu,- OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie z. B. -SMe,-SEt, oder eine

Sulfonylgruppe, wie z. B.-S03H,-SO2Me,-S02CF3,-S02C6H4CH3 oder S02C6H4CH2Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z. B.-NH2,-NHR,-NRR' (mit R, R'= Alkyl, Aryl, Heteraryl, Alkenyl.),-NC oder-NO2, oder Fluor, Chlor, Brom, Iod, - CN oder ein Heterosubstituent sind.

Für die hier erstmals als Naturstoff beschriebene Verbindung 2-Methylthio-1, 4- naphthochinon (MTN) gilt Rl = CH3 und R2-R6 = H. Das synthetische Derivat 2,3- Dimethylthio-1, 4-naphthochinon (DMTN) besitzt das Substitutionsmuster Rl = CH3, R2 = SCH3 und R3-R6 = H.

Weiterhin wurde gefunden, dass MTN sowie die MTN-Derivate eine ausgeprägte und nicht vorhersehbare antitumorale und anti-angiogenetische Eigenschaft besitzen.

Aufgrund dieser Eigenschaft und basierend auf dem Befund, dass MTN und die MTN-Derivate weitgehend untoxisch für Säugetiere (Beispiel Maus) sind, sind die hier beschriebenen Substanzen zur Behandlung von Tumoren im allgemeinen und speziell von solchen Tumoren, deren Wachstum von einer Vaskularisierung abhängt, geeignet. Daneben ist der Einsatz zur Behandlung/Verhütung von Restenose- Prozessen angezeigt. Es wird empfohlen, diese Substanzen entweder in der vorliegenden Form oder in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz anzuwenden.

Die genannten antitumoralen bzw. anti-angiogenetischen Eigenschaften waren ebenso bei den Derivaten der Ansprüche 4 und 5 in gleicher Weise und Wirksamkeit wie bei MTN festzustellen.

Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können mit den üblichen Lösungsmitteln, Hilfs-und Trägerstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions-und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu finden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer oben genannten Verbindung, das MTN, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Substanz

bevorzugt aus einem marinen Organismus, wie zum Beispiel einem marinen Bakterium, das mit dem Schwamm Dysidea avara assoziiert vorkommt, isoliert wird.

Wie hierin verwendet, soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem "Derivat"eine von der allgemeinen Formel (2) abgeleitete Verbindung verstanden werden, die z. B. durch verschiedene der oben für Rl-R6 angegebenen Restgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die z. B. auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen Daten oder Daten über den Behandlungserfolg oder-verlauf abgestimmt zu einem"personalisierten"Medikament verarbeitet werden können.

Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung der Klasse der 2-Methylthio-1, 4- napthochinone verstanden, die aus anderen (z. B. ) marinen Organismen isoliert werden kann, als den hier (beispielhaft) erwähnten.

Unter einem"Vorläufer"einer Substanz soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z. B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, daß sich als wirksame Substanz die erfindungsgemäße Verbindung oder deren Derivate bilden. Zum anderen werden als Voräufer aus Organismen isolierte Derivate von 2- Methylthio-1, 4-napthochinon verstanden, die bereits die hierin angegebenen Eigenschaften des 2-Methylthio-1, 4-naphthochinon aufweisen.

3. Formulierungen Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer der oben genannten Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, wie z. B. von Tumorerkrankungen.

Diese Verwendung kann zum Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen. Im Falle der Behandlung von Tumoren kann eine Behandlung in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 10 mg/kg Köpergewicht erfolgen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mit

geeigneten Zusatz-oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit. einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.

Besonders bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge vorliegt oder in denen die erfindungsgemäße Verbindung in solch einer Menge zugesetzt wird, dass ein Konzentrationsbereich zwischen 0,3 und 3, 0 ug/ml (Blutspiegel) bei der Behandlung in vivo vorliegt.

Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung ~ gemäß der vorliegenden Erfindung, die weitere Chemotherapeutika enthält. Diese Chemotherapeutika können alle für den Fachmann üblichen Chemotherapeutika im Rahmen einer Krebstherapie umfassen (z. B. Taxol oder anti-angiogenetische Verbindungen wie Bayl2-9566).

Erfindungsgemäß kann die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt.

Erfindungsgemäß können die Verbindungen in organische Matrizes eingebracht werden, die z. B. als Überzug für Stents therapeutisch eingesetzt werden können. Hierzu werden die erfindungsgemäß eingesetzten Substanzen derivatisiert mit dem Ziel, einen Linker an den bioaktiven Substanzen anzubringen. Über diesen Linker werden die Naphthochinone an ein organisches Polymer verknüpft. Als Linker kann dabei eine langkettige Carbonsäure verwendet werden, die über eine Esterbindung mit der 4-OH-Gruppe des zum Hydrochinon reduzierten Wirkstoffs verbunden wird. Die Freisetzung des Hydrochinons wird durch körpereigene Lipasen bewirkt. Das Hydrochinon wird anschließend spontan zum bioaktiven Naphthochinon oxidiert.

Als weitere Anwendung zur Herstellung eines Überzuges von Stents mit den erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden diese unter Ausnutzung der aromatischen Eigenschaft der Substanz nicht-kovalent in eine ebenfalls aromatische Matrix eingeschlossen. Die physiko-chemische Reaktion, die zu dieser Reaktion führt, ist Stand der Technik.

Kurze Beschreibung der Figuren : Figur 1 zeigt eine allgemeine Formel 2 der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung.

Figur 2 zeigt die Formel für 2-Methylthio-1, 4-naphthochinon.

Figur 3 zeigt die Formel für 2, 3-Dimethylthio-1, 4-naphthochinon.

Figur 4 zeigt die Ergebnisse eines Chorioallantois-Membran-Tests (CAM-Test), wobei Figur 4a das Kapillarmuster von Embryonen zeigt, die mit einem Agarblöckchen, das keine Testsubstanz enthielt, inkubiert wurden, während Figur 4b und Figur 4c das Kapillarmuster nach Behandlung mit 0,25 ng 2-Methylthio-1, 4- naphthochinon bzw. 1 ng 2-Methylthio-1, 4-naphthochinon zeigt.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, die zu Zwecken der Illustration, nicht zu ihrer Beschränkung dargeboten werden.

Beispiele Beispiel 1 : Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Naturstoff.

Der Bakterium-Stamm wurde wie folgt isoliert bzw. kultiviert. Aus dem zentralen Gewebe des Schwammes Dysidea avara wurde ein Probe von 5 mm2 herausgestanzt.

Unter sterilen Bedingungen wurde die Gewebeprobe drei-bis viermal mit sterilem Seewasser von Gerüststrukturen gesäubert. Anschließend wurde die Probe zwischen zwei sterilen Glas-Objektträgern zerquetscht. Der gewonnene Extrakt wurde auf einen Verdünnungsfaktor von 10-1 bis 10-5 verdünnt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde eine Agar-Kultur angelegt ; das Kulturmedium war aus folgenden Komponenten zusammengesetzt : 0,25% Pepton, 0, 15% Hefe-Extrakt, 0,15% Glycerol und 1, 6% Agar (gelöst in 100% Seewasser). Die Platten wurden bei 30°C für 24 bis 72 Stunden inkubiert. Die Bakterien-Kolonien wurden über Verdünnungsreihen vereinzelt und somit rein dargestellt. Im Proliferations-Hemmassay erwies sich unter den acht

isolierten Bakterien-Stämmen (Dl-D8) der als D1 bezeichnete Stamm als der aktivste und zwar speziell in dem Versuchsansatz, der auf Angiogenese-Hemmung ausgerichtet war. Die Charakterisierung des Bakteriums wurde gerade durchgeführt.

Sequenzvergleiche der rDNA ergaben, dass der Bakterien-Stamm D1 eine 99- prozentige Identität zu dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 aufweist.

Der Bakterien-Stamm Dl wurde nach Kultivierung mit n-Butanol nach der Methode von Elyakov extrahiert (Elyakov GB, Kutznetsova TA, Mikhailov VV : From chemistry of marine natural products to marine technologies : research at pacific institute of bioorganic chemistry. Mar Tech Soc J 30 : 21-28, 1996). Nach der Inkubation wurde die Bakterien-Kultur (in 500 ml Aliquot) mit 150 ml ri-Butanol versetzt. Die Suspension wurde bei 40°C 24 Stunden lang geschüttelt und anschließend 20 Minuten lang auf einem Magnetrührer gerührt. Durch nach Zentrifugation erhaltene n-Butanol-Phase wurde abgezogen und mit einem Rotationsverdampfer unter mittlerem Vakuum zur Trockne gebracht. Der trockene Rückstand (100-150 mg) wurde bei 5 °C aufbewahrt.

Zur Reinigung durch Gelfiltration wurde der Extrakt auf eine Säule (23 x 3 cm) aufgetragen, die mit Sephadex LH-20 gefüllt war. Als Elutionsmittel wurde Methanol eingesetzt ; die Fraktionsgröße betrug 18 ml. Von den gewonnen Fraktionen wurden nach Aktivitätsbestimmung die Fraktionen 14 und 15 vereinigt und bis zur Trockne evaporiert. Anschließend erfolgte eine präparative"high-performance" flüssigkeitschromatographische Aufreinigung (HPLC-Trennung). Als Säule diente Xterra 19 x 300 mm (Waters) ; als Solvens wurde das Gemisch Wasser und Acetonitril eingesetzt ; die Komponenten waren mit 0,05% Trifluoressigsäure versetzt. Der Gradient wurde wie folgt eingestellt : Start (0 min) mit 10% Acetonitril ; nach 30 min wurde 100% Acetonitril eingesetzt. Die Flussrate betrug 12 ml/min. die Verbindung eluierte nach 23 min und ergab nach Trocknen 0,5 mg, die als blass gelbe Nadeln auskristallisierten.

Die erhaltene Substanz wurde mittels NMR-Analyse und aufgrund der MS- Spektren als 2-Methylthio-1, 4-Naphthochinon (MTN) identifiziert ; der Schmelzpunkt lag bei 176-178°C. Die entsprechenden Literaturdaten für den Schmelzpunkt sind 165-166°C (Kametani T, Nemotö H, Takeuchi M, Takeshita M, Fukumoto K : A novel allcylation in the 4-position of isoquinoline derivatives. J Chem Soc Perkin Trans 1 : 386-390,1977) bzw. 185-186°C (Coll G, Morey J, Costa A, Saa JM : Direct lithiation of hydroxyaromatics. J Org Chem 53 : 5345-5348, 1988).

Beispiel 2 : Biologische Aktivität : Hemmung der Proliferation von Tumorzellen Testansatz : Die Antitumor-Aktivität der 2-Thiomethylnaphthochinone wurde an einer Reihe von Tumor-transformierten Zellen wie L5178y Mäuselymphomzellen (ATCC CRL 1722) getestet. Wie beschrieben (Müller WEG, Zahn RK : Metabolism of 1-ß-D- arabinofuranosyluracil in mouse L5178y. Cancer Res 39 : 1102-1107,1979) wurden die Zellen in RPMI-Medium, dem 10% fötales Kälberserum zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulum-Konzentration wurden 10.000 Zellen/ml gewählt. Zum Startzeitpunkt wurde die ausgewählte Substanz zugegeben und die Kultur für 72 Stunden inkubiert. Danach wurde die Anzahl der lebenden Zellen mittels des kolorimetrischen XTT-Ansatzes bestimmt und mit einem ELISA-Reader ausgewertet (siehe : Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR : Cancer Res 48 : 4827-4833,1988 ; Daum Th, Engels J, Mag M, Muth J, Lücking S, Schröder HC, Matthes E, Müller WEG : Antisense oligonucleotides-inhibitors of splicing of mRNA of human immunodeficiency virus.

Intervirology 33 : 65-75, 1992).

Die ED5o-Konzentrationen einiger ausgewählter MTN-Derivate für die genannten Tumorzellinien wurden nach Durchführung des kolorimetrischen XTT- Tests durch lineare Regression bestimmt (L. Sachs, Angewandte Statistik. Springer, Berlin, 1984,1-168). Die jeweiligen Mittelwerte mit der dazugehörigen Standardabweichung wurden aus 10 unabhängigen Experimenten ermittelt.

Ergebnis : Die experimentellen Daten sind in folgender Tabelle zusammengefasst. Es wird deutlich, dass die MTN-Derivate schon bei niedrigen Konzentrationen bis zu 0,07 llg/ml die Zellproliferation nach 72 Stunden entscheidend reduzieren. Besonders stark hemmend-und hochselektiv-sind MTN und auch DMTN mit einer Aktivität (EDso- Konzentration) von 0,07 (bzw. 0, 09), ug/ml im L5178y-Zell-System. Auch die übrigen Derivate besitzen eine ausgeprägte Wirkung auf die Zellproliferation. Die EDso- Konzentrationen der MTN-Derivate in Zellkulturansätzen von PC-12-Zellen sowie von HeLa-S3-Zellen liegen im vergleichbaren Bereich niedriger. Beispielhaft kann das Derivat MTN erwähnt werden, das bei L5178y-Zellen eine EDso-Konzentration von 0,07 µg/ml aufweist ; geringer wirksam ist MTN bei Ansätzen mit HeLa S3- Zellen (1,0 llg/ml) oder PC-12-Zellen (2,5 pg/ml).

Beispiele für EDso-Konzentration Testsubstanzen (g/ml) (L5178y-Zellen) Naphthochinon 0, 240, 15 MTN 0, 073z0, 01 DMTN 0, 09~0, 01 Umsetzbare Schlussfolgerung : Deshalb wird geschlossen, dass das Antitumorspektrum sowohl von MTN als auch der MTN-Derivate breit ist. Besonders stark proliferationshemmend wirken die Verbindungen bei L5178y-Zellen. Vergleichende Hemmversuche zeigen, dass MTN und DMTN im Vergleich zu unsubstituiertem 1, 4-Naphthochinon eine deutlich höhere Hemmaktivität aufweist. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei Einsatz der Derivate der Ansprüche 4 und 5.

Beispiel 3 : Biologische Aktivität : Anti-angiogenetische Wirkung Testansatz : Die hier angewandte Methode, der Chorioallantois-Membran (CAM) -Test, basiert auf einem publizierten Verfahren (Crum R, Sazbo S, Fokeman J : A new class of steroids inhibit angiogenesis in presence of heparin and heparin fragments. Science 231 : 1375- 1378, 1985). Die Testsubstanz MTN wurde in mindestens vier verschiedenen Dosen von 0,25 ng bis 1 ng in Agarblöckchen mit einem Durchmesser von 4 mm eingebracht. Die Agarkonzentration lag bei 2,5%. Nachdem die Substanz in den Agar eingedrungen war, wurde das Böckchen auf die Chorioallantoismembran

aufgetragen. Befruchtete 5 Tage alte Eier wurden mit 70% igem Alkohol äußerlich sterilisiert. Nach Lokalisierung der CAM wurde ein 1 mm x 1 mm großes Fenster in der Schale eröffnet. Das Agarblöckchen wurde 2-3 mm vom zentralen Blutgefäß entfernt auf die Region mit den proliferierenden Kapillaren aufgesetzt. Anschließend wurde das Schalenfenster mit Parafilm wieder verschlossen und die Eier bei 38°C für weitere 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurde der potentielle anti- angiogenetische Effekt bestimmt. Als Positiv-Kontrolle wurde Hydrocortison (60 , ug/Disk) zusamrnen mit Heparin (100 llg/Disk) angewandt. Pro Testsubstanz wurden mindestens 15 befruchtete Eier eingesetzt.

Ergebnis : Der Chorioallantois-Membran (CAM) -Test gilt als sehr zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung potentiell anti-angiogenetischer Wirkungen von Substanzen (siehe : Auerbach R, Lewis R, Shiners B, Kuba, L, Akhtar N : Angiogenesis assays : a critical overview. Clinical Chem 49 : 32-40,2003). Abbildungsiehe auch FiQur 4) : Wirkung von MTN auf die Vaskularisierung in Hühnchenembryonen im CAM-Assay. Figur 4 A zeigt das Kapillarmuster von Embryonen, die mit einem Agarblöckchen, das keine Testsubstanz enthielt, über 48 Stunden inkubiert wurden. Figur 4 B, zeigt das Kapillarmuster nach Behandlung mit 0,25 ng MTN pro Disk und Figur 4 C einen entsprechenden Ansatz mit 1 ng MTN pro Disk. Eine sehr stark ausgeprägte Störung der Kapillarorganisation sieht man dort, wo die mit MTN getränkten Agar-Disks (Pfeilspitzen und mit"d"markiert) aufgebracht waren. Vergrößerung : x 10.

In der durchgeführten In-vivo-Untersuchungsreihe wurde festgestellt, dass MTN einen sehr wirksamen angiogenetischen Inhibitor darstellt. Bei einer Dosis von 1 ng/Disk wird eine 100% ige Eliminierung der Kapillaren gemessen. Wie in der Abbildung 4 (Teilbild C) gezeigt, kommt es in der Region, in der das Agarblöckchen aufgebracht wurde, zu einer kompletten Unterdrückung der Kapillarbildung. Im

Vergleich dazu ist das physiologische Muster der Kapillarbildung in Teilbild A gezeigt. Bei der niedrigeren Dosis von 0, 25 ng pro Disk ist ebenfalls noch eine Fehlorganisation der Kapillarmusters zu sehen (Teilbild B). Eine quantitative Analyse ergab, dass bei der Dosis von 0,25 ng pro Disk bei 20% der Embryonen ein signifikant anti-angiogenitischer Effekt nachzuweisen ist (Anzahl der untersuchten Embryonen : n = 20), während bei einer etwas höher gewählten Dosis zwischen 0,50 ng und 1 ng (pro Disk) MTN einen 100% anti-angiogenischen Effekt erzeugt.

Unzsetzbare Schlussfolgerung : Die hier dargelegten Ergebnisse zeigen, dass MTN bei den sehr niedrigen Dösen von 0,25 ng bis 1 ng pro Disk einen ausgeprägten anti-angiogenetischen Effekt zeigt. Es ist deshalb zu erwarten, dass MTN bei vergleichbar niedrigen Dosen diesen Effekt auf die Vaskularisierung nicht nur bei Hühnchenembryonen, sondern auch in anderen Vertebraten und in menschlichen Tumoren zeigt. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch für DMTN sowie die Derivate der Ansprüche 4 und 5.

Beispiel 4 : Biologische Aktivität : Antibakterielle Wirkung Zur Testung auf antibakterielle Aktivität wurden die folgenden beiden Bakterienstämme eingesetzt : Escherichia coli (DH5alpha), ein gram-negatives Bakterium, und Bacillus subtilis (168), ein gram-positives Bakterium. Die Untersuchungen wurden sowohl mit MTN als auch mit DMTN und Naphthochinon o o X SMe « 'se 0 o DMTN Naphthochinon Testansatz : Ein Bakterienrasen wurde nach Übernachtkultur und anschließendem Ausstreichen auf solidem Agar angezüchtet. Als Kulturmedium wurde LB-Ågar (10 g Peptone, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl und 15 g Agar ad 1 Liter) eingesetzt.

Entsprechend. den etablierten Methoden wurde der antibakterielle Test durchgeführt. Seriell verdünnte Konzentrationen von MTN wurden auf Papierdisks (Durchmesser 6 mm) aufgetragen. Nach Verdunstung des Lösungsmittels wurden die Disks auf die Bakterienrasen aufgelegt und die Kulturen 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde der Durchmesser derjenigen Zone bestimmt, bei der keine Bakterien zu erkennen waren (Hemmhof).

Ergebnis : Die Untersuchungen ergaben, dass Naphthochinon und dessen Derivate bei einer Dosis von 10 zug pro Disk eine meßbare antibakterielle Wirkung bei Bacillus subtilis (gram-positiv) erzeugen ; die getesteten Derivate sind entsprechend aktiv. Die Wirkung auf das gram-negative Bakterium Escherichia coli ist gering. Testsubstanz Bakterium Dosis der Verbindung Aktivität pro Disk Naphthochinon Escherichia coli l0 pg schwach Bacillus subtilis 10, ug starlc MTN Escherichia coli 10 Uug schwach Bacillus subtilis 10 gg stark DMTN Escherichia coli 10 jug schwach Bacillus subtilis 10 pg stark Die Aktivität ist angegeben mit : schwach < 2 mm Hemmhof ; stark > 2 mm Hemmhof.

Umsetzbare Schlussfolgerung : Es wird deutlich, dass die Naphthochinon-Derivate auf gram-positive Bakterien, hier das Bakterium Bacillus subtilis, eine anti-bakterielle Wirkung zeigen.

Beispiel 5 : Biologische Aktivität : Fungizide Wirkung Zur Austestung der potentiell fungiziden Wirkung der zur Anmeldung kommenden Substanzen (MTN, DMTN und Naphthochinon sowie Derivate davon) wurde

Saccharomyces ce revisiae ausgewählt.

Testansatz : Der Hefestamm wurde nach Übernachtkultur als Rasen auf YPD-Agar (20 g Peptone, 10 g Hefe-Extrakt, 20 g Glucose, 15 g Agar ad 1 Liter) ausgesät.

Seriell verdünnte Konzentrationen von MTN bzw. dessen Derivaten wurden auf Papierdisks (Durchmesser 6 mm) aufgetragen. Nach Verdunstung des Lösungsmittels wurden diese Disks auf den Hefe-Rasen aufgelegt und die Kulturen 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde der Durchmesser derjenigen Zone bestimmt, bei der keine Hefe zu erkennen war (Hemmhof).

Ergebnis : Die Untersuchungen ergaben, dass Naphthochinon bei einer Dosis von 10 u. g pro Disk keine starke antifungische Wirkung erzeugt. Der Hemmhof ist < 2 mm Beispiel 6 : Biologische Aktivität : Wirkung in vivo Zur Bestimmung der Toxizität wurde die Testsubstanz MTN an Mäusen getestet.

Sowohl die Überlebensrate als auch die Änderung des Gewichts der Tiere wurde als Parameter für einen potentiell toxischen Effekt herangezogen. Für diese Untersuchungen wurden männliche (outbred) NMRI-Mäuse (32-36 g ; Alter : 8-9 Monate) eingesetzt.

Testansatz : Die Testsubstanz MTN wurde in Methylzellulose gelöst und den Tieren i. p. injiziert.

Fünf Tage lang wurde den Tieren eine Dosis von 30 mg/kg (pro Tag) bzw. 3 mg/kg (pro Tag) verabreicht. Täglich wurde das Gewicht der Tiere bestimmt. Pro Kollektiv wurden 5 Tiere behandelt. Die Überlebensrate als auch das mittlere Gewicht des Kollektives wurde nach 5 und nach 11 Tagen bestimmt.

Ergebnis : Während dieser Zeit veränderte sich das Gewicht der MTN-behandelten Tiere bei einer Dosis von 3 mg/kg gegenüber dem der Kontrollen nicht signifikant. Jedoch kam es bei den Tieren, die mit 30 mg/kg behandelt wurden, zu einer starken Gewichtsabnahme ; auch starben bei den mit 30 mg/kg MTN-behandelten Tieren insgesamt zwei Tiere nach dem 3. und 4. Tag. In der Kontrollgruppe oder in der mit 3 mg/kg MTN-behandelten Tiergruppe starb keines der Versuchstiere. Mittleres Gewicht des Tierkollektivs nach Behandlung Verabreichte Bestimmung Bestimmung Anzahl der Dosis (mg/kg) nach 5 Tage nach 11 Tagen überlebenden Tieren 0 mg/kg 39 g 49 g 5 3 mg/kg 41,8 43,2 5 30 mg/kg 34, 3 35, 6 3 von 5

8. 3. Umsetzbare Schlussfolgerung : Ergebnis : Aus diesen Daten wird geschlossen, dass die subakute Toxizität von MTN bei einer fünftägigen i. p. -Behandlung » 3 mg/kg beträgt.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.