DISPOSITIVO TERMOELÉCTRICO PARA LA MEDIDA DEL ESTRÉS EN ORGANISMOS FOTOSINTÉTICOS

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud de patente tiene por objeto un dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos, provocado por altas y/o bajas temperaturas, por radiación ultravioleta (UV) y/o por alta radiación fotosintéticamente activa (PAR), que comprende al menos una unidad termoeléctrica, un plato térmico, un disipador térmico, medios de control de la temperatura existente sobre el plato térmico y al menos una fuente de energía, según la reivindicación 1, incorporando adicionalmente notables innovaciones y ventajas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Son conocidos diversos métodos directos e indirectos para medir la resistencia de las plantas al estrés térmico. Dichos métodos se basan mayoritariamente en el estudio de parámetros como la supervivencia de las plantas, el daño a las hojas, el rebrote de las raíces, la viabilidad de los tejidos, la conductividad eléctrica de los mismos, el intercambio de gases, la fluorescencia de la clorofila o la actividad de biomoléculas relacionadas con el estrés. De todos los métodos citados, uno de los más utilizados es el de la fluorescencia de la clorofila, por sus múltiples aplicaciones en el estudio de los efectos del estrés sobre la fotoquímica de la fotosíntesis.

En general, se han utilizado las técnicas de fluorescencia de la clorofila en estudios centrados en la respuesta a temperaturas potencialmente estresantes. A nivel molecular, esto se explica porque el complejo fotosistema II (PSII), ubicado en la membrana tilacoidal de los cloroplastos en eucahotas fotosintéticos y con un papel central en los procesos de separación de carga y transporte de electrones, constituye una estructura termosensible. Por este motivo, se han descrito diversos parámetros relacionados con la actividad del PSII, entre ellos: la fluorescencia mínima (Fo); la fluorescencia variable (Fv), la fluorescencia máxima (*Fm); la eficiencia cuántica fotosintética (cpPSIl); la eficiencia cuántica fotosintética máxima (Fv/*Fm); la disipación no fotoquímica (NPQ); la tasa de transporte de electrones

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) (ETR) y los valores transitorios de fluorescencia de clorofila a. Así, por ejemplo, en viña se ha descrito que el estrés producido por alta temperatura disminuye ETR, Fv, *Fm y Fv/*Fm, indicando la existencia de daños en el centro de reacción PSII.

También hay evidencias de los efectos de la radiación ultravioleta de onda media (IIV-B) sobre el PSII. Así la relación Fv/*Fm sería un buen indicador de la fotoinhibición del PSII por IIV-B y otros estreses. Aunque la radiación UV afecta a múltiples elementos del sistema fotos i nté ti co, existe consenso en que el PSII es uno de los elementos con mayor afectación por IIV-B.

Es también conocido que para inducir estrés térmico sobre plantas y otros organismos fotosintéticos, se utilizan métodos consistentes en introducir las plantas o partes de estas en frigoríficos, congeladores, estufas, baños mana o cámaras de crecimiento. Dichos dispositivos son habitualmente poco transportables y eficientes, por vahos motivos: 1) por su excesivo tamaño y peso, 2) por su alto consumo eléctrico, 3) por la falta de un control adecuado para aplicar rampas de temperatura que simulen las condiciones ambientales, 4) por su estrecho rango de temperaturas aplicables, y 5) porque no integran la posibilidad de combinar medidas de parámetros de estrés térmico (calor y/o frío) con exposición a condiciones de alta radiación PAR y/o radiación UV. La falta de equipamiento adecuado se desprende claramente de la literatura científica, describiéndose experimentos masivos realizados mediante cámaras de crecimiento con control de temperatura o baños mana, es decir, por soluciones tradicionales, lo cual es ilustrativo del estancamiento de la innovación en este ámbito, así como de la necesidad de soluciones que vayan más allá, superando así los inconvenientes técnicos mencionados.

Citar a este respecto, de modo ilustrativo, la patente ES2565560, en la que se muestra un termociclador adaptable el cual consta de un sistema programadle que permite cambiar la temperatura del contenido de un volumen variable un número de veces entre temperaturas preestablecidas sin límite de potencia, y con un sensor que permite conocer la temperatura en dicho volumen.

Es también conocido, del estado de la técnica, lo descrito en la patente internacional W02012/038750A1 , en la que se describe un termociclador que comprende un elemento termoeléctrico de tipo Peltier utilizado para enfriar un bloque de muestra y un dispositivo de calentamiento que no es de tipo Peltier para calentar el bloque de muestra. El ciclador

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) también incluye un disipador de calor conectado al elemento de tipo Peltier mediante un tubo de calor, que permite que la energía térmica se transfiera desde el elemento de tipo Peltier al disipador de calor. Esta configuración funciona de forma más eficiente que los termocicladores convencionales que utilizan elementos de tipo Peltier para calentar y enfriar, y permite un tiempo de ciclo más rápido, así como un funcionamiento en un rango más amplio de temperaturas ambientales. Ciertas realizaciones utilizan el elemento de tipo Peltier como puerta térmica para reducir la pérdida térmica durante el calentamiento cuando el elemento de tipo Peltier está apagado.

Así, y a la vista de todo lo anterior, se ve necesario desarrollar un dispositivo de pequeño tamaño que combina todas las posibilidades de las que adolecen los dispositivos y métodos conocidos, basándose en una configuración particular de enfriadores termoeléctricos del tipo Peltier combinados con un conjunto de fibras ópticas dispuestas para la excitación con alta radiación PAR y/o radiación UV de diversas muestras de organismos fotosintéticos alojadas en un bloque térmico específicamente diseñado para someterlas a las condiciones deseadas y, a su vez, poder efectuar las medidas de la fluorescencia de la clorofila de cada una de dichas muestras en estudio.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el ámbito de la biología, bioquímica, química, ecología, medioambiente, alimentación, ciencias de la tierra y arte, más en particular, en las disciplinas de la fisiología vegetal, ecofisiología, cristalografía, quimioluminiscencia, bioluminiscencia, análisis multiespectral y microbiología, pudiendo ser utilizado, con la adición de algunos accesorios, para llevar a cabo gran cantidad de experimentos basados en reacciones termoquimioluminiscentes o termobioluminiscentes, experimentos de análisis multiespectral térmico para el estudio de cualquier tipo de material en campos relacionados con la calidad y seguridad alimentaria, agricultura, contaminación y microbiología, reacciones químicas o bioquímicas a temperatura controlada, experimentos de detección de fluorescencia para la evaluación de pigmentos fluorescentes en sustancias orgánicas e inorgánicas, experimentos para la detección del punto de nucleación de materiales orgánicos e inorgánicos, experimentos de metabolómica, proteómica y metagenómica asociada a eventos térmicos en cultivos celulares o de microorganismos. Y, en concreto, para la medida del estrés en organismos fotosintéticos cuantificada mediante la detección de la fluorescencia de la clorofila.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Así, se ha buscado diseñar un dispositivo termoeléctrico, específicamente para satisfacer unas necesidades de experimentación no satisfechas hasta la fecha por ningún dispositivo disponible en el actual estado de la técnica, orientado específicamente a realizar medidas de tolerancia al estrés en plantas u organismos fotosintéticos.

Cuenta con un conjunto de enfriadores termoeléctricos, un disipador térmico y un plato térmico adosados, que juntos conforman el bloque termoeléctrico. Este dispone de un aislante lateral que le confiere una buena homogeneidad térmica y, a su vez, sirve de retención para una serie de chapas térmicas, o placas extraíbles, intercambiables que conforman el bloque térmico. Cuenta también con una novedosa tapa principal aislante por la cual discurren un conjunto de fibras que se usan tanto para la excitación lumínica en diferentes longitudes de onda como para la medida de la fluorescencia o luminiscencia. Los conductos por los cuales discurren las fibras permiten el intercambio fácil y rápido de cada una de ellas, posibilitando, a su vez, el ajuste manual de la energía de excitación o medida.

Por otro lado, el bloque térmico, junto con el plato térmico y la parte inferior de la tapa principal aislante, conforman las celdas que constituyen el alojamiento de las muestras a evaluar, sin la necesidad de insertar contenedor alguno. Ello evita problemas de acoplamiento térmico que podrían incurrir en una inestabilidad y falta de precisión térmica. La ausencia de contenedor evita, también, atenuaciones térmicas y de la radiación lumínica desde la muestra al receptor o desde el emisor a esta.

Otra ventaja notable del dispositivo viene del hecho de disponer de diferentes bloques térmicos intercambiables para el alojamiento de muestras de diferente naturaleza y tamaño.

La adición de un bloque térmico con sensor de temperatura en forma de cubeta de diversas formas y tamaños realizada mediante aluminio o cualquier material de similar o mayor coeficiente de conductividad térmica permite la realización de experimentos químicos o bioquímicos a temperatura controlada en medio aéreo o líquido.

Adicionalmente presenta un amplio rango de temperaturas de trabajo comparado con los equipos conocidos, permitiendo imponer unas temperaturas de -35 °C hasta +90 °C. Ello permite medir el estrés de las plantas u otros organismos fotosintéticos dentro de sus límites

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) de resistencia; cuando los termocicladores disponibles en el mercado y usados básicamente en experimentación genética logran solamente temperaturas de entre +35 °C y +95 °C.

Además cada una de las muestras está perfectamente identificada por un código alfanumérico que la posiciona en la batería de muestras a evaluar. Cada celda de medida o alojamiento dispone de, al menos, una fibra individual para la excitación lumínica y/o la recepción de la fluorescencia, siendo estas fibras fácilmente sustituibles de manera individual en caso de rotura o deterioro. Así, para cada celda de medida, o alojamiento, se dispone de un mínimo de una fibra, pero si la celda de medida o alojamiento es más grande se pueden disponer de más fibras.

Mencionar también que la ausencia de partes móviles automáticas asegura la durabilidad y robustez del dispositivo. Y que el uso de un registrador y de las sondas de temperatura adecuadas, permite también el estudio del punto de nucleación de las muestras en experimentación.

Todo ello conlleva la posibilidad de llevar a cabo experimentos adicionales, más completos y versátiles, siendo estos con carácter ilustrativo y no limitativo:

• Medidas de tolerancia al estrés térmico por frío y/o calor en plantas u otros organismos fotosintéticos;

• Medidas de tolerancia al estrés térmico por frío y/o calor y/o radiación UV en plantas u otros organismos fotosintéticos.

• Medidas de tolerancia al estrés térmico por frío y/o calor y/o alta radiación PAR en plantas u otros organismos fotosintéticos.

• Medidas de tolerancia al estrés térmico por frío y/o calor y/o radiación UV y/o PAR en plantas u otros organismos fotosintéticos.

Mediante la conexión de las fibras a un luminómetro el dispositivo permite llevar a cabo experimentos de termoquimioluminiscencia o termobioluminiscencia.

Usando el alojamiento de las fibras del termociclador o dispositivo termoeléctrico para la inserción de un sistema de succión mediante tubos milimétricos, el dispositivo puede ser usado también para llevar a cabo experimentos de genómica, proteómica, metabolómica, etc., para profundizar en el conocimiento de la reacción de microorganismos fotosintéticos o no al estrés térmico, por radiación UV, por radiación visible o por la combinación de dichos

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) factores. Y utilizando del mismo modo el alojamiento de las fibras del termociclador para la inserción de diversas sondas de temperatura adecuadas y debidamente conectadas a un registrador automático, el dispositivo puede ser usado también para llevar a cabo experimentos de nucleación sobre cualquier tipo de muestra.

Sustituyendo la tapa por la cual discurren las fibras por una de ¡guales características térmicas que contenga una cámara de alta sensibilidad junto a un sistema de iluminación en las bandas de ultravioleta y visibles, el dispositivo permite llevar a cabo experimentos de termoquimioluminiscencia o termobioluminiscencia.

De igual modo sustituyendo la tapa por una que contenga el sistema de iluminación descrito en el anterior apartado y una cámara multiespectral, el dispositivo permitirá la realización de análisis multiespectrales en los campos relacionados con la calidad y segundad alimentaria, agricultura, contaminación y microbiología, así como llevar a cabos estudios de detección de fluorescencia para la evaluación de pigmentos fluorescentes en sustancias orgánicas e inorgánicas.

A continuación se cita, a modo de ejemplo, un protocolo de medida resumido para la cuantificación del estrés térmico o térmico y por luz IIV-B en plantas:

1. Programación de la curva de temperaturas mediante el software específicamente diseñado para transmitir los datos de temperaturas deseados al controlador de temperatura.

2. Inserción de las chapas que constituyen las celdas para acoger las muestras que se pretenden medir.

3. Introducción de las muestras fotosintéticas a medir en cada una de las celdas que disponen las chapas y confección de la tabla de situación de cada muestra.

4. Cierre y sujeción de la tapa principal del termociclador con las muestras correctamente insertadas.

5. Ejecución de la curva de temperatura deseada.

6. Toma de medidas mediante un fluorómetro acoplado al termociclador. Dichas medidas serán tomadas en diferentes estadios de desarrollo del experimento, según las necesidades de éste.

7. Análisis de los datos.

En caso de querer excitar la muestra con IIV-B, se procederá igual que para el caso anterior, pero se insertará el siguiente paso antes, después o durante el paso 5 que

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) consistirá en el conexionado de cada una de las fibras a la fuente ultravioleta, en la activación de ésta durante un tiempo determinado y en el momento de la curva de temperatura más adecuado.

Más en particular, el dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos, provocado por altas y/o bajas temperaturas, por radiación ultravioleta (UV) y/o por alta radiación fotosintéticamente activa (PAR), está configurado para el acoplamiento a un fluorómetro y/o una fuente de radiación visible y/o un luminómetro y/o a una fuente de radiación ultravioleta (UV) y/o a una fuente de alta radiación fotosintéticamente activa (PAR), y comprende al menos una unidad termoeléctrica, un plato térmico, un disipador térmico acoplado a la unidad termoeléctrica, medios de control de la temperatura existente sobre el plato térmico y al menos una fuente de energía, donde el plato térmico está configurado para albergar al menos una placa extraíble, la cual comprende al menos un alojamiento para la colocación de al menos una muestra de un organismo fotosintético.

Como se ha mencionado, dicha realización básica del dispositivo termoeléctrico de la presente invención permite la posibilidad de configurarlo con placas extraíbles de distintos espesores y alojamientos de distintos tamaños. Es posible colocar en su interior una o vahas placas extraíbles o intercambiables y apilables con alto coeficiente de conductividad térmica, que conforman las celdas o alojamientos donde se depositan las muestras a medir. Señalar que por unidad termoeléctrica se considera un dispositivo termoeléctrico apto para producir tanto refrigeración como calefacción.

Mencionar de modo más general que el dispositivo termoeléctrico permite integrar todas las condiciones térmicas, de excitación lumínica y de medida de la fluorescencia de la clorofila en un único dispositivo portátil, posibilitando su utilización en lugares poco accesibles. Este dispositivo facilita la excitación lumínica y la imposición de un régimen térmico en el rango de temperaturas positivas y/o negativas a un conjunto de muestras en experimentación que, a su vez, son examinadas a través de un fluorómetro. El dispositivo dispone de unos alojamientos adecuados, también denominados celdas, para la inserción de las muestras, de manera que se confiere un aislamiento térmico y funcional a dichas muestras para que alcancen las temperaturas deseadas, fuera del efecto del ambiente circundante. Su base la constituyen un conjunto de unidades termoeléctricas apiladas, separadas por una plancha de material con alto coeficiente de conducción térmica, que consigue un diferencial de temperatura mínimo de ± 65 °C respecto a la temperatura ambiente, pudiendo someter a las

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) muestras a temperaturas de -35 °C hasta +90 °C, permitiendo con ello medir el estrés térmico de las plantas u otros organismos fotosintéticos dentro de sus límites de resistencia. Mencionar, no obstante, que para una realización básica del dispositivo termoeléctrico, no tiene que haber necesariamente una pluralidad de unidades termoeléctricas apiladas, pues con una única unidad termoeléctrica funcionaría igualmente, si bien no se conseguirían rangos de temperatura tan elevados.

Las unidades termoeléctricas apiladas están separadas por una chapa o plancha de elevado coeficiente de conductividad térmica, siendo el material de grafito o un metal preferentemente de aluminio, plata, cobre, o aleaciones de estos, estando adheridos por una de sus dos caras a una plataforma metálica con un elevado coeficiente de conductividad térmica, que hace las funciones de plato térmico y, por la otra cara, a un disipador térmico que a su vez está refrigerado por una corriente de aire o líquido impulsada por ventiladores o bombas impulsoras. Dicho conjunto es el que conforma el bloque termoeléctrico. Sobre el plato térmico, se disponen unas placas o chapas troqueladas que conforman el bloque térmico sobre el cual, a su vez, se inserta una chapa igualmente de material conductor térmico, debidamente mecanizada, que conforma la cubierta de las celdas y constituye la parte inferior de la tapa principal aislante. Alrededor del plato térmico y las placas o chapas conductoras, así como sobre estas, se dispone un aislante con un mecanizado, este último que permite el paso a través de éste de las fibras que facilitan la excitación lumínica de las muestras y/o la medida de la fluorescencia de la clorofila. Dicho aislante permite, a través de los conductos por los que discurren las fibras, la succión de muestras líquidas para su posterior análisis o la inserción de sondas de temperatura para el análisis del punto de nucleación de las muestras en experimentación.

Las placas o chapas que constituyen el bloque térmico son apilables e intercambiables y, junto con el plato térmico y la parte inferior de la tapa principal, constituyen las celdas o alojamientos en las cuales se depositan las muestras. Dichas placas o chapas disponen de diferentes troqueles que conforman celdas o alojamientos de diversas medidas, lo cual supone la posibilidad de utilizar celdas o alojamientos de diversas formas y tamaños en las que depositar las muestras. En función de las placas o chapas utilizadas, cada una de las celdas o alojamientos dispone de uno o más conductos u orificios para la inserción de las fibras ópticas. Por otra parte, según el número de placas o chapas que se apilen, las celdas o alojamientos disponen de una menor o mayor altura para adaptarse a las muestras a evaluar.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Ventajosamente, el dispositivo termoeléctrico comprende un aislante lateral alrededor del plato térmico, de manera que se mejora la homogeneidad térmica, al tiempo que sirve de retención para las placas extraíbles o intercambiables que conforman el alojamiento de las muestras, formando parte del bloque térmico.

Adicionalmente, el plato térmico comprende una lámina aislante en la superficie sobre la cual se sitúa al menos una placa extraíble, lo cual provoca, junto al aislante lateral, la correcta homogeneización térmica de los elementos integrantes del bloque térmico.

Según otro aspecto de la invención, el dispositivo termoeléctrico comprende una tapa sobre el plato térmico y/o la placa extraíble, donde la tapa comprende al menos un orificio para canalizar al menos una fibra óptica cuyo extremo termina frente al alojamiento, estando dicha tapa confeccionada mayoritariamente con material aislante. De este modo, la inserción de una o vahas fibras ópticas sobre cada una de las celdas o alojamientos permite la excitación de las muestras en experimentación con radiación ultravioleta y/o radiación fotosintéticamente activa, así como la medida de la fluorescencia de la clorofila mediante un fluorómetro y la medida de luminiscencia mediante un luminómetro.

Por otra parte, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos un tubo de succión canalizado a través de dicho orificio, permitiendo la succión de muestras líquidas para su posterior examen. Dicho orificio es preferentemente el mismo que canaliza las fibras ópticas, dado que los tubos de succión son tubos milimétricos, lo cual es suficiente para succionar la muestra orgánica en parte o en su totalidad, y depositarla en un recolector para su análisis. Señalar que para dicha funcionalidad, las muestras no tienen por qué ser necesariamente organismos fotosintéticos.

En síntesis, el dispositivo termoeléctrico dispone de uno o vahos conductos u orificios sobre cada una de las celdas o alojamientos por los cuales puede ser insertada una fibra óptica que permite la excitación lumínica de las muestras y/o su conexión a un fluorómetro y/o a un luminómetro. Dicho conducto u orificio facilita la inserción de sondas de temperatura que informan de la temperatura de las muestras en experimentación, permitiendo encontrar el punto de nucleación de las mismas y, a su vez, permite la succión de muestras líquidas para su posterior examen.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Complementariamente, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos una segunda sonda de temperatura canalizada a través de dicho orificio, el mismo que el que canaliza las fibras ópticas. Dicha segunda sonda de temperatura está destinada a la realización de estudios térmicos sobre las muestras, las cuales no tienen por qué ser organismos fotosintéticos, pudiendo ser incluso muestras no orgánicas.

Según otro aspecto de la invención el dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos comprende una cubeta sobre el plato térmico, donde la cubeta comprende una doble pared configurada para alojar un fluido térmico, donde dicho fluido térmico contribuye a una correcta disipación y homogeneización térmica. Señalar que la cubeta, realizada mediante aluminio o cualquier material de similar o mayor coeficiente de conductividad térmica, permite la realización de experimentos químicos o bioquímicos a temperatura controlada en medio aéreo o líquido.

Opcionalmente la tapa comprende una tapadera que cierra la parte superior de la cubeta. Dicha tapadera, junto con el aislante lateral, produce el efecto de aislar del ambiente exterior y contribuye al efecto de cierre de la tapa, mejorando la estabilidad térmica. Adicionalmente ofrece una mayor flexibilidad de operación al posibilitar el reemplazar la muestra y/o de revisar su estado, sin necesidad de desmontar toda la tapa.

Complementariamente, la tapa comprende al menos un agujero para la inserción de una cámara de cara a poder ver lo que sucede en el interior del dispositivo termoeléctrico sin necesidad de abrirlo.

En concreto la cámara es del tipo CCD o CMOS, con un sistema óptico apropiado. Ambos sistemas deben ofrecer una eficiencia cuántica adecuada para el registro de la emisión o reflexión lumínica de las muestras en experimentación, permitiendo de este modo realizar experimento de termoluminiscencia.

Y alternativamente la cámara es del tipo multiespectral o hiperespectral, de modo que se posibilita la caracterización de muestras de organismos fotosintéticos sometidos a diferentes temperaturas para cada uno de los espectros que proporcione la cámara.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Complementariamente, la tapa comprende una fuente de radiación electromagnética del tipo LED, proporcionando energía en el espectro de UV y/o el visible para provocar fenómenos de fluorescencia o reflexión lumínica.

Según otro aspecto de la invención, la fuente de radiación electromagnética está conectada a una fuente de alimentación eléctrica, como fuente de energía, por medio de un regulador de intensidad, de manera que se posibilita el ajuste de la potencia emitida, así como la inserción de energía electromagnética a través de fibras ópticas.

Cabe mencionar que el dispositivo termoeléctrico comprende medios de sujeción de la tapa sobre el plato térmico y/o la placa extraíble, para una correcta fijación mecánica de las partes integrantes, evitando fugas térmicas indeseadas que comprometan la precisión de la medida.

Más en detalle, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos una primera sonda de temperatura, de modo adicional a la segunda sonda de temperatura.

La función de dicha primera sonda de temperatura, es la del control de la temperatura del plato térmico, pudiendo estar situada en la tapa, y también en el plato térmico o en el aislante lateral. De estar en el plato térmico su posición sería preferentemente en la superficie de cierre frente al plato térmico y/o a los alojamientos de la placa extraíble.

Preferentemente, los medios de control de la temperatura están en conexión con la primera sonda de temperatura, para poder efectuar una regulación adecuada, y en función de los valores medidos. Dichos medios de control comprenden opcionalmente un software de control.

Según otro aspecto de la invención, el dispositivo termoeléctrico comprende una pluralidad de unidades termoeléctricas apiladas, aisladas del ambiente circundante por un aislante lateral, de cara a un aporte energético y térmico de mayor intensidad y eficiencia.

Por otra parte, la pluralidad de unidades termoeléctricas apiladas están separadas entre sí por una plancha de material conductor térmico, al objeto de obtener una mayor eficiencia y homogeneidad térmica.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Ventajosamente, el disipador térmico está acoplado a la parte opuesta al plato térmico de la unidad termoeléctrica, es decir, a la parte inferior del conjunto, de modo que el aporte energético y térmico, y la disipación térmica están dispuestos en una configuración simétrica y opuesta, de cara a una mayor eficiencia energética y térmica.

Y según otro aspecto de la invención, el dispositivo termoeléctrico comprende un ventilador o una bomba de circulación de fluido térmico, en las proximidades del disipador térmico. De este modo se fuerza la circulación de aire o de líquido refrigerante para una eficaz refrigeración del conjunto.

Adicionalmente, el dispositivo termoeléctrico comprende un soporte, de modo que se posibilita el apoyo estable sobre una superficie horizontal.

Complementariamente, la fuente de energía comprende al menos una fuente de alimentación eléctrica, la cual puede ser, opcionalmente, de corriente continua, por medio de una batería. No obstante el dispositivo termoeléctrico puede ser alimentado en corriente continua (DC) o corriente alterna (AC), lo cual permite la alimentación directa de la red eléctrica, o mediante baterías.

En una realización preferida de la invención, la placa extraíble comprende una pluralidad de alojamientos donde cada alojamiento comprende un código alfanumérico, donde dicho código alfanumérico identifica cada uno de los orificios en relación a los alojamientos. Dicho código alfanumérico permite identificar también cada una de las fibras ópticas. Así, para facilitar la excitación lumínica y la toma de medidas de cada una de las muestras, cada placa o chapa dispone de un código alfanumérico que permite identificar las celdas o alojamientos. Y, de la misma forma, la tapa principal dispone de una réplica de dicho código alfanumérico que permite identificar cada una de las fibras ópticas en función de la celda o alojamiento a la que da servicio.

En los dibujos adjuntos se muestra, a título de ejemplo no limitativo, un dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos, constituido de acuerdo con la invención. Otras características y ventajas de dicho dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos, objeto de la presente invención, resultarán evidentes a partir de la descripción de una realización preferida, pero no exclusiva, que se ¡lustra a modo de ejemplo no limitativo en los dibujos que se acompañan.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1A- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una primera realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 1 B- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una vahante de la primera realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 2- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una segunda realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 3- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una tercera realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 4- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una cuarta realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 5A- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una quinta realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 5B- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una vahante de la quinta realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 6- Vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una sexta realización, de acuerdo con la presente invención;

Figura 7- Vista en planta de una realización preferente de las placas extraíble conductoras que constituyen los alojamientos de medida y del código alfanuméhco para identificación de las fibras ópticas y los alojamientos, de acuerdo con la presente invención;

Figura 8- Vista en planta y de perfil de una configuración del plato térmico y del aislante lateral, de acuerdo con la presente invención;

DESCRIPCIÓN DE UNA REALIZACIÓN PREFERENTE

A la vista de las mencionadas figuras y, de acuerdo con la numeración adoptada, se puede observar en ellas un ejemplo de realización preferente de la invención, comprendiendo las partes y elementos que se indican y describen en detalle a continuación.

En la figura 1A se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una primera realización, que son, por un lado,

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) un fluorómetro (21), una fuente de radiación ultravioleta (UV) (22) y una fuente de alta radiación fotosintéticamente activa (PAR) (23), los cuales transmiten sus emisiones a través de fibras ópticas (42) pasantes a través de unos orificios (41) en la tapa (4) por un extremo (42a). Por otro se aprecia el plato térmico (31), encajado en piezas de aislante lateral (32). Cuenta además con una lámina aislante (33) anexa al plato térmico (31) por su cara superior, es decir, que la lámina aislante (33) queda situada entre el plato térmico (31) y el bloque térmico formado por las placas extraíbles (34), las cuales cuentan con al menos un alojamiento (34a). Se observan también los medios de sujeción (44) mecánica, y una primera sonda de temperatura (45a), situada en dicha realización en la parte central sobre el bloque térmico formado por las placas extraíbles (34), por debajo del mismo se encuentra el plato térmico (31) y por debajo de éste la unidad termoeléctrica (5) con al menos una plancha (51) de material conductor, y aún más por debajo el disipador térmico (61) con un ventilador (63) anexo, y el soporte (7) físico del conjunto. Señalar la presencia de unos medios de control de la temperatura (62) con un software de control (62a) incluyendo el control PID (controlador proporcional, integral y derivativo), y vinculado funcionalmente a lo anterior, la fuente de energía (8), en concreto la fuente de alimentación eléctrica (81).

Más detalladamente, señalar que los distintos elementos representados en dicha figura 1A, los cuales integran lo que sería una realización preferente de la invención, serían:

• Un conjunto de enfriadores termoeléctricos apilados o unidades termoeléctricas (5), separados por una plancha (51) de material con alto coeficiente de conducción térmica para conseguir un diferencial de temperatura mínimo de ± 65°C respecto a la temperatura ambiente;

• Un disipador térmico (61) para evacuar la temperatura generada por los enfriadores termoeléctricos o unidades termoeléctricas (5);

• Un ventilador (63) para forzar la circulación de aire a través del disipador térmico (61);

• Una pieza de soporte (7) que permite la colocación del conjunto sobre una superficie plana;

• Una pieza metálica, o de grafito, con alto coeficiente de conductividad térmica que constituye el plato térmico (31);

• Unas chapas intercambiables o placas extraíbles (34) que conforman el bloque térmico, con las celdas o alojamiento (34a) donde se depositan las muestras (1) a medir;

• Un sistema de sujeción o medios de sujeción (44) y ajuste de la tapa (4) principal;

• Un aislante (32) alrededor del plato térmico (31) que mejora la homogeneidad térmica y a su vez sirve de retención para las chapas térmicas (34) intercambiables (bloque térmico) que conforman el alojamiento de las muestras (1) (celdas).

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) • La tapa (4) principal está confeccionada mayoritariamente con material aislante para evitar la carga térmica atmosférica sobre el material en experimentación, si bien una parte de la misma puede ser metálica, por ej. de acero inoxidable.;

• Una primera sonda de temperatura (45a) que informa al controlador de temperatura o medios de control de la temperatura (62), de la temperatura a la que se encuentran las muestras (1);

• Un sistema de control de temperatura;

• Un conjunto de fibras ópticas (42) que permiten la medida de la fluorescencia de la clorofila para conocer la tolerancia al estrés de los organismos en estudio. Las mismas fibras ópticas (42) permiten la excitación de las muestras (1) en estudio mediante radiación UV y/o PAR.

• Una fuente de alimentación eléctrica (81) de corriente continua;

• Un software de control (62a) diseñado para programar la curva de temperatura deseada sobre las muestras (1) en experimentación;

Citar con respecto a la figura 1A, para mayor claridad, que la realización preferente del dispositivo termoeléctrico comprende: un conjunto de enfriadores termoeléctricos o unidades termoeléctricas (5) apilados, aislados del ambiente circundante por un aislante lateral (32) y separados entre sí, por una plancha (51) de material con alto coeficiente de conductividad térmica, que son capaces de ofrecer un diferencial de temperatura mínimo de ± 65 °C con respecto a la temperatura ambiente, pudiendo llegar de este modo a temperaturas de -35 °C hasta +90 °C. En la parte inferior se aprecia un disipador térmico (61) acoplado a la parte inferior del conjunto de enfriadores termoeléctricos o unidades termoeléctricas (5), cuya misión es la de disipar la temperatura generada por los enfriadores termoeléctricos o unidades termoeléctricas (5); un ventilador (63) para forzar la circulación de aire a temperatura ambiente a través del disipador térmico (61); una pieza de soporte (7) que permite la colocación del conjunto sobre una superficie plana; una pieza metálica o de grafito con alto coeficiente de conductividad térmica, preferentemente de aluminio, que constituye el plato térmico (31); una fina lámina aislante (33) que provoca, junto al aislante lateral (32), la correcta homogeneización térmica del bloque térmico; una o vahas chapas intercambiables y apilables, o placas extraíbles (34), con alto coeficiente de conductividad térmica que conforman las celdas o alojamientos (34a) donde se depositarán las muestras (1) a medir; un aislante lateral (32) alrededor del plato térmico (31) y bloque térmico que mejora la homogeneidad térmica y a su vez sirve de retención para las chapas térmicas intercambiables o placas extraíbles (34); una tapa (4) principal confeccionada mayoritariamente con material aislante para evitar la carga térmica atmosférica sobre el

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) material en experimentación, cuya superficie inferior está construida de material metálico con alto coeficiente de conductividad térmica, preferentemente acero inoxidable; un sistema de sujeción y ajuste, o medios de sujeción (44), de la tapa (4); una primera sonda de temperatura (45a) que informa al sistema de control de temperatura o medios de control de la temperatura (62), de la temperatura a la que se encuentra el conjunto térmico y las muestras (1); un sistema de control de temperatura; un conjunto de fibras ópticas (42) que permiten la medida de la fluorescencia de la clorofila para conocer la tolerancia al estrés mediante un fluorómetro (21), permitiendo también la excitación de las muestras (1) en estudio mediante un inyector de radiación UV, o fuente de radiación ultravioleta (UV) (22), y/o un inyector de radiación PAR, o fuente de alta radiación fotosintéticamente activa (PAR) (23); una fuente de alimentación eléctrica (81) de corriente continua y un software de control (62a) específicamente diseñado para programar la curva de temperatura deseada sobre las muestras (1) en experimentación.

En la figura 1 B se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una variante de la primera realización, incluyendo de modo diferencial un disipador térmico (61), pero sustituyendo el ventilador (63) por una bomba de circulación (64) de fluido térmico (35c), todo ello anexo al soporte (7).

En la figura 2 se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una segunda realización, la cual comprende también un plato térmico (31), una tapa (4) con una pluralidad de orificios (41), medios de sujeción (44), apreciándose por un lado una primera sonda de temperatura (45a), y por otro, una segunda sonda de temperatura (45b) conectada a un registrador de datos (47). De igual modo dicha segunda realización comprende una unidad termoeléctrica (5), medios de control de la temperatura (62) con un software de control (62a), en este caso un ventilador (63) anexo al soporte (7), y también la correspondiente fuente de energía (8), en concreto una fuente de alimentación eléctrica (81).

En la figura 3 se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una tercera realización, como serían esquemáticamente un plato térmico (31), medios de sujeción (44), una primera sonda de temperatura (45a) y un recolector (46) de muestras (1) a través de un tubo de succión (43). Cuenta de igual modo a las realizaciones anteriores con medios de control de la temperatura (62) con su software de control (62a), un ventilador (63) anexo al soporte (7), y la

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) correspondiente fuente de energía (8), de modo preferente una fuente de alimentación eléctrica (81).

En la figura 4 se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una cuarta realización, la cual comprende como las anteriores un plato térmico (31), sobre éste una cubeta (35) metálica de doble pared (35a) diseñada para ser llenada con un fluido térmico (35c) para una correcta disipación y homogeneización térmica, en la cual se dispone la muestra o muestras (1), alrededor de la cubeta (35), y sobre esta, se dispone un aislante que la aísla del ambiente exterior y hace las veces de tapa (4). Dispone también de medios de sujeción (44), una tapadera (35b) de la cubeta (35) específicamente diseñada para mejorar la estabilidad térmica, una primera sonda de temperatura (45a), conectada al conjunto de medios de control de temperatura (62) conectados a su vez a unidades termoeléctricas (5), con un software de control (62a), en este caso un ventilador (63) anexo al soporte (7), y también la correspondiente fuente de energía (8), en concreto una fuente de alimentación eléctrica (81).

En la figura 5A se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una quinta realización, la cual comprende también un plato térmico (31) sobre el que se dispone la muestra o muestras (1). En esta quinta realización la tapa (4) y su aislamiento adquiere un diseño tal que permite la inserción a través de la misma de una cámara (48) del tipo CCD o CMOS. La misma tapa (4), en su interior, dispone de una fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED que proporciona energía en el espectro de UV y/o el visible para provocar fenómenos de fluorescencia o reflexión lumínica. Dicha fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED está conectada a un regulador de intensidad (81a) que permite el ajuste de la potencia emitida. En esta ocasión también se dispone de una primera sonda de temperatura (45a), conectada al conjunto de medios de control de temperatura (62) conectados a su vez a unidades termoeléctricas (5), con un software de control (62a), en este caso un ventilador (63) anexo al soporte (7), y también las correspondientes fuentes de energía (8), en concreto fuentes de alimentación eléctricas (81). El sistema dispone también de los medios de sujeción (44) adecuados para la correcta fijación de la tapa (4).

En la figura 5B se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una vahante de la quinta realización, en la cual la fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED que proporciona energía en el

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) espectro de UV y/o el visible para provocar fenómenos de fluorescencia o reflexión lumínica, ha sido sustituida por un conjunto de fibras ópticas (42) para la conducción de la radiación lumínica proveniente de una o vahas fuente de radiación electromagnética (82) externa en diversas bandas del espectro electromagnético como el UV y el visible. En esta ocasión también se dispone de una primera sonda de temperatura (45a), conectada al conjunto de medios de control de temperatura (62) conectados a su vez a unidades termoeléctricas (5), con un software de control (62a), en este caso un ventilador (63) anexo al soporte (7), y también las correspondientes fuentes de energía (8), en concreto fuentes de alimentación eléctricas (81). El sistema dispone también de los medios de sujeción (44) adecuados para la correcta fijación de la tapa (4).

En la figura 6 se puede observar una vista en sección completa de los distintos elementos que componen el dispositivo termoeléctrico en una sexta realización, la cual comprende también un plato térmico (31) sobre el que se dispone la muestra o muestras (1). En esta sexta realización la tapa (4) y su aislamiento adquieren un diseño tal que permite la inserción a través de la misma de una cámara (48) del tipo multiespectral o hiperespectral. La misma tapa (4), en su interior, dispone de una fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED que proporciona energía en el espectro de UV y/o el visible para provocar fenómenos de fluorescencia o reflexión lumínica. Dicha fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED está conectada a un regulador de intensidad (81a) que permite el ajuste de la potencia emitida. En esta ocasión también se dispone de una primera sonda de temperatura (45a), conectada al conjunto de medios de control de temperatura (62) conectados a su vez a unidades termoeléctricas (5), con un software de control (62a), en este caso un ventilador (63) anexo al soporte (7), y también las correspondientes fuentes de energía (8), en concreto fuentes de alimentación eléctricas (81). El sistema dispone también de los medios de sujeción (44) adecuados para la correcta fijación de la tapa (4).

En la figura 7 se puede observar una vista en planta de una realización preferente de las placas extraíble (34) conductoras que constituyen los alojamientos (34a) de medida y del código alfanuméhco (34b) para identificación de las fibras ópticas (42) y los alojamientos (34a), de las muestras (1), preferentemente de organismos fotosintéticos (11).

Señalar a este respecto que, dependiendo de las chapas o placas extraíbles (34) insertadas y apiladas, se dispondrá de celdas o alojamientos (34a) de diferentes tamaños y grosores.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Observar también que, dependiendo del tamaño de las celdas o alojamientos (34a), estas podrán disponer de más o menos fibras ópticas (42) que les darán servicio.

Por último, en la figura 8 se puede observar una vista en planta y de perfil de una configuración del plato térmico (31) y del aislante lateral (32), mostrando la disposición de una placa extraíble (34) con sus respectivos alojamientos (34a), y también la de los medios de sujeción (44).

Más en particular, tal y como se observa en las figuras 1A y 7, el dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos (11), provocado por altas y/o bajas temperaturas, por radiación ultravioleta (UV) y/o por alta radiación fotosintéticamente activa (PAR), está configurado para el acoplamiento a un fluorómetro (21) y/o a una fuente de radiación ultravioleta (UV) (22) y/o a una fuente de alta radiación fotosintéticamente activa (PAR) (23), y comprende al menos una unidad termoeléctrica (5), un plato térmico (31), un disipador térmico (61) acoplado a la unidad termoeléctrica (5), medios de control de la temperatura (62) existente sobre el plato térmico (31) y al menos una fuente de energía (8), donde el plato térmico (31) está configurado para albergar al menos una placa extraíble (34), la cual comprende al menos un alojamiento (34a) para la colocación de al menos una muestra (1) de un organismo fotosintético (11).

Adicionalmente, tal y como se observa en las figuras 1A y 8, el dispositivo termoeléctrico comprende un aislante lateral (32) alrededor del plato térmico (31).

Por otro lado, tal y como se observa en la figura 1A, el plato térmico (31) comprende una lámina aislante (33) en la superficie sobre la cual se sitúa al menos una placa extraíble (34).

En una realización preferida de la invención, tal y como se observa en las figuras 1A y 7, el dispositivo termoeléctrico comprende una tapa (4) sobre el plato térmico (31) y/o la placa extraíble (34), donde la tapa (4) comprende al menos un orificio (41) para canalizar al menos una fibra óptica (42) cuyo extremo (42a) termina frente al alojamiento (34a). En otra realización la tapa (4) presenta una pluralidad de orificios (41) para canalizar una pluralidad de fibras ópticas (42).

Más concretamente, tal y como se observa en la figura 3, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos un tubo de succión (43) canalizado a través de dicho orificio (41).

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Por otro lado, tal y como se observa en la figura 2, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos una segunda sonda de temperatura (45b) canalizada a través de dicho orificio (41).

Adicionalmente, tal y como se observa en la figura 4, el dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos (11) comprende una cubeta (35) sobre el plato térmico (31), donde la cubeta (35) comprende una doble pared (35a) configurada para alojar un fluido térmico (35c).

Complementariamente, tal y como se observa en la figura 4, la tapa (4) comprende una tapadera (35b) que cierra la parte superior de la cubeta (35).

Preferentemente, tal y como se observa en las figuras 5, 5A y 6, la tapa (4) comprende al menos un agujero (49) para la inserción de una cámara (48).

Opcionalmente, tal y como se observa en la figura 5A, la cámara (48) es del tipo CCD o CMOS.

Alternativamente, tal y como se observa en la figura 6, la cámara (48) es del tipo multiespectral o hiperespectral.

Opcionalmente, tal y como se observa en las figuras 5 y 6, la tapa (4) comprende una fuente de radiación electromagnética (82) del tipo LED.

Preferentemente, tal y como se observa en las figuras 5 y 6, la fuente de radiación electromagnética (82) está conectada a una fuente de alimentación eléctrica (81), como fuente de energía (8), por medio de un regulador de intensidad (81a).

Adicionalmente, tal y como se observa en las figuras 2 y 8, el dispositivo termoeléctrico comprende medios de sujeción (44) de la tapa (4) sobre el plato térmico (31) y/o la placa extraíble (34), que son en una realización particular al menos un tornillo pasante con una palomilla de cierre.

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Preferentemente, tal y como se observa en las figuras 2 y 3, el dispositivo termoeléctrico comprende al menos una primera sonda de temperatura (45a).

Cabe señalar que, tal y como se observa en las figuras 2 y 3, que los medios de control de la temperatura (62) están en conexión con la primera sonda de temperatura (45a).

Según otro aspecto de la invención, tal y como se observa en las figuras 1A y 8, el dispositivo termoeléctrico comprende una pluralidad de unidades termoeléctricas (5) apiladas, aisladas del ambiente circundante por un aislante lateral (32).

Más en detalle, tal y como se observa en la figura 1A, la pluralidad de unidades termoeléctricas (5) apiladas están separados entre sí por una plancha (51) de material conductor térmico, cuyo valor de conductividad térmica ha de tener un valor mayor a 10 w/(m.K).

Según aún otro aspecto de la invención, tal y como se observa en las figuras 1A y 1 B, el disipador térmico (61) está acoplado a la parte opuesta al plato térmico (31) de la unidad termoeléctrica (5).

Y más concretamente, tal y como se observa en las figuras 1A y 1 B, el dispositivo termoeléctrico comprende un ventilador (63) o una bomba de circulación (64) de fluido térmico (35c). En particular el fluido térmico (35c) es un líquido refrigerante.

Por otra parte, tal y como se observa en las figuras 2 y 3, el dispositivo termoeléctrico comprende un soporte (7).

Opcionalmente, tal y como se observa en las figuras 2 y 3, la fuente de energía (8) comprende al menos una fuente de alimentación eléctrica (81).

Según una realización preferente de la invención, tal y como se observa en las figuras 7 y 8, la placa extraíble (34) comprende una pluralidad de alojamientos (34a) donde cada alojamiento (34a) comprende un código alfanumérico (34b), donde dicho código alfanumérico (34b) identifica cada uno de los orificios (41) en relación a los alojamientos (34a).

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) Los detalles, las formas, las dimensiones y demás elementos accesorios, así como los componentes empleados en la implementación del dispositivo termoeléctrico para la medida del estrés en organismos fotosintéticos, podrán ser convenientemente sustituidos por otros que sean técnicamente equivalentes, y no se aparten de la esencialidad de la invención ni del ámbito definido por las reivindicaciones que se incluyen a continuación de la siguiente lista.

Lista referencias numéricas:

I muestra

I I organismo fotosintético

21 fluorómetro

22 fuente de radiación ultravioleta (UV)

23 fuente de alta radiación fotosintéticamente activa (PAR)

24 fuente de radiación visible

25 luminómetro

31 plato térmico

32 aislante lateral

33 lámina aislante

34 placa extraíble

34a alojamiento

34b código alfanumérico

35 cubeta

35a pared

35b tapadera

35c fluido térmico

4 tapa

41 orificio

42 fibra óptica

42 a extremo

43 tubo de succión

44 medios de sujeción

45a primera sonda de temperatura

45b segunda sonda de temperatura

46 recolector

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) 47 registrador de datos

48 cámara

49 agujero

5 unidad termoeléctrica

51 plancha

61 disipador térmico

62 medios de control de la temperatura

62a software de control

63 ventilador

64 bomba de circulación

64a líquido refrigerante

7 soporte

8 fuente de energía

81 fuente de alimentación eléctrica

81a regulador de intensidad

82 fuente de radiación electromagnética

Textos referencias:

T 1 Inyector de radiación UV

T2 Inyector de radiación PAR

T3 Fluorómetro

T4 Control PID

T5 Registrador de datos

T6 Luminómetro

T7 Inyector de radiación visible

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HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)