AGENTES ANTIVIRALES

DESCRIPCION

La presente invención se refiere ai uso de derivados sulfurados de feniihidrazidas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades víricas. De forma más particular, se refiere al uso de dichos compuestos en el tratamiento y/o prevención de la enfermedad causada por el virus del Ébola (EBOV), de la peste porcina africana (PPA) y/o coronavirus. Por tanto, la invención se encuadra en el campo de la química médica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Compuestos sulfurados derivados de feniihidrazidas ya son conocidos en el estado de la técnica. Así, por ejemplo, aparecen descritos en el documento: Corral, C.; Lissavetzky, J.; Quintanilla, G. Analogs of anti psychotic phenothiazines 10- beta di alkylamino ethylamino phenothiazines. J Het Chem 1978 , 15, 969-975, así como en el documento ES469493, donde además se divulga su uso como agentes neurolépticos.

No se ha encontrado ningún documento donde se utilice este tipo de compuestos como agentes antivirales, especialmente para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad causada por el virus del Ébola, de la peste porcina y/o coronavirus.

Actualmente, estamos asistiendo a un aumento de las enfermedades víricas emergentes y re-emergentes a nivel mundial. De hecho, las enfermedades infecciosas son una de las mayores preocupaciones de la sanidad pública tanto humana como veterinaria. Tal es el caso de la enfermedad por el virus del Ébola. Se trata de una enfermedad muy grave y contagiosa, causante de fiebre hemorrágica y con una alta tasa de mortalidad en humanos, que puede llegar a ser del 90%. A día de hoy no existen vacunas ni tratamientos aprobados para esta enfermedad, y debido a la gravedad de la infección y lo imprevisible de la aparición de nuevos brotes, la necesidad de desarrollar antivirales específicos es muy grande (Malvy, D.; McElroy, A. K.; de Clerck, H.; Guntber, S.; van Griensven, J, Eboia virus disease. Lancet 2019, 393, 936-948). En el caso de infecciones veterinarias, la peste porcina africana acapara la actualidad siendo además una de las enfermedades animales de mayores repercusiones socioeconómicas. El virus de la peste porcina africana (VPPA) produce una enfermedad hemorrágica de elevada mortalidad en el cerdo doméstico y en ios jabalíes (Alejo, A.; Matamoros, T.; Guerra, M.; Andrés, G. A Proteomic atlas of the African swine fever virus particle. J Virol 2018, 92, doí:10.1128/JVI.01293-01218).

A la vista de lo conocido en el estado de la técnica, la presente invención propone un nuevo uso hasta ahora no descrito de los compuestos sulfurados derivados de fenilhidrazldas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención presenta una familia de compuestos que poseen actividad antiviral en orden micromolar, resultando de interés para el tratamiento de enfermedades víricas tales como las causadas por el virus del Ébola, el virus de la peste porcina africana y los coronavirus.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) o cualquiera de sus isómeros o sus sales farmacéuticamente aceptables donde:

R ₁ es NR _a R _b , donde R _a y R _b se seleccionan independientemente de entre H y alquilo Cr

C ₄ o bien R _a y R _b forman un heterocido con el N, y

R ₂ y K ₃ se seleccionan independientemente entre H y halógeno, para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades víricas.

En una realización preferida, R ₁ es NR _a R _b , donde R _a y R _b son independientemente alquilo C ₁ -C ₄ o R _a y R _b forman un heterocido con el N,

Cuando R _a y R _b forman un heterocido con el N, dicho heterocido presenta preferiblemente 5, 6 o 7 eslabones. En otra realización preferida de la presente invención, R _a y R _b son iguales y son grupos alquilo metilo o etilo.

En otra realización preferida de la presente invención, NR _a R _b es un grupo seleccionado de:

En otra realización preferida de la presente invención, R _a es un H y R _b es un alquilo Cr

C ₄ . Más preferiblemente, R _a es un H y R _b es un alquilo C ₂ , aún más preferiblemente, R _a es un H y R _b es un alquilo C ₂ sustituido por un heterociclo que comprende al menos un nitrógeno.

En otra realización preferida de la presente invención, R ₂ es H y R ₃ es H o halógeno.

En otra realización preferida de la presente invención, el halógeno es Cl.

En una realización más preferida de este primer aspecto, la invención se refiere al uso de los compuestos de fórmula (!) seleccionados de la lista que comprende:

N'-(2-((4-cloro-2-nitrofenil)tio)fenil)-2-(dimetilamino)a cetohidrazida

N'-(2-((5-Gloro-2-nitrofenil)thio)fenll)-2-(dietilamino)a cetohidrazida

N'-(2-((5-doro-2-nitrofenil)tio)fenil)-2-(pirrolidin-1-il )acetohidrazida

N'-(2-((5-cloro-2-nitrofenil)tio)fenil)-2-(piperidin-1-il )acetohidrazida

N'-(2-((2-nitrofenil)tio)fenil)-2-(piperidin-1-il)acetohi drazida

Una realización preferida de la invención se refiere a los compuestos de fórmula general (I) como se han descrito anteriormente para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad causada por ¡os virus del Ébola, por el virus de la peste porcina africana y por los coronavirus.

Una realización de la invención se refiere a los compuestos de fórmula general (1) como se han descrito anteriormente para el tratamiento y/o prevención de la enfermedad causada por coronavirus humanos. La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento y/o prevención de enfermedades víricas.

En general, la cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de fórmula (I) a administrar dependerá, entre otros factores, del individuo (humano o animal) que vaya a ser tratado, de la severidad de la enfermedad que padezca dicho individuo, de la forma de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente.

Los compuestos de la invención representados por la fórmula (l) para su uso pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de la presente invención. En este sentido, el término “solvato”, tal como aquí se utiliza, incluye tanto soivatos farmacéuticamente aceptables, es decir, soivatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como soivatos farmacéuticamente no aceptables, ios cuales pueden ser útiles en la preparación de soivatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es critica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los soivatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en la materia.

Los compuestos de fórmula (i) para su uso terapéutico se preparan en forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptabie. Estos preparados pueden ser administrados por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicho preparado se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, ¡a administración del compuesto de fórmula (i) se efectúa por vía oral, tópica, rectal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intramuscular, intravenosa, etc.).

Los compuestos descritos en ¡a presente invención para su uso, sus sales farmacéuticamente aceptables, soivatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal o solvato farmacéuticamente aceptables del mismo.

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención para su uso también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos que tienen dicha estructura, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en ¹³ G o ¹⁴ G o un nitrógeno enriquecido en ¹⁵ N, están dentro del alcance de esta invención.

En la presente invención, el término “alquilo C ₁ -C ₄ ” se refiere, en la presente invención, a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 átomos de carbono y que se unen ai resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, propilo, etilo, metilo, isopropilo, etc. En el contexto de la presente invención, estos radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos en una o más posiciones por uno o más grupos tales como hidroxilo, aminas, amidas, oxo, ciano, halógenos, arilo, heterociclos, etc; más preferiblemente el sustituyente es un heterocicio; aún más preferiblemente, un heterocicio que comprende ai menos un nitrógeno. Dicho heterocicio puede estar, a su vez, sustituido por uno o más grupos tales como hidroxilo, aminas, amidas, oxo, ciano, halógenos, arilo y/o bencilo.

El término “halógeno” se refiere en la presente invención a flúor, cloro, bromo o yodo.

La expresión “tratamiento o prevención” tal y como se usa aquí, a menos que se indique lo contrario, significa revertir, aliviar, inhibir el progreso de, o prevenir el trastorno o afección al que se aplica en tales términos, uno o más síntomas de tal trastorno o afección.

La expresión “excipientes, adyuvantes y/o vehículos” se refiere a entidades moleculares o sustancias con las que se administra el ingrediente activo. Tales excipientes, adyuvantes o vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como aguas y aceites, incluyendo aquellas de petróleo o de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, excipientes, disgregantes, agentes humectantes o diluyentes. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para ios expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad como antivirales de los compuestos de la invención.

Para llevar a cabo los ensayos, los inventores utilizaron los compuestos representados en la siguiente tabla, todos ellos descritos en el documento: Corral, C.; Líssavetzky, J.; Quintanilla, G, Analogs of anti psychotic phenothiazines 10-beta di aikyiamino ethylamino phenothiazines. J Het Chem 1978, 15, 989-975 y/o en el documento ES469493.

Ejemplo 1 : Estudie de la actividad antiviral de les compuestos de fórmula (i) frente al virus de la peste porcina africana (VPPA)

Materiales y Métodos Tratamiento e infección

Para la realización de los diversos ensayos, las infecciones con VPPA se realizaron sobre monocapas de células Vero (ATCC-CCL-81) (fibroblastos renales) a una multiplicidad de infección (mdi) de 5 ufp/célula. Los inóculos víricos se añadieron siempre sobre el mínimo volumen necesario para cubrir el tapiz celular, tras el tratamiento previo de las células con los compuestos durante una hora a 37 °C. Transcurrido el tiempo de pre-tratamlento, se permitió la absorción del inoculo viral durante 60 minutos a 37 °C y por último, se retiró el medio junto con el inoculo viral y se reemplazó por medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% suero fetal bovino (SBF) en combinación con los distintos compuestos para proseguir con el tratamiento hasta alcanzar las 16 horas post infección (hpi).

Todos los compuestos se diluyeron inicialmente en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de 50 mM. A continuación, se diluyeron en medio DMEM al 2% en suero fetal bovino (FBS) hasta alcanzar la concentración requerida en cada caso.

Ensayos de Citotoxicidad

La viabilidad celular en presencia de ios distintos compuestos a diversas concentraciones, fue determinada a las 24 horas mediante el kit comercial “Cell titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proiiferation Assay” (Promega) mediante la lectura de ios valores de absorbencia a 490 nm, siguiendo las instrucciones del fabricante. Aquellas concentraciones que permitieron una viabilidad celular igual o superior al 80% fueron consideradas como no citotóxicas. Este sistema está basado en ¡a cuantificación colorimétrica de la reducción del tetrazolio en formazán por la actividad de enzimas deshidrogenasas de células metabólicamente activas.

Detección y cuantificación dei DMA viral

Posteriormente a la infección y el tratamiento con ¡os distintos compuestos, se realizó la extracción de ¡as células y la posterior obtención y purificación de ADN con el kit “Dneasy blood and tissue kit” (Quiagen), Las concentraciones obtenidas se cuantificaron en el espectrofotómetro “UV-Vis Nanodrop ND-1000” (Fisher Termo Scientific).

Para el análisis de la replicación viral se realizó una PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) mediante sondas de hibridación fluorescentes dirigidas a amplificar la región del gen viral p72 como se ha descrito previamente (King, D, P,; Reid, S, M.; Hutchings, G. H.; Grierson, S. S.; Wilkinson, P, J.; Dixon, L. K.; Bastos, A, D.; Drew, T. W. Development of a TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J Viro / Methods 2003, 107, 53-61). Para ello se analizaron las muestras de ADN purificadas previamente, utilizando como control negativo agua, como control positivo ¡as muestras tratadas con DMSO y como curva patrón, 5 diluciones seriadas de ADN viral purificado de concentración conocida. La mezcla para ¡a amplificación se compuso de 150 ng de ADN de cada una de las muestras, ¡a sonda Taqman (Roche), ¡os cebadores OE3F y OE4R cuya secuencia aparece descrita por King ei ai., obtenidos de Fisher Scientific y “Premix Ex Taq (2X)” (Takara).

El proceso de amplificación y cuantificación se ¡levó a cabo en un termociclador “ABi 7500 Fast Real-Time PCR System” (Applied Biosystems) con los siguientes parámetros: 1 ciclo de 94 °C durante 10 minutos, 45 ciclos de 94 °C durante 15 segundos y 58 °C durante 60 segundos.

Citometría de flujo

Para el análisis por citometría de flujo sin el mareaje con anticuerpos, las células fueron infectadas con ios virus recombinantes realizados en el laboratorio BPP30GFP o B54GFP, descritos en Barrado-Gil, L; Galindo, I.; Martinez-Alonso, D.; Viedma, S.; Alonso, C. The ubiquitin-proteasome system is required for African swine fever replication, PLoS One 2017, 12, e018974 y en Hernaez, B.; Escribano, J. M.; Alonso, C. Visualization of the African swine fever virus infection in iiving cells by incorporation into the virus particle of green fluorescent protein-p54 membrane protein chimera. Virology 2008, 350, 1-1 , respectivamente. Transcurridas 16 hpi las células se levantaron con tripsina y se centrifugaron a 2500 rpm durante 5 minutos. Los sobrenadantes se desecharon y las células se resuspendieron en lampón FACS (del inglés, “fiuorescence- activated cell sorter’). Finalmente se analizaron 10.000 células por experimento en un diámetro de flujo “FACS Canto Il" (BD Science) para determinar el porcentaje de células infectadas. El porcentaje obtenido tras ei tratamiento con los compuestos se normalizó con los valores de los controles. Una vez obtenidos los resultados con las concentraciones óptimas, se calcularon las CI ₅₀ empleando diferentes concentraciones de compuestos.

Análisis estadístico

Todos los datos se obtuvieron por la realización por triplicado de los experimentos y la normalización de las medidas a los valores control. El análisis estadístico de la varianza entre datos se realizó con el software GraphPad Prism 6, aplicando el test de Bonferroni en las comparaciones múltiples.

Resultados ^a Cl ₅₀ : Concentración inhibitoria 50% o requerida para reducir la infección viral en un 50%. ^b CC ₅₀ : Concentración citotóxica 50% o requerida para reducir el crecimiento celular en un 50%. ^c IS: Indice de selectividad (CC ₅₀ /Cl ₅₀ )

Ejemplo 2: Estudio de la actividad antiviral de los compuestos de fórmula (I) frente al virus del Ébola (EBOV)

Materiales y Métodos Lineas celulares

Las células de riñón embrionario humano 293T/17 (ATCC-CR L- 11268) y las células de adenocarcinoma cervical humano HeLa (ATCC-CCL-2) se cultivaron en medio DMEM suplementario con 10% de FBS y 1% L-glutamina en incubador a 37 °C en presencia de un 5% de CO ₂

Producción de virus recombinantes basados en el virus de inmunodeflciencia humana (VIH), con envolturas (GP/G) de virus Ebola (ZEBOV) Mayinga o Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) y que expresan Iuciferasa tras la infección de células susceptibles.

Se generaron partículas virales basadas en el virus VIH. pseudotipadas con la glicoproteina de la cepa Ebola-Mayínga (GeneBank: U23187.1) (ZEBOV-GP) o bien la glicoproteina del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G) (GenBank: XG3833.1) que expresan la proteina Iuciferasa tras la infección de células susceptibles.

La producción de estas partículas virales se llevó a cabo mediante el método de transfección con cloruro de calcio (Life Technologies, Carisbad, CA, EE. UU.) en céiulas 293T añadiendo los plásmídos: pNL4.3,Luc.RE- (Programa de reactivos del SIDA de NIH, División de SIDA del Dr. Nathaniel Landau) y la respectiva glicoproteina de cada virus.

Los sobrenadantes que contenían ios virus recombinantes se recogieron 48 h después de la transfección, se centrifugaron a 1200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar ios restos celulares y se almacenaron congelados a “80 °C en alícuotas.

Los títulos infecciosos de cada pseudotípo viral se estimaron realizando diluciones seriadas (diluciones en serie 1 :5 por triplicado) de los sobrenadantes virales e infectando células 293T. La actividad Iuciferasa se determinó 48 h después de la infección mediante el ensayo de luciferasa (Luciferase Assay System, Promega, Madison, WI).

Cribado de compuestos inhibidores de la infección por virus Ébola El cribado de compuestos inhibidores de la entrada del virus Ébola, se realizó infectando células 2931 con pseudctipos ZEBOV-GP en placas de 96 pocillos en presencia de cada compuesto a una concentración final de 10 μM.

Las células 2931 (2x10 ⁴ células/ pocillo) se incubaron a 37 °C durante 1 h con cada uno de los compuestos y luego se expusieron a 5000 TCID (dosis infecciosa de cultivo) de ios virus recombinantes mencionados anteriormente. Después de 48 h de incubación, las células se lavaron con PBS, se Usaron mediante la adición de Steady-Glo Lyssis Buffer (Promega) y se midió la luz en un sistema de detección GloMax®-Multi + (Promega, Madison, WI, EE. UU.) con el sistema de ensayo de luficerasa (Promega, Madlson, Wl).

Como control de inhibición específica, se utilizó el virus recombinante VSV-G en las mismas condiciones y en paralelo a la infección con pseudotipos de Ébola.

Los valores de inhibición se calcularon a partir de 3 experimentos independientes (n=6) y se plasman como ia media aritmética.

Los compuestos cuya actividad inhibitoria frente a pseudotipos ZEBOV-GP redujeron ia infección más de un 80% a una concentración final de 10 μM, fueron seleccionados para posteriores análisis (Cl ₅₀ y citotoxicidad).

Cálculo de los valores de Cl ₅₀

Para calcular el valor Cl ₅₀ , se emplearon concentraciones seriadas de cada compuesto desde 10 μM a 10 nM.

Los valores de inhibición se calcularon utilizando la media de 3 experimentos independientes (n=6) empleando el programa informático GraphPad Prism v6.D, con un intervalo de confianza del 95% y una configuración para normalizar curvas de dosis- respuesta.

Análisis de toxicidad de compuestos

Se emplearon células Hela (2x10 ⁴ ) tratadas con diferentes concentraciones: 10, 100 y 250 μM de cada compuesto durante 48 horas en placa de 96 pocilios. Tras este periodo, se lavaron las células con medio de cuitivo y se midió ia viabilidad mediante el método colorimétrico (Ensayo de proliferación celular no radiactivo Cell Titer 98 AQueous, Promega}.

En resumen, 20 μl de la solución combinada de MTS/PMS (reactivo) se mezclaron con 100 μl de células en medio de cultivo y se incubaron adicionalmente durante 2 horas a 37 °C en una atmósfera humídificada de CO ₂ al 5%. La absorbancia se registró a 490 nm utilizando un lector de placas ELISA. La viabilidad celular se calculó como el porcentaje de absorbancia en ¡as células con el compuesto en relación con las células no tratadas.

Resultados ^a Cl ₅₀ : Concentración inhibitoria 50% o requerida para reducir la infección viral en un 50%. ^b CCsc·: Concentración citotóxica 50% o requerida para reducir el crecimiento celular en un 50%. ^c IS: índice de selectividad (CC ₅₀ /Cl ₅₀ )

Ejemplo 3: Estudio de la actividad antiviral de los compuestos de fórmula (I) frente a coronavirus humano 229E-GFP.

Materiales y Métodos Lineas celulares

Las células de hepatocarcinoma humano Huh-7 Lunet C3 (cedidas por T. Pietschman, Twincore, Alemania) se cultivaron a 37 °C en presencia de un 5% de CO2 en medio, Dulbeeco's modified Eagle's médium (DMEM) suplementado con 100 lU/mL penicillin, 100 μg/mL estreptomicina, 10 mM HEPES 1x Gibco MEM NEAA y 10% suero fetai bovino inactivado con calor.

Virus

Las infecciones se reaiizaron con el alfa-coronavirus 229E-GFP del catarro común (ATCC VR-70), que expresa el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) (229E-GFP; cedido por V, Thiel, Universidad de Berna, Suiza y descrito en Cervantes-Barragan L, et al. Dendrific cell-specific antigen delivery by coronavirus vaccine vectors induces long- lasting protective antiviral and antitumor immunity. mBio, 2010, e00171-10.). Después de 24 horas de infección a 33 °C en atmósfera con 5% de CO2, se examinaron los valores de infectividad por determinación de la expresión de GFP medida por citometría de flujo.

Ensayos de cltotoxieidad

En primer lugar, se realizaron ios test de viabilidad y citotoxicidad de los compuestos y del solvente orgánico DMSQ en el que van disueltos los compuestos por separado. Se sembraron células Huh-7 en placas de 96 pocilios y se incubaron con cada compuesto en concentraciones desde 0 a 100 μM en DMSO. Después de 24 h, se midió ¡a viabilidad celular usando el ensayo de proliferación no radioactivo CellTiter 96 (Promega) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector de ELISA. La viabilidad celular era el porcentaje de absorbancia en células tratadas relativo a las células tratadas con DMSO. Basados en estos experimentos se seleccionaron las concentraciones óptimas de trabajo que no eran tóxicas para usar en ios ensayos de infección.

Cribado de compuestos inhibidores de la infección por coronavirus Los compuestos se añadieron desde 1 hora antes de la infección. Después, se infectaron las células, con una multiplicidad de infección de 1 ufp/célula (ufp, unidades formadoras de placa), se añadió compuesto fresco en cada caso y se mantuvieron el tiempo de la infección durante 24 horas. Después de este tiempo las células se lavaron con PBS y se procedió a ¡a detección por cítometría de flujo.

Análisis mediante citometría de flujo

Se trataron las células Huh-7 con ios compuestos a las concentraciones indicadas en medio de crecimiento durante 1 h a 33°C, seguido por la infección del CoV 229E-GFP a una multiplicidad de infección de 1 upf/ceil 24 horas. Se recogieron las células en PBS y se analizaron para la detección de GFP. Para determinar el porcentaje de células infectadas por condición, se usaron 8,000 células por caso usando el citómetro de flujo FACS Canto ll (BD Sciences) analizadas usando el programa FlowJo.

Análisis estadístico

Para calcular el valor Cl ₅₀ , se emplearon concentraciones seriadas de cada compuesto desde 10 μM a 10 nM.

El análisis estadístico se analizó mediante one-way ANOVA mediante Graph Pad Prism 8 software. Para comparaciones múltiples, se aplicó la corrección de Bonferroni. los valores se expresaron como diagrama de barras con la media y desviación standart de al menos 3 experimentos independientes. Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p menores de 0.01.

Resultados ^a Cl ₅₀ : Concentración inhibitoria 50% o requerida para reducir la infección viral en un 50%. ^b CC ₅₀ : Concentración citotóxica 50% o requerida para reducir el crecimiento celular en un 50%. ^c lS: índice de selectividad (CC ₅₀ /CI ₅₀ )