[명세세

【발명의 명칭】

상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 악취 저감용 조 성물

[기술분야】

본 발명은 상황버섯 (/¾e/// 2"s species) 추출물 또는 베타글루칸 ( β -glucan) 을 유효성분으로 함유하는 악취 저감용 조성물에 관한 것이다. 【배경기술】

바섯류는 세계적으로 약 20， 000여 종이 알려져 있으며 그 중 식용으로 개발 가능한 것은 약 2,000여 종이다. 국내 분포하는 버섯롭는 약 992종이 기톡되어 있고 이중 식용 버섯이 100여 종， 독버섯이 50여 종이며， 특히 맹독성을 가진 버섯이 20여 종으로 확인되어있다. 약 20여 종 이상의 버섯이 국내에서 재배가능하며 항암， 콜레스 '테를 저하， 혈당강하 등이 입증된 바 있다. 전 세계적으로 상황버섯은 약 280여 종류가 존재한다. 대부분의 상황버섯은 노란색을 띠며 나이테 무늬를 형성하며 성장하는데， 현재 가장 널푀 인공 재배되는 버섯 품종 중의 하나이다. '떼쩟은 유용한 생리 활성 대사 산물의 생산 및 의약품으로의 많은 재료로 큰 잠재력을 기지고있음이 알려져있다. 버섯이 가지고 있는 다당류는 대부분 베타글루칸 (β-glucan) 그룹에 속하는 수송 화학 성분 (deferent chemical composition)이다. 이러한 버섯의 생물학적 활성 화합물의 중요한 소스 (valuable sources)는 항암， 항혈소판 및 항염증 특징을 가지고 있다. 상황버섯 (/¾e/// /s species) 중 대표적인 것은 목질진흙버섯으로 Phellinus linteus라는 학명으로 알려져 있다. 그러나， 한국의 경우 대표적인 재배종은 상황버섯 바우미 (/¾e/// 2is baumin로— 전체 상황 배재 농가의 98% 이상을 차지하고 있다. 특이하게 상황버섯 바우미가 식용으로 허용되고 건강증진 식품으로 활용되는 곳은 한국이 유일한 것으로 알려져 있으며， 현재까지 상황버섯으로부터 다양한 생리활성물질들의 분리 연구가 지속적으로 진행되고 있으며ᅳ 추출방법에 따른 상황버섯 추출물의 효능변화 및 평가가 검토되고 있다. 자실체 이외에 균사체에서도， 상황버섯 자실체와 유사한 혈액 항웅고 활성， 항산화 효과， 항암작용， 위궤양 완화효과 및 항염증작용, 알츠하이머 (Alzheimer) 질환 치료를 위한 베타 시크리타제 (β-secretase) 저해활성 등의 다양한 생리활성이 보고되면서 상황버섯의 균사체 배양에 많은 연구가 집중되고 있으나， 상황버섯 또는 이로부터 분리된 물질의 악취 저감 효과는 알려진바 없다. 베타글루칸 (β-glucan)은 세균， 버섯， 효모 및 곡물 소스로부터 얻어지는 면역 조절자 (i隱 une modulators)로 알려져있고， 다당류를 발생시키고， 이러한 글루코스 (glucose) 중합체 (polymers)는 특정 병원성 세균 및 균류 (fungi) 세포벽의 성분이다. 베타글루칸은 베타 -1,6-연계된 결사슬 (side chain)에 상관없이 베타- 1,3-연계된 베타 -D-글루코피래노실 (glucopyranosyl) 유니트 (units)로 이루어져있고 균류 세포벽 성분을 보존하고， 주요 PAMPs 중 하나로 인식되는 것으로 알려져있다 (Brown, 2006) .

오래전부터 담자균류의 고등균류는 알반적인 의약품으로 사용되었다. 버섯의 면역 강화작용 및 항종양 활성과 같은 의약적 효과는 베타글루칸에 의한 것이라고 본다 . 왜냐하면 '알파글투칸은 진핵 영양분 요소이고ᅳ 포유류의 효소에 쉽게 분해되고， 면역자극 활성어 없으나， 쎄타글루칸은 다양한 균류에서 유래되고， 경구 투여하였을 때 인간 효소에 의해 분해되지않으나， 대신 소장에서 점막 및 전신 면역을 자극하여 흡수된다 (Vos et al., 2007). 흡수된 베타글루칸은 항종양 활성뿐만 아니라， 동물과 인간에 균류 및 세균에 의한 감염이 있을 때 숙주를 보호하는 능력을 활발하게 한다. 베타글루칸은 높은 분자량임에도 불구하고, 경구투여시 장에서 흡수되고， 선천적 및 후천적 면역력을 활성화시킨다.

베타글루칸은 글루코스 중합체이고， 백본 (backbone)으로 선형 베타 (1，3)- 연계된 D-글루코스 분자와 다양한 크기의 베타 (1，6)-연계된 결사슬이 백본과 다른 간격으로 존재한다. 다양한 베타 (1,3)， 베타 (1，4) 및 베타 (1，6) 베타글루칸 -연계 가운데 오직 베타 (1,3)만 면역력을 활발하게 하고, 항종양 활성을 보인다. 처음 알려진 베타글루칸의 기능은 항종양 활성 (Chihara et al., 1970)이고， 그 이후 항균 (antifungal), 항감염 (anti-infection)(0nderdonk et al. , 1992)， 방사선방호 (radioprotective)(Gu et al .， 2005) , 콜레스테를 감소 (cholesterol reduction) (Wo lever et al . , 2011) 및 식후 ^. 당 대 1"활성 (postprandial glucose metabolic activities)(Batti lana et al . , 2001)을 포함하는 다른 많은 생물학적 활성이 보고되었다. 베타글루칸은 동물에서의 아스페르길루스 (Aspergillus)(Torosantucci et al. , 2005) 및 칸디다성 질염 (Candida vaginal )(Pietrel la et al., 2010) 감염 및 바다 물고기에서의 비브리오 (Vibrio) 감염 (Zhu et al. , 2006)에서 면역강화 활성의 백신 또는 보조제 후보로 예방을 위해 사용되어졌다. 오트 및 보리와 같은 식물의 베타글루칸은 주로 베타 (1，4) 연계된 것이고， 버섯 및 균류의 베타글루칸은 베타 (1,3) 백본에 짧은 베타 (1， 6)-연계된 사이드체인으로 가지가 았다 (Yan et al. , 2005). 이러한 글루칸와 구조， 형뙈 및 소스의 차어는 생물학적 활성에 영향을 줄 수 있음이 알려져있다 (Brown and Gor.don, 2001).

FM0(Flavin— containing monooxygenase)는 보조인자 (cofactor) 플라빈 (flavin)을 통해 주로 부드러운 친핵체로써 기질의 산화를 촉진시키는 효소의 그룹이다. 사이토크룸 (cytochrome ) P450 효소와는 대조적으로 FM0는 일반적으로 생체에물 물질 (xeraabiot c substance >에 의해 유도되거나 억제되지않는다. 인갚: ΡΜΘ는 조적 특성을 보이는떼， FM01은 인간 태아 간 및 성인 신장에 존재하고， FM02는 폐에 존재하며， FM03은 성인 간에 존재한다/

FM0는 폭넓고 중복된 특이도 (specificity)를 가진 미세소체 (microsomal) 산화 (oxidative) 효소의 두번째 군이다. FM0의 주요 반웅은 해테로 원자 (hetero- atom)의 유형이 각각 N-옥시드 (oxide), S-옥시드 또는 P-옥시드인 질소 (nitrogen)， 황 (sulfur) 또는 인 (phosphorus) 해테로 원자 화합물의 친핵성을 촉진시킨다. 사이토크롬 P450과 기능적인 부분이 중복되지만, 작용기전은 다르다. FM0는 효소에 기질이 결합하기 전에 분자 산소에 결합하고， 활성화한다. 또한， 보조인자로 플라빈 아데노신 디뉴클레오티드 (flavin adenosine dinucleot ide, FAD)를 필요로 한다. 사아토크롬 P450 효소와는 달리 F 0는 열에 민감하고， 신진대사를 연구하는 연구자들이 효소 시스템을 구별하는데 유용하게 사용할 수 있다. TMA(trimethylamine)는 질소화합물 가운데 하나로서， 극히 저농도에서도 썩은 생선 냄새 같은 코를 찌르는 악취를 풍기는 3족 지방성 아민 (tertiary aliphatic amine)이다. 본래 TMA는 섭취한 음식물 가운데 주로 콜린 (choline)과 같은 전구물질이 장내 미생물에 의하여 분해되어 생성된다. 정상적인 경우 생성된 TMA는 간에서 FM03 효소의 작용으로 무취성 비휘발성분인 TMAO trimethylamine N- oxide, 용융점 220 내지 222 ^° C)로 전환되어 대부분 소변을 통하여 배출되나， 애완동물 및 돼지， 오리, 닭 및 소 등의 가축의 경우에는 TMA0로 유의적으로 전환되지 않고， 소변 및 대변에 많이 남아있어 악취가 발생하는 원인이 되며， 이러한 악취가 공동생활주택이나 농장 주변에서의 불만 및 민원의 원인이 된다. 특히 TMA의 비등점 (boiling point)은 3 내지 7 ^° C이므로 실온에서는 항상 가스형태로 휘발하므로 다수의 동물여 접단으로 사육되는 가축 사육장은 겨울철에도 심한 악춰를 나타내므로 동물이-나 가축 등의 악취를 부작용없이 저감시키는 기술은 절실한 실정이다.

이에， 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과， FM03 유전자 발현이 증가하면 악취성 휘발성분인 TMA가 무취성 비휘발성분인 TMA0로 전환되어 악취가 감소됨을 확인하였코， ^황빼섯 추출물 몇 상황'버섯에서 분라한 베타글루칸을 동물 모펠에 경구투여할 켱우， 잔에서 F103의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인함으로써， 상황버섯 추출물 및 베타글루칸을 애완동물 및 가축 악취 저감용 사료 첨가제로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

[발명의 상세한 설명】

[기술적 과제】

본 발명의 목적은 상황버섯 (/¾e///y s species) 추출물 또는 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯 (Phellinus species) 추출물 또는 베타글루칸 (β-glucan)을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상황버섯 (Phel l inus species) 추출물 또는 베타글루칸 ( β -glucan)을 애완동물 또는 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 악취 제거 또는 저감 방법을 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 상황버섯 0¾e///; s speci es) 추출물을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제를 제공한다. 또한， 본 발명은 상황버섯 0¾e/// /s species) 추출물을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용사료 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 상황벼섯 C/¾e////3i/s species) 추출물을 애완동물 또는 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 악취 제거 또는 저감 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 악취 제거 또는 저감에 사용하기 위한 상황버섯 (/¾e///y s species) 추출물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 베'타글루칸 ( -glucan)을 유효성-분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제를 제공한다.

또한， 본 발명은 베'타글루칸 ( -gJucan)을 유효성분으로 함읍하는 악취 제거 또는 저감용 사료 조촁물을 제공한다：.

또한， 본 발명은 베타글루칸 ( β -glucan)을 애완동물 또는 가축에게 투여하는 단계를 포함하는 악취 제거 또는쩌감 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 악취 쎄거 또는 저감에 사용하기 위한 베타글루칸 ( β - glucan) 또는 이를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 상황버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 약학적 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 상황버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 건강기능식품을 제공한다.

【유리한 효과]

본 발명의 상황버삿 0¾e////7 /s species) 추출물 또는 베타글루칸 ( β - glucan)은 간에서 F 0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써， 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 이용하여 FM03의 발현을 증가시킴으로써 악취성 휘발성분인 TMA(tr imethylamine)를 무취성 비휘발성분인 TMAOCtr imethylamine oxide)로 대사시킴으로써， 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

[도면의 간단한 설명】

도 la는 상황 ^: 버섯 (/¾e/J/y¾/s species) 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램 (hi stogram)으로 나타낸 도이다. 도 lb는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상자그림 (box plot )으로 나타낸 도이다.

도 lc는 상 버 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를魁 pl©t으로나타낸 도이다.

도 Id는 상황버^ 쩔수추출물 (PBE) '단'일투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도 (correlat ion scatter plot )로 나타낸 도이다.

도 2a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.

도 2b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 단일투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.

도 3a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 히스토그램으로 나타낸 도이다.

도 3b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 ^' 변화를 분석한 결과를 상자그림으로 나타낸 도이다.

도 3c는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 MA plot으로 나타낸 도이다.

도 3d는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 간 유전자 발현 변화를 분석한 결과를 상관분석 산점도로 나타낸 도이다.

도 4a는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 계층적 클러스터링 결과를 나타낸 도이다.

도 4b는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 다중투여군에서의 유전자 발현 패턴을 나타낸 도이다.

도 5는 상황버섯 열수추출물 (PBE) 투여군에서의 RNA 품잘 (quality)를 확인한 도이다:

Cont： 대조군 ; 및

PBE: 상황버 ¾ 뎔수추출물 처리군.

도 ^' 6은 마우스 장기에 -따른 FMQCFJavin-contai-ning monooxygenase) 유전자의 발현을 확인한 도아다:

Tissues: 조직 종류;

Liver: 간;

Lung: 폐; ^' 및

Kidney; 선잠..

도 7은 마우스 조직별 추출물 처리에 따른 f!O 유전자의 발현 변화를 확인한 도이다:

Tissues: 조직 종류;

Liver: 간조직;

Lung: 폐 조직 ;

Kidney; 신장 조직;

Cont： 대조군 ;

PBE: 상황버섯 열수추출물 처리군;

PBW: 상황버섯 수층분획물 처리군;

PBG: 상황버섯 베타글루칸 처리군;

20： 20 nig/kg; 및

100： 100 nig/kg. 도 8은 SD 랫트에서 각종 베타글루칸의 경구투여에 의한 FM03의 발현증가를 확인한 도이다. 랫트 (n = 3)에 PBG(25 mg/kg) , Zymosan(25 mg/kg) , Bar ley(25 mg/kg)를 하루 1회， 7일간 경구투여한 후에 간을 적출하여 FM03의 발현을 real t ime PCR로 분석하였다:

FM03 : f l avin containing monoᄋ xygenase 3；

Con : contro l；

PBG: Phel inus baumi i βᅳ으 glucan ;

Zymosan: β -D-glucan from yeast； 및

Bar ley: β -D-glucan(pur i ty: ≥95%) from bar ley.

도 9는 SD 랫트에서 각종 베타글루칸의 경구투여에 와한 소변중의 악취성분인 TMA의 감소효과를 확언한 도이다. 랫트 (n = 3)예 PBG(25 mg/kg) , Zymosan( 25 mg/kg) , -Bar ley (25 .mg/kg)를 하루 1회， 7일간 경구투여한 후에 7일째의 소변을 취하여 악취성분인 TMA을 SPME-GC/MS로 분석하였다:

TMA: tr imethyamine ;

Con: control；

PBG: Phel 1 inus baumi i ^{^} D-glucan;

Zymosan: β -.D-gl¾can from yeast； 및

Bar 1 ey： β -D-gi can(i ur i t. ： ≥'95%) from Parley.

[발명의 실시를 위한 최선의 형태]

이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 상황버섯 (/¾e///72i s species) 추출물 또는 베타글루칸 ( β - glucan)을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제를 제공한다. 상기 상황버섯 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

1) 상황버섯에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계. 상기 방법에 있어서， 단계 1)의 추출용매는 물, Ci 내지 C ₂ 저급 알코을 또는 이들의 흔합물을 용매로 하여 추출하는 것이 바람직하며， 상기 저급 알코을은 에탄올 또는 메탄올인 것이 바람직하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출용매는 건조된 상황버섯에 10 내지 100배로 하는 것이 바람직하고， 20 내지 50배 첨가하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 추출온도는 70 내지 140°C인 것이 바람직하고， 85 내지 110 ^° C인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출시간은 1 내지 36시간인 것이 바람직하고， 9 내지 24시간인 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서， 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조， 진공건조， «ᅵ등건조， 분무건조또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 상황버섯은 상황버 ¾ 바우미 (/¾e//// s baumii) 또는 상황버섯 린테우스 (/¾ _e /// ws Iinteus) °A 것이 바람직하고， 상황버섯 바우미인 것이 더욱 바람직하다 .

상기 베타글루칸은 담자균류， 식물 및 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분^된 것이 바람직 '하 상황 ^: 벼섯， 영지버섯 ( fe ¾¾fe/7 lucidum) , 동충하초 (Cordyceps)와 ^" 은 담자균류， 보려와 같은 식물 및 효모를 비롯한 진균류로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 분리된 것이 보다 바람직하며， 상황버섯, 보리 및 효모로부터 분리된 것이 더욱 바람직하다.

상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 FM03(Fl avin-cont aining monooxygenase3) 유전자 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하고， FM03 유전자는 TMA( tr imethylamine)를 TMAO tr imethyl amine N-oxi de)로 전환시키는 것을 특징으로 한다.

상기 FM03 유전자는 서열번호: 13(GenBank 등록번호: 匪_008030)으로 나타내는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

상기 악취는 애완동물 또는 가축의 분 또는 뇨에 포함된 인간에게 불쾌감을 일으킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 상황버섯 열수추출물， 상황버섯 수층분획물 및 상황버섯 베타글루칸을 제조하였고， 이를 단일투여 (24시간)와 다중투여 (7일)로 나눠 각각 하루에 한번 경구투여한 후， 단일투여군과 다중투여군에서의 간 유전자의 발현 변화를 확인하였고 (도 la 내지 도 4b 참조)， 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 투여한 마우스에서의 FM0 유전자의 발현 변화를 확인한 결과， 단알투여와 다중투여 모두에서 FM03 유전자 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 (표 4 참조)， 조직에서의 RNA 품질 (qual i ty)를 시각화하여 확인하였다 (도 5 참조) .

또한， 본 발명자들은 마우스 조직에 따라 FM0 유전자의 발현을 확인한 결과 같은 FM0 유전자군 (gene fami ly)어더라도 조직에 따라 발한량의 차이가 나는 것을 확인하였고 (도 6 참조)， 상황버섯 열수추출물: (PBE；)， 상황—버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (PB 을 처리함에 따라 조직에서의 FM0 읍전자의 발현 변화를 확인한 결과， 간에서의 FM03와 신장에서꾀 FM04에서 처리 농도에 와존적으로 발현량이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7 참조) .

또한， 본 발명자들은 Zymosan (효모 쎄타글루칸)ᅳ Bar ley (보리 베타글루칸)을 7일간 경구투여후 랫트의 간에 발현된 FM03을 real t ime PCR로 분삭하였다. 그 결과， 샅황버섯 쩨타글루 에서는 2.4배 (2.43 + 0.34) , 효모 베타글루칸에서는 2.9배<2.94 ± 0.1:9) , 보리 베、타글루 ¾에서는 2.2배 (2. 15 土

0.31) ) 가량 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 8 참조) . ' 또한， 본 발명자들은 버섯， 효모， 식물 유래의 베타글루칸 ( β -D-glucan)이 랫트에서 FM03 를 증가시켜 뇨중의 악취성분인 TMA(tr imethylamine)의 분해를 촉진시키는지 분석하였으며 그 결과 Control group 의 7 일째 소변중의

TMA( zg/day)는 846.3 土 118.6 이었으며, PBG 투여 group 은 619.0 土 51.3

(대조군의 73. 1 ) , zymosan 투여 group 은 396.2 土 280.4 (대조군의 46.8%) 그리고 bar ley투여 group은 717.3 士 172.8 (대조군의 84.8%)이었다 (도 9 참조) . 즉， zymosan 과 PBG 에 의하여 강력하게 악취성분이 감소하였다. 이러한 악취성분의 감소효과는 발현된 FM03 의 양과도 일치하였다. 즉， FM03 의 발현이 가장 강하게 발현된 zymosan 과 PBG 의 투여에 의하여 악취성분도 강하게 감소하였다. 또한 베타-글루칸에 의한 소변 내 악취 물질인 TMA 의 감소는 상황버섯에 국한된 것이 아니라 효모와 보리 유래의 베타-글루칸에서도 가능함이 확인되었다. 따라서 천연에 존재하는 모든 베타글루칸에 의하여 소변중의 악취성분의 감소는 가능함을 보여주고 있다.

따라서， 본 발명의 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써， 상기 상황버섯 열수추출물 또는 베타글루칸을 이용하여 FM03의 발현을 증가시킴으로써 악취성 휘발성분인 TMA(trimethylamine)를 무취성 비휘발성분인 TMAO(tr imethylamine oxide)로 대사시킴으로써， 악취 제거 또는 저감용 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명에 있어서는 상거 사료첨자제를 그 '대로 또는 공지의 담체， 안정제 등을 가할 수 있으며， 필요에 따라 비타민， 아미노산류， 미네랄 등의 각종 양분， 항산화제 및 기타꾀 첨가제 등을 카할 수도 ¾으며ᅳ 그 형상으로서는 분체, 과립， 펠릿， 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단독으로 또는 사료에 흔합하여 공급할 수 있다. 또한, 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용쎄합서ᅳ료 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 장황버섯 추출물 ^' 또는 베타늘루칸이 ^' 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 사료 첨가제 조성물은， 투여를 위해서 상기 기재한 성분 이외에 추가로 구연산， 후말산， 아디픽산， 젖산 등의 유기산이나 인산칼륨， 인산나트륨， 중합 인산염 등의 인산염이나 폴리페놀， 카테친， 토코페를， 비타민 C, 녹차 추출물， 키토산， 탄니산 등의 천연 항산화제 쥼 1 성분 이상을 흔합하아사용할 수 있으며， 필요에 따라 항인플루엔자제， 완충액， 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제， 분산제， 계면활성계， 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액， 현탁액， 유탁액 등과 같은 주사용 제형， 캡슐， 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한， 본 발명의 사료 첨가제 조성물 및 이를 포함하는 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산， 무기염류， 비타민， 항산화， 항곰광이, 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀， 보리， 옥수수 등의 식물성 단백질사료， 혈분， 육분， 생선분 등의 동물성 단백질 사료， 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제， 성장 촉진제， 소화 흡수 촉진제， 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

상기 동물 사료용 사료 첨가제는 동물의 사료에 직접 흔합하거나 사료와 별도로 단독으로 경구 제형， 주사 또는 경피로 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여 할 수 있다. 투여량은 동물의 체중， 건강상태， 식이， 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 당 업계에서 잘 알려진 바와 같이 일일 투여량은 약 0. 1-lOmg/g, 바람직하게는 O . Q5~lmg/g이며， 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 사료 첨자제는깍취 저감을 목적으로 사료에 첨가될 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제를 자료 첨가물로 사용할 경우， 상기 사료 첨가제를 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 첨가제의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또^ 서방성 제형으로 제조 할 수 있다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분， 락토스， 수크로스와 콩 플레이트 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체의 경우에는 정제， ¾1：제， 토로켜제로 사용될 수 있으며 액체형 담체의 경우 시럽제， 액체 현탁액제， 에멀견제， 용액제 투여 형태일 수 있다. 또한， 투여제는 보존제， 윤화제， 용액 촉진제， 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유 할 수도 있다.

본 발명의 사료 첨가제 조성물은 포유류， 가금류， 어류 및 갑각류를 포함하는 다수의 동물 식이 즉， 사료에 적용할 수 있다. 상업용으로 중요한 돼지， 소， 염소 등의 포유류， 코끼리， 낙타 등의 동물원 동물， 개， 고양이 둥의 가축에게 사용할 수 있다. 상업적으로 중요한 가금류에는 닭， 오리， 거위 등이 포함되며 송어와 새우와 같은 상업적으로 사육되는 어류 및 갑각류를 포함 할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 첨가제 조성물을 포함하는 동물용 사료 배합 방법은 사료 첨가제 조성물을 동물사료에 건조 중량 기준으로 1kg 당 약 10g 내지 500g, 바람직하기로는 10g 내지 100g의 양으로 흔합하는 것이다. 또한 사료 흔합물을 완전히 흔합한 후， 매쉬로 공급하거나， 추가가공 공정을 통하여 팰렛화， 팽창화， 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써， 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 이용하여 FM03의 발현을 증가시킴으로써 악취성 휘발성분인 TMA를 무취성 비휘발성분인 TMA0로 대사시킴으로써， 악취 제거 또는 저감용 배합 사료 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한， 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 언간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 악춰 제거 '또는 저감방법을 제공한다.

상기 인간을 제외한 채체는 인잔만을 제외한 말, 양， 돼지ᅳ 염소， 낙타， 영양， 소， 닭， 오리， 개， 고양이 등의 동물을 의미한다.

상기 악취 제거 또는 저감 방법은 비록 인간을 제외한 동물을 대상으로 하는 방법이나， 인간에 있어 이러한 방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 ^' 따 악취 제거 또는 저감 방법에 의해 악취 제거 또는 저감에 충분히 사용되여 질 수 엤꽈. 즉， 원언불명으로 FM03 효소의 발현이 저하되어 TMA0로 전환서키저 못하는 트뫼메 '털아민뇨증 OTr imethylaminur i a 또는 Fi sh odor syndrome) 환자인 경우에는 체내에 과잉의 TMA가 소변， 땀， 호흡으로 과다하게 분비되어 생선 썩는 냄새가 심하므로 이러한 환자 등에게 적용될 수 있다.

본 발명의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 FM03의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써， 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 이용하여 FM03의 발현을 증가시킴으로써 악취성 휘발성분인 TMA를 무취성 비휘발성분인 TMA0로 대사시킴으로써， 악취 제거 또는 저감 방법으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한， 본 발명은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 유효성분으로 함유하는 악취 제거 또는 저감용 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공한다. 악취 제거 또는 저감 효과를 가지는 본 발명의 조성물은 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸을 단독으로 포함하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체， 부형제 또는 희석제를 추가로 포함함으로써 통상적인 방법에 의해 약학적 조성물로서 제형화될 수 있다.

상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애， 현기 증과 같은 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한， 상기와 같이 제형화 된 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 투여 경로를 통해 악취 제거 또는 저감을 촉진 하기 위한 목적으로 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 경구， 경피， 피하， 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로가 포함 될 수 밌꽈.

본 발명의 약학적 조성물에 었어서， ·기 약학적 조성물은 선택된 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제제화 할 수 있으며， 제제화할 경우에는 보통 자용하는 충진제， 중량제， 결합제， 습윤제， 붕붸 제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산 제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합，물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 칼슘카보에이트 (Calcium cartonat ) , 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose)， 젤라틴 등을 섞어 조제된빠 . ^' 또한 단순한 부형제 어외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제， 내용액제， 유제， 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 회석제인 물, 리퀴드 파 라핀 이외에 여러가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제로서는 피부 외용제가 포함된다.

본 발명의 악취 제거 또는 저감 효능을 제공하는 조성물을 피부 외용제로 하는 경우, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며， 예를 들면， 로션， 연고， 겔， 크림, 패취 또는 분무제의 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 있어서 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸은 약학적 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 90 중량 %로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태， 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 있어서， 상기 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸의 바람직한 투여 량은 환자의 상태 및 체중， 질병의 정도， 약물형태， 투여경로 및 기간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하 게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해세 1일 0.001 mg/kg 내지 10 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고， 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐， 생쥐， 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예상되는 투여의 모든 방식이 가능하며， 예를 들면， 경구， 피부 도포， 직장， 또는 정맥， 근육， 피하， 자궁내 경막 또 는 뇌혈관내 ( IntracerebroveiTtr icular) 주사에 꾀해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 악취 제거 또는 저감을 위하여 단독으로 또는 수술， 호르몬 치료, 약물 치 료 및 생물학적 반웅 조절쎄 * 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다. 이하， 본 발명을 실서예쎄 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예서하는 것일 ψ , 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한점쬐는 것은 마'니다. 통계처리

실험결과는 평균士표준편차로 표기하였고， 모든 측정은 최소 3번씩 수행하였다. 평균값의 집단 간 비교는 InStat 3.06(GraphPad software Inc . , 미국)을 이용하여 AN0VA 단방향 분석으로 수행하였다. 유의성 있는 ρ값은 <0.05로 표기하였다. <실시예 1>상황버섯 ¾e////KAs »ω»/7) 추출물의 제조

<1-1>상황버섯 열수추출물 (/¾e/// M/s baurnii extract , ΡΒΕ)의 제조

본 발명자들은 상황버섯 추출물을 제조함에 있어서， 추출 수율은 온도, 정제수의 양， ρΗ , 추출시간 및 상황버섯 조각 등의 추출 상태에 따라 달라지게 되는 것을 확인하였다. 보통 추출 온도는 85 ^° C , 90 ^° C , 95 ^° C , 100 ^° C , 105 °C 및 110°C이고， 추출 시간은 9시간， 18시간 및 24시간이다. 이에， 상황버섯을 건조시켜 조각을 낸 후， 상황버섯 조각 4 g 또는 10 g에 정제수 200 (20배 또는 50배)를 넣고， 현탁액을 여과한 후, 추출 수율을 측정하였다.

또한， 상기 방법을 이용하여 추출물을 대량생산 하였다. 200 i 추출기에 잘게 썬 상황버섯 조각과 20 i 정제수를 넣고, 24시간 동안 11CTC에서 20번 추출하였고， 여과장치로 여과한 후， 여과액을 농축하였다. 이를 각각 감압하에 동결건조하였다. 추출 수율은 하기 표 1에 나타내었다.

【표 1】

본 연구에서 상황버섯 열수추출물은 국태께서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 제조하았다.

구체적으로， 상황버섯 자실체 100 g 을 2000 m의 증류수를 넣고 100°C의 중탕보로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 ι 의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 、반복 추출하여 얻은 추출액을 100 로 감압농축한 후에 동결건조시켜 상황버섯 열수추 물( /¾ ///；^5 baumi i extract , PBE 을 ' ᅳ었다 .

<1-2> 상황버섯 수층분획물 (/¾e/// s baumii water fract ion, PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (/¾e/// H s baumii β -Glucan, PBG)의 제조

국내에서 재배한 상황버섯 자실체를 구입하여 공지된 방법을 이용하여 베타글루칸을 정제하였다.

구체적으로， 상황버섯 자실체 100 g 을 2000 의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하였다. 추출액을 여과하여 보관한 후 잔사에 다시 2000 의 증류수를 넣고 100 ^° C의 중탕으로 24시간 추출하여 총 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 100 111£로 감압농축한 후에 4 ^° C로 만든 다음 감압농축액에 -20 ^° C로 빙넁시킨 300 에탄올 (약 ,3배)을 넣고 4시간 동안 4°C에 두었다. 4시간 후, 침전물이 베타글루칸이고， 상기 분리한 베타글루칸을 Beta-glucan assay ki t (Megazyme . co)를 이용하여 확인하였으며， 이를 동결 건조하여 상황버섯 베타글루칸 (/¾e////?i/s baumii β-Glucan, PBG)이라 칭하였다. 한편， 상황버섯 열수추출물 중에서 에탄올에 침전하지 않는 상등액은 여과지로 여과한 후에 농축한 후에 동결건조하여 상황버섯 수층분획물 ( ¾e///2i/s baumii water fraction, PBW)이라 칭하였다.

<실시예 2>세포배양및 동물모델 디자인

<2-1>세포배양

마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포 (ATCC, Rockville, MD)를 페니실린( ∞1(:111 1)(10，000 units/mO-스트렙토마이신 (streptomycin)(10,000 units/m^) 및 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)(Gibco-BRL, 미국)을 첨가한 DMEM 배지로 계대쎄양하였교, 37 ^° C, 5% C ⁽ ¾ 인큐쎄에터에서 배양하였다. T-25 플라스크 (flask)에 배양하여， 계대쎄양 할 때는 1QX 트립신( ^1 ½)쒜)^ 용액을 DMEM을 이용하여 10배 희석하여 사용하였다. 조직배양 플라스크에 배양된 Raw 264.7 세포에 IX 트립신 -EDTA 용액을 넣고 37 ^° C에 10분간 흔합시킨 후, 트립신 반응에 의해 단일세포로 만들어주고， 이러한 반웅을 종결하기위해 1θ% FBS가 함유된 DMEM 배지를 첨가한 후， 2·번 세척하였다. 어 후 낮은 온도에서 원심분리한 후 계대배양 하였다..

<2-2>동물모¾ 디자인

체중 25 내지 30 g의 5주령 수컷 MPF( murine pathogen free, out bred-mouse) ICR 마우스를 샘타코 (Samtako Bio Korea)에서 구입하여 경구투여 실험동물로 사용하였다. 마우스는 물과 식이는 자유롭게 먹을 수 있도록 하였고， 조명 사이클을 12시간은 밝게， 12시간은 어둡게 설정하였다. 방은 22.5 ^° C 온도에， 42.5% 습도로 유지하였다.

상황버섯 열수추출물은 동결건조시킨 분말을 사용하여， 증류수에 용해시켜 경구투여하였다ᅳ 실험 그룹은 대조군 ( _contro l, _n =2), 100 mg/kg의 수용성 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE-100, n=2)으로 나누었고， 단일투여 (24시간)와 다중투여 (7일)로 나눠 하루에 한번 경구 투여하였다.

또한， 상황버섯 열수추출물 (PBE), 상황버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루칸 (PBG)은 동결건조시킨 분말을 사용하여， 증류쑤에 용해시켜 경구투여하였으며， 실험 그룹은 대조군 (control, n=3), 20 mg/kg의 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE-20, n=3), 100 mg/kg의 상황버섯 열수추출물 처리군 (PBE- 100， n=3), 20 rag/kg의 상황버섯 수층분획물 처리군 (PBW— 20， n=3), 100 mg/kg의 상황버섯 수층분획물 처리군 (PBW-100, n=3), 20 mg/kg의 상황버섯 베타글루칸 처리군 (PBG-20, n=3) 및 100 mg/kg의 상황버섯 베타글루칸 처라군 (PBG-100, n=3)으로 나누었고， 7일간 하루에 한번 경구 투여하였다.

<실시예 3>단일투여군에서의 간유전자의 발현 변화 분석

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자언한 동물 모델을 가지고 간에서 샘플을 얻어 마여크로어레아 (microarray) 방법을 통해 간 유전자와 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로， 실시예 <2-2>와 동일한 방 ^' 법으로 디자인한 동물 모델 중 단일투여군 마우스를 디클로로메탄 (dichloromethan, CH ₂ C1 ₂ )으로 안락사시킨 후， 2 mi 튜브에 150 mg 조직을 얻고，標 A를 얻기 위해 -20 °C 이하로 샘플을 보관하였다. Mouse Gene 1.0 ST arrayCAffymetrix Inc)를 사용하여 -마어크로어레이를수행하여， 0D 260/280 비로 확인하였다 어렇채 확인한 결과를 히스토그램 (histogram), 상자그림 (box plot), MA plot 및 상관분석 산점도 '(correlation scatter plot)을 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 la 내지 도 Id에 나타내 바와 같이， 간 유전자 발현 양상을 확인하였다 (도 la 내지 Id).

또한， 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 100 mg/kg의 농도로 단회 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 ² 】

유전자 온를로지 경로 정보의

분석 디자인 cutoff 조절 주요 유전자의 수 - 정보의 수 丁

다운 1264 901 282

대조군 VS 1.3

업 1184 925 349

PBE-100

1.5 다운 292 184 75 업 328 226 93

다운 61 31 14

2

업 45 36 18

다운 22 1 0

3

업 9 8 7

또한， 상기 <표 2>를 바탕으로 cutof f 2.0으로 설정하여， 계층적 클러스터링 (c luster ing)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이， 대조군과 상황버섯 열수추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고， 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다 (도 2a 및 도 2b) .

<실시예 4>다중투여군쎄서의 간유전자의 발현 변화분석

상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자언한 동물 ᅳ모펠을 자지고 간에서 샘플을 얻어 마이크로아레이 (mi croarray) ^' 방 ^' 법을 통해 간 유전자의 발현 변화를 분석하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <2-2>와 동일한 방법으로 디자인한 동물 모델 증 다중투여군 마우스를 가지고， 상기 <실시예 _3>과 동ᅳ 한 ^' 방법으 S 분석하였다. 그 결과 도 3a ^지 도 3 에 나티 "네 하와 간 융전자 발현 양상을 확인하였다 (도 3a 녜쪄 m.

또한， 상기 결과를 토대로 주요 유전자를 분석하여 대조군과 비교하여 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 100 mg/kg의 농도로 7일간 다중 경구투여한 실험군에서의 발현양상 변화를 하기 표 3에 나타내었다.

【표 3]

유전자 온톨로지

분석 디자인 cutof f 조절 주요 유전자의 수 경로 정보의 수 정보의 수

다운 1153 864 300

1.3

업 1358 1092 349

대조군 VS 다운 304 219 86

1.5

PBE-100 업 368 300 93

다운 51 38 17

2

업 87 81 26 다운 19 13 5

3

업 24 22 8

또한， 상기 <표 3>를 바탕으로 cutof f 2.0으로 설정하여， 계층적 클러스터링 (cluster ing)을 이용하여 특정 유전자 클러스터링을 수행하였다.

그 결과 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이， 대조군과 상황버섯 추출물 처리군의 계층적 클러스터링 결과를 확인하였고， 이의 유전자 발현 패턴을 확인하였다 (도 4a 및 도 4b) .

<실시예 5> FMKFlavin-containing monooxygenase) 유전자의 발현 변화 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법을 사용하여 얻은 상황버섯 열수추출물 (PBE)을 경구투여한 ·Κ 마우스의 ¾t조직: (l iver .tdssue)에서의 FM0 유전자의 발현 변화를 확인하였다.

[표 4】

그 결과 상기 표 4에 나타낸 바와 같이， 단일투여의 경우에는 FM03 유전자만 5.13배 증자하였고， 다중투여의 경우에는 FM02는 3.8배， FM03는 17.6배 및 FM04는 3.14배 증가하는 것을 확인하였다 (표 4) .

<실시예 6> RNA품질 (qual ity) 확인

상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 얻은 조직에서 RNA를 얻어 겔 전기영동 (gel electrophoresi s)을 이용하여 18S 리보솜 RNA(rRNA) 및 28S rRNA를 시각화하여 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이， 단일투여의 경우 rRNA의 integri ty가 1.6 및 1.7로 나타났고， 다중투여의 경우 rRNA의 integrity가 2.4 및 2.4로 나타남을 확인하였다 (도 5).

<실시예 1>마우스조직에 따른 FM0유전자의 발현 확인

마우스 간， 폐 및 산장 조직에서의 FM0유전자 발현을 '확인하였다.

구체적으로， 마우스를 디클로로메탄 (dichloromethan, C¾Cl2)으로 안락사시킨 후， 간， 폐 및 신장 조직을 얻고， 실험 전 얼려서 보관해둔다. 넁동된 조직을 절단하고， 트리졸 (Trizol) 시약 1 ^을 넣어서 균질화 (homogenized)한 후， 샘플을 5분 동안 실온에 보관한다. 이에 0.2 ml 클로로포름 (chloroform)을 넣고， 류브를 15초 동안 강하게 볼텍스 (vortex)하고， 2 내지 3분 등안 보관한다. 이 후, 샘플을 4 ^° C에서 15분 동안 12Ό0Θ rpm으로 원심분리하면 흔합물은 빨잔색으로 보이는 아래쪽에 페놀 ('phenol)「클로로포름 층과 색어 없는 위쪽의 물층으로 나뉜다. 물층을 새로운 튜브로 옮기고， 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol) 0.5 m£을 넣고， 균질화한 후， 살온에서 10분간 보관한 후， 4 ^° C에서 15분 동안 12000 rpm으로 원심분리한다. 상층액을 제거하고， 침전된 ： RNA 펠렛 (pel let)을 75¾ 에탄을 (ethanol)(10i» ΈΐΟΗ 35 ηίί'+DEPC water 15 mi) 1 111«로 한 번 세척한 후， 샘플을 볼텍스로 섞어주고， 4 ^° C에 5분 동안 7500 rpm으로 원심분리하였다. RNA 펠렛은 건조시킨 후， 50 βί Nase-fr ee water를 첨가하고， 56 ^° C에서 10분간 보관하였다. 이렇게 얻은 RNA의 농도는 NanoDrop 2000 UV 분광광도계 (spectrophotometer)로 측정하였다. 얻은 RNA를 M— MLV 역전사효소 (Mokmey Murine Leukemia Virus reverse Transcr iptase) (Pr omega , 미국)를 사용하여 cDNA 합성을 수행하였다. RNA/프라이머 흔합물은 멸균된 PCR 튜브에 5 i RNA, 올리고 (dT) (0.5 β / μί) 1 μί, DEPC 처리한 물을 10 ^까지 넣어주고， 70 ^° C에서 10분 동안 반웅시킨 후， 얼음에 최소 5분간 놓아둔다. 반웅 흔합물은 5 X 반웅 완충용액 4 10 mM dNTP흔합물 2 μΐ, 증류수 2.4 ≠, RNase 억제제 (inhibitor) 0.1 ^로 흔합하여 각 RNA/프라이머 흔합물과 부드럽게 섞어주고， 간단히 원심분리하여 모아준다. 이를 42T에 3분간 놓아둔 후， 1 ^ M- MLV 역전사효소를 넣고, 섞어준 후 42 ^° C에 60분 동안 놓아둔다. 반웅 종결은 70°C에 5분간 놓아두고， 얼음에 놓아 식혀준 후， 간단히 원심분리하여 반웅물을 얻는다. 이렇게 얻은 반웅물은 바로 PCR 하거나， 실험 전까지 -20 ^° C에 보관한다.

RT-PCR은 하기 표 5에 나타낸 바와 같이 디자인한 프라이머를 이용하여 PCR 튜브에 주행 RNA 1 / 와 역방향 프라이머를 섞어주고, 5분간 70°C에서 반웅시킨 후 얼음에 놓아둔다. 이에 정방향 프라이머를 넣어주고， 반응 볼륨이 20 가 되도록 DEPC 물로 채워준다. 이를 하기 표 6에 나타낸 바와 같이 PCR 조건으로 수행하였다. PCR 결과물은 1.0% 아가로즈 겔을 이용하여 전기영동으로 확인하였고， 이미지는 LAS-3000으로 확인하였다.

【표 5】

【표 6]

PCR cycle 온도 시간

1 cycle initial denaturat ion 95 °C 2분

30cycle denaturat ion 95 °C 30초

annealing 55 ^" C 30초

elongation 72 °C 1분

lcycle final elongation 721 5분 그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이 같은 FM0 유전자군 (gene fami ly) 이더라도 조직에 따라 발현량의 차이가 나타나는 것을 확인하였다 (도 6) .

<실시예 8>마우스장기별 추출물 처리에 따른 FM0유전자의 발현 변화확인

마우스 간， 폐 및 신장 장기에서의 추출물 처리에 따른 FM0 유전자 발현변화를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <2-2>에 기재된 방법으로 추출물을 경구투여한 동물 모델을 가지고， 상기 <실시예 7>과 동일한 실험 방법으로 RT-PCR을 통해 확인하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 5>와 비슷한 결과로 간에서의 FM03 '및 신장에서의 FMQ4에서 상황버섯 열수추출물 CPBEᅵ)， 상황버섯 수층분획물 (PBW) 및 상황버섯 베타글루 (1 ( 을 처리한 군에서 처리하지 않았을 때보다 농도 의존적으로 발현량아 증가하는 것을 확인하였고， 상황버섯 열수추출물이나 상황버섯 수층분획물보다 상황버섯 베타글루칸을 처리한 군에서의 FM03의 발현 변화가 더욱 확실하게 나타남을 확인하였다 (도 7) .

지금까지의 결과를 토대로 상황 ^' 버섯 추출물 ^' 또는 베타글루짠을 경구투여 함으로써 간에서 FM0 유전자군 중에서 특히 꾀 발현을 크게 증자서키는 것을 확인함으로써， 본 빨명의 ^황、버셧 추출물 또는 베， _' 타글루칸을 어용하여 _FM03 의 발현을 증가시킴으로써 악취성 휘발성분인 트리메틸아민 (tr imethylamine)을 무취성 비휘발성분인 트뫼메틸아민옥시드 (tr imethylamine oxide)로 대사시킴으로써， 애완동물 및 가축 악취저감 사료의 첨가제로 사용할 수 있다. '

<실시예 9>마우스 장기에서 FM03유전자의 발현 분석 확인

상기 <실시예 8>에서와 같이 상황버섯의 베타글루칸 ( β -D-glucan)이 마우스의 간에서 FM03의 발현을 촉진하는 것을 확인하였으나 상황버섯은 매우 고가이므로 이보다 가격이 저렴한 효모 또는 식물에서 추출한 베타글루칸도 FM03의 발현을 촉진하는 지 규명하기 위하여 각종 베타글루칸 을 7일간 경구투여후 랫트의 간에 발현된 FM03을 real t ime PCR로 분석하였다.

구체적으로， SD rat를 1주일간 사육장에 적웅시킨 후에 4 group으로 나누어 식염수 (Control), 상황버섯. (PBG), 효모 (Zymosan, Sigma-Aldr ich Co. , USA), 보리 (Barley, Sigma-Aldr ich Co. , USA)의 베타-글루칸을 25 mg/kg의 농도로 하루 1회， 총 7일간 경구 투여 후 간을 적출하였다. 적출한 장기에서 RNA 분리를 수행하기 위해 각 조직에 1 TRIzol reagent를 처리한 후 homogenizer를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 250 ί chloroform을 넣고 잘 섞은 후 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 550 ill isopropan 을 이용하여 RNA를 침전시킨 후 75% ethan 로 세척하고 자연 건조시켰다. RNase free water로 RNA를 녹인 후 RNA농도 측정 후 -80 ^° C에서 저장하였다.

추출한 RNA에 역전사로 cDNA를 합성하기 위해 oligo d(T)15-mer(EBT-1523, Elpis Biotech, Korea) , reaction buffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl， 3 mM MgC12, 10 mM DTT, pH 8.3)， 10 mM dNTP과 2Θ© unit M-MLV-RT (Moloney murine leukemia virus reverse t r anscr -iipt ase , Pr omega , .USA)를 분.리한 ^. RNA에 ^' 처리하여 cDNA를 _. 합성하였다. 합성된 dDNA를 이용하여 real time PGR을 수행하였다. Real time PCR용 plate multiplate PCR plates 96-well clear, #MLL9601, Bio-rad, United Kingdom)에 2X Amp i gene qPCR Green Mix Lo-Rox(Enzo, #ENZ-NUC103) 10 id, forward primer 1 μλ, reverse primer 1 μί, template DNA 2 μί, distilled H20 6 ^를 넣어준 뒤 Optical Adhesive covers (Applied Biosystems, USA)를 덮어주었다. 1500 rpm에서 5분간 ceritrifiage하여 spin down하여 real time PCR 기거 (CFX- Connect , Bio— rad)를 이용하여 real time PCR을 polymerase activation 2 min, 95 ^° C , 1 cycle, denaturat ion 5 sec , 95 ^° C , anneal i ng/ extension 30 sec , 65 ^° C , 40 cycles 수행하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 랫트에 7일간 생리식염수 (대조군), PBG (상황버섯 베타글루칸)， Zymosan (효모 베타글루칸)， Barley (보리 베타글루칸)을 각각 25 mg/kg의 농도로 경구투여한 후에 간을 적출하여 FM03의 발현을 real time PCR로 분석한 결과 상황버섯 베타글루칸에서는 2.4배 (2.43 土 0.34), 효모 베타글루칸에서는 2.9배 (2.94 ±0.19), 보리 베타글루칸에서는 2.2배 (2.15 士 0.31)) 가량 증가한 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

결론적으로 베타글루칸에 의한 FM03의 증가는 상황버섯의 베타글루칸에 국한된 것이 아니라 효모와 식물유래의 보리 베타글루칸에 의해서도 나타나는 것으로 확인되었다. 따라서 고가의 상황버섯을 이용하기 보다는 저가의 효모 또는 보리 유래의 베타글루칸을 사용하여도 FM03의 발현이 증가된다

<실시예 10>뇨중 TM trimethylamine)의 분해 촉진 확인

5 버섯， 효모， 식물 유래의 베타글루칸 (i3-D_glucan)이 랫트에서 FM03 를 증가시켜 뇨중의 악취성분인 TMA(trimethylamine)의 분해를 촉진시키는지 분석하기 위하여 하기와 같이 TMA 분석을 위한 동물실험 및 GC/MS 분석법 실험을 수행하였다. 구체적으로， SD rat 를 1 주일간 사육장에 적응시킨 후에 4 group (n = 3)으로 나누어 식염수 (Control)， 상황버섯 (PBG), 효모 (Zymosan, Sigma-Aldr ich Co. ,

10 USA), 보리 (Barley, Sigma-Aldr ich Co. , USA)의 베타-글루칸을 25 mg/kg 의 농도로 하루 1 회， 총 7 일간 경구 투여하면서 매일 소변을 채춰하였파. 채취한 소변에 3 차 증류수를 더해 최종부피가 15 ml 가 되게하여 하루 배출한 TMA 의 양을 동일하게 측정할 수：었도록 하¾다. 7일째의 소변 sample 증 2 ml을 SPME (Solid Phase Micro Extraction) 분석용 via ^' l 에 넣고 마개를 닫은 뒤 SPME fiber 를

15 마개에 꽃아 80 ^° C, 10 분간 extraction 을 진행하였다. Extraction 이후 물질이 톱착된 fiber 를 이용 GC/MS (gas chr omat ogr aphy / mas s spectrometer)를 진행하였다. SPME： fiber 는 7.5 ,≠ C /PDMS '를 사용하였고 GC/MS 조건은 컬럼 DB_ 5MS, 컬럼온도 40 ^° C에서 2분 어후 2 c/ i.n쩍 올려 320°C까지 되게 하였고 주입구 온도는 250 ^° C로 하였：다. 캐려어 가스는 Me 을 1 ml min 으로 이용하였다.

20 Standard curve를 농도를 달리하면서 측정하여 농도에 따른 area를 구해 standard curve 를 그린 후 공식을 구하여 sample 에 대해 GC/MS 를 수행하여 TMA의 농도를 구하였다. SD rat 를 4 group (n = 3)으로 나누어 식염수 (Control )， 상황버섯 (PBG), 효모 (Zymosan), 보리 (Bar ley)의 베타-글루칸을 25 mg/kg 의 농도로 하루 1 회， 총 7 일간 경구 투여하면서 매일 소변을 채취하였다. 베타-글루칸을 l 투여한지 7일째의 소변중의 TMMtrimethylamine) 농도를 GC/MS로 분석하였다.

그 결과， 도 9 에 나타낸 바와 같이 소변중의 TMA 를 분석한 결과 Control group 의 7 일째 소변중의 TMA( g/day)는 846.3 土 118.6 이었으며， PBG 투여 group은 619.0 土 51.3 (대조군의 73.1 ), zymosan 투여 group은 396.2 土 280.4 (대조군의 46.8%) 그리고 barley 투여 group 은 717.3 土 Γ72.8 (대조군의

!0 84.8%)이었다 (도 9). 따라서 PBG, zymosan 그리 Jl barley 의 베타글루칸을 경구 투여하였을 경우에 소변중의 TMA 가 감소한 비율을 보면 control group 에 비하여 26.9% , 53.2% , 그리고 15.2%가 감소하였다. 즉， zymosan 과 PBG 에 의하여 강력하게 악취성분이 감소하였다. 이러한 악취성분의 감소효과는 발현된 FM03 의 양과도 일치하였다. 즉， FM03 의 발현이 가장 강하게 발현된 zymosan 과 PBG 의 투여에 의하여 악취성분도 강하게 감소하였다. 또한 베타-글루칸에 의한 소변 내 악취 물질인 TMA 의 감소는 상황버섯에 국한된 것이 아니라 효모와 보리 유래의 베타-글루칸에서도 가능함이 확인되었다.

따라서 천연에 존재하는 모든 베타글루칸에 의하여 소변중의 악취성분의 감소는 가능함을 보여주고 있다.

【표 7】 SPME-GC/MS 분석 조건

<제조예 1>건강기능성식품의 제조

<ι-ι>상황버섯 추출물 함유건강기능성식품

상황버섯 추출물: 0. 1 ~ 10% 중량부，

지방분해효소 (Lipase) : 0.001 ~ 0.01% 중량부

제 3 인산칼슘: 1 ~ 20% 중량부，

비타민 E : 0.01 ~ 0. 1%중량부，

효소 분말: 1 ~ 10% 중량부，

유산균: 0. 1 ~ 10% 중량부, 바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10%중량부ᅳ 및

포도당: 20 ~ 90%중량부.

<1-2>효모추출물 함유 건강기능성식품

효모 추출물: 0.1 ~ 10%중량부，

지방분해효소 (Lipase) : 0.001 ~ 0.01%중량부，

제 3 인산칼슘: 1 ~ 20%중량부，

비타민 E: 0.01 ~ 0.1%중량부，

효소 분말: 1 ~ 10%중량부，

유산균: 0.1 ~ 10%중량부，

바실러스 CBadlkis) 배양액 ^' : 0:01 ~ 1:0%중 ^' 량부， 몇

포도당: 2Q ~ .90%증량부..

<1-3>보리추출물 함유건강기능성식품

보리 추출물: 0.1 ~ 10%중량부,

지방분해효소 ( ^; L ipase')： 0.001 ~ 0. &1%중량부，

제 3 인산 ¾슴: 1 - 20%증량부，

비타민 E: ~ 중 ¹ 량부，

효소 분말: 1 ~ 10%층량부，

유산균: 0.1 ~ 10%중량부，

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 - 10%중량부， 및

포도당: 20 ~ 90%중량부.

<제조예 2>천연물의약품의 제조

<2-1>산제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 2 g

유당 1 g

상기의 성분을혼합한후， 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다. <2"2>정제의 제조

실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 베타글루칸 100 nig

옥수수전분 100 nig

유 당 100 nig

5 스테아린산 마그네슘 2 nig

상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 를 제조하였다.

<2-3> 캡술제의 제조

10 실시예 1의 상황버섯 추출물 또는 쎄타글루칸 100 nig

옥수수전분 100 mg

유 당 100 nig

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐 15 에 충전하여 캡슐제를 제조하 ^' 였다.

<2-4>주사액제의 쩨조

실시예 1의 ¾ ^μ 황뻐섯 추출물 또는쎄타글루칸 is _m

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

Z0 주사용 염화나트륨 BP 최대

<제조예 3>사료 첨가제의 제조

<3-1>상황버섯 추출물을 함유하는사료 첨가제의 제조

본 발명자들을 상황버섯 추출물을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로 B5 사료첨가제를 제조하였다. 상황버섯 추출물: 0. 1 ~ 10% 중량부，

지방분해효소 (Lipase) : 0.001 ~ 0.01% 중량부,

제 3 인산칼슘: 1 ~ 20% 중량부， 비타민 E: 0.01 ~ 0.1%중량부，

효소 분말: 1 ~ 10%중량부，

유산균: 0.1 ~ 10%중량부，

바실러스 (Bacillus) 배양액: 0.01 ~ 10%중량부， 및

포도당: 20 ~ 90%중량부.

<3-2>베타글루칸을함유하는사료 첨가제의 제조

본 발명자들을 베타글루칸을 유효성분으로 하여 하기와 같은 조성으로사료 첨가제를 제조하였다. 베타글루칸: 0.1 ~ 10%중량부，

지방분해효소 ( pase): Q.QQ'l 0.01¾중량부,

제 3 인산칼슘 : 1 ~ 20%중량부，

비타민 E: 0.01 ~ 0.1%중량부，

효소 분말: 1 ~ 10%중량부，

유산균: 0.1 - 10%중량부，

바실러스 (Baciltesi) 폐 ^< §액 : G..01 ~ 藝중량부.， 및

포도당: 20 ~ %중'량부 . <제조예 4>사료의 제조

<4-1>상황버섯 추출물을함유하는사료의 제조

본 발명자들은 하기의 성분을 흔합하고 통상의 사료 제조 방법에 따라서 제 조하였다.

실시예 1의 상황버섯 추출물 50 _g

버섯배지 200 g

소맥피 30 g

비트펄프 50 g

쌀주정박 220 g

옥수수후레이크 200 g 전지대두 40 g

전분박 100 g

콘싸일리지 200 g

옥수수속대 180 g

비지 400 g

라이그라스 323 g

지오라이트 14 g

타피오카 40 g

<4-2>베타글루칸을함유하는사료의 제조

본 '발명자들은 하기의 성분을 흔합하교 통 의 사료 제조방법에 따라서 제 조하였다. ,

실시예 1의 베타글투칸 50 g

버섯배지 200 g

： 소맥피 30 g

비트펄프 50 g

쌀주정박 220 _g

옥수수후레 ⁰ ίΐ크 200 ^, g

전지대두 40 _g

전분박 100 g

콘싸일리지 200 g ·

옥수수속대 180 g

비지 400 g

라이그라스 323 g

지오라이트 U g

타피오카 40 g