Campo da Invenção

[0001 ] A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de leite humano em pó liofilizado para preservação das imunoglobulinas e ao kit para reconstituição do material liofilizado de fácil fracionamento. A presente invenção encontra-se nos campos da farmacotécnica e tecnologia farmacêutica.

Fundamentos da Invenção

[0002] A amamentação é a melhor forma de nutrir os recém-nascidos até os 6 meses de idade, de acordo com as Organizações de Saúde. Entende-se como amamentação o ato de alimentar o bebê com leite materno diretamente no seio da mãe.

[0003] Durante o período de lactação, período em que há produção de leite materno por ação hormonal, o leite humano é a primeira opção de alimento para recém-nascidos devido ao perfil nutricional e características biológicas do leite. Sendo este o alimento mais importante e natural, classificado biologicamente como padrão ouro na alimentação de recém-nascidos, principalmente para prematuros (bebês que nascem antes das 37 semanas de gestação) e prematuros extremos (bebês que vieram ao mundo antes das 28 semanas de gestação e correm mais risco de vida do que os bebês que nascem algumas semanas depois, por apresentarem um estado de saúde muito frágil).

[0004] O leite humano é a secreção láctica produzida pela nutriz, em que a nutriz é a mulher com produção láctica (leite). Este leite pode ter diferentes classificações de acordo com o período de lactação. O primeiro produto da secreção láctica, obtido em média até 7 dias após o parto, é chamado colostro e tem o papel principal de proteção do recém-nascido e, por este motivo, também é conhecido como a primeira vacina. O leite de transição é o produto intermediário da secreção láctica da nutriz, entre o colostro e o leite maduro, obtido em média entre o 7 ² e 15 ² dia após o parto. Por fim, o leite maduro é o produto da secreção láctica da nutriz, livre do colostro, obtido em média a partir do 15 ² dia após o parto.

[0005] A amamentação possui efeitos positivos gerais para saúde, crescimento e desenvolvimento dos bebês, podendo ser muitas vezes utilizado como tratamento para bebês que necessitam de aporte nutricional.

[0006] Cada vez mais é evidenciado que a composição única do leite humano não pode ser recriada ou substituída por outros tipos de leite, como o de vaca ou de outros animais, tampouco por leites artificiais.

[0007] Componentes nutricionais, bioativos e fatores imunológicos provenientes do leite proporcionam a defesa adequada contra infecções. Esta defesa é modulada pelas respostas imunológicas e microbiota intestinal. Os recém-nascidos possuem um sistema imunológico imaturo e necessitam do auxílio da mãe, através da amamentação, para se proteger contra infecções. Logo, a alimentação de bebês com outros tipos de leite não-humanos, impossibilita a transmissão de imunidade passiva.

[0008] A imunidade passiva consiste na transferência de imunidade humoral de anticorpos prontos e ativos, que ocorre naturalmente pela placenta e pelo leite humano para o bebê.

[0009] Dentre as imunoglobulinas (lg) presentes no leite humano, a que se encontra em maior quantidade é a imunoglobulina IgA. Esta desempenha um papel crucial na defesa do bebê, estando presente nas superfícies mucosas contra a entrada de bactérias patogênicas e enterovirus.

[0010] Quando não é possível a amamentação, a substituição do leite materno por leite humano, obtido por doação, é a melhor alternativa. Entende-se como leite humano obtido por doação, o leite humano ordenhado que seria o leite obtido por meio do procedimento de ordenha.

[0011 ] O leite humano é bem tolerado quando comparado a administração de fórmulas industrializadas. [0012] A dieta composta por leite de origem humana reduz dramaticamente a incidência de enterocolites necrosantes, intolerâncias e pode reduzir o tempo de internação hospitalar, além de ter maior qualidade nutricional.

[0013] O leite humano ordenhado destinado ao consumo de recém-nascidos, particularmente os internados em Unidades de Terapia Intensiva (UTIs), não deve apresentar microrganismos em quantidade ou qualidade capazes de representar agravos à saúde. Dessa forma, é preciso que se disponha de procedimentos capazes de assegurar a qualidade sanitária do leite.

[0014] A pasteurização representa uma alternativa eficaz, há muito tempo conhecida e praticada no campo da tecnologia de alimentos. A pasteurização é o tratamento térmico pelo qual o leite humano ordenhado deve ser submetido para inativar a sua microbiota.

[0015] Como procedimento padrão, a Rede Global de Bancos de Leite Humano recomenda que o leite humano ordenhado cru coletado e aprovado pelo controle de qualidade deve ser pasteurizado a 62,5 °C por 30 minutos após o tempo de pré-aquecimento. A pasteurização não visa à esterilização do leite, mas sim a garantia da inativação de 100% dos microrganismos patogênicos potencialmente presentes, quer por contaminação primária ou secundária, além de 99,99% da microbiota saprófita ou normal.

[0016] O congelamento é o método mais comum de preservação do leite humano durante o armazenamento, entretanto, os componentes nutricionais e imunológicos são perdidos ao longo do tempo nesta etapa de armazenamento.

[0017] Frente a este cenário, a liofilização mostra-se promissora como método de preservação, melhorando os processos em Bancos de Leite. Entende-se como liofilização o processo de remoção de água por sublimação e dessorção.

[0018] O processo de liofilização é amplamente conhecido e difundido ao redor do mundo. Tendo como objetivo a remoção de água de um material para estender a estabilidade, uma vez que as degradações químicas podem ser causadas por hidrólise ou serem catalisadas na presença de água. Logo, com a umidade reduzida, é possível fazer com que a velocidade dessas reações de degradação seja mais lenta.

[0019] A liofilização é composta por múltiplas etapas, em que cada etapa é crítica e deve ser bem controlada para o sucesso do processo. Portanto, o cenário deve ser bem conhecido e as etapas estritamente controladas para obtenção de resultados satisfatórios.

[0020] As vantagens deste processo encontram-se na rápida estabilização do material, estabilidade de longo prazo, que resulta em um material poroso e de fácil reconstituição e é um processo que mantém as características essenciais e originais do material.

[0021 ] A liofilização consiste no processo de congelamento de um material para formação de um sólido, seguido das etapas de secagem, que possuem o objetivo de remover a água ou solvente congelado do material por meio da sublimação e a água ligada pelo processo de dessorção, sem que ele retorne ao seu estado inicial, líquido.

[0022] Esta técnica pode aumentar o tempo de armazenamento do leite humano e minimizar as perdas de nutrientes, incluindo proteínas e triglicerídeos, conteúdo imunológico e integridade de antioxidantes ao longo do tempo de armazenamento e transporte. Além da estabilidade de alguns nutrientes (vitaminas, ácidos graxos e antioxidantes, por exemplo) ser maior quando o leite é liofilizado quando comparado ao simples congelamento.

[0023] O grande desafio existente no estado da técnica é desenvolver um processo de obtenção de leite humano em pó com valores de retenção de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG superiores a 84%.

Breve Descrição das Figuras

[0024] A Figura 1 mostra o comparativo da concentração de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG em mg/mL (eixo à esquerda) para amostras submetidas a diferentes ciclos de liofilização e porcentagem de retenção de imunoglobulinas (eixo à direita) comparada à amostra-controle.

[0025] A Figura 2 mostra o comparativo da concentração de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG em mg/mL para amostras submetidas a diferentes métodos de congelamento: P1 UF = ultrafreezer, P1 N = nitrogênio líquido e P1 F = freezer.

[0026] A Figura 3 mostra o comparativo da concentração das imunoglobulinas totais lg (IgA + IgM + IgG) em mg/mL para amostras submetidas a diferentes métodos de congelamento: P1 UF = ultrafreezer, P1 N = nitrogênio líquido e P1 F = freezer.

[0027] A Figura 4 mostra a quantidade de proteína total de amostras submetidas a um único ciclo de liofilização, utilizando diferentes métodos de congelamento: P1 UF = ultrafreezer, P1 N = nitrogênio líquido e P1 F = freezer, em que P1 = controle.

[0028] A Figura 5 mostra o comparativo da concentração de IgA, IgM e IgG em mg/mL e porcentagem de retenção para amostras de leite congelado e de leite liofilizado.

[0029] A Figura 6 mostra o gráfico do processo de liofilização conforme parâmetros definidos na invenção.

[0030] A Figura 7 mostra os valores de tempo de reconstituição encontrado para amostra de leite colostro e maduro liofilizados, os valores de pH encontrados para amostra de leite congelado colostro e maduro e dos mesmos leites após o processo de liofilizados e os valores de umidade encontrado para amostra de leite colostro e maduro liofilizados.

[0031 ] A Figura 8 mostra os resultados encontrados na contagem microbiana e presença de Bactérias Gram-negativas Bile Tolerantes para a amostra de leite maduro antes e após a liofilização.

[0032] A Figura 9 mostra um kit de leite humano liofilizado composto por sachê de alumínio com fundo parábola, frasco com tampa de 30mL de água potável, seringas de 10mL e adaptador e cartucho para acondicionamento dos componentes. Sumário da Invenção

[0033] A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de leite humano em pó liofilizado para preservação das imunoglobulinas e ao kit para reconstituição do material liofilizado de fácil fracionamento, assim como seu uso. O dito processo possui como vantagem um grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgG e IgM do leite humano maior ou igual a 84% em relação ao leite humano congelado.

[0034] A presente invenção apresenta como conceitos inventivos os objetos a seguir.

[0035] A presente invenção apresenta como primeiro objeto o processo de obtenção de leite humano em pó para preservação das imunoglobulinas compreendendo as etapas de fracionamento do leite humano, congelamento, secagem e selagem.

[0036] A presente invenção apresenta como segundo objeto o leite humano em pó, obtido pelo processo definido no primeiro objeto e em suas modalidades, compreendendo um grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgG e IgM maior ou igual a 84% com relação ao leite humano congelado.

[0037] A presente invenção apresenta como terceiro objeto um kit compreendendo um sachê de alumínio com fundo parábola contendo leite humano em pó liofilizado conforme definido no segundo objeto e obtido a partir do processo definido no primeiro objeto e em suas modalidades, um frasco com tampa contendo água potável, um adaptador de seringa, um conjunto de seringas descartáveis e um cartucho para acondicionamento de todos os materiais.

[0038] A presente invenção apresenta como quarto objeto o uso do kit compreendendo as etapas de abertura do kit e disposição dos componentes para uso, pré-aquecimento do frasco contendo água potável em banho maria a 40 °C, transferência de todo o conteúdo do sachê para o frasco de água pré-aquecida, fechamento do frasco e homogeneização até completa reconstituição do leite humano em pó liofilizado, verificação se todo o conteúdo foi solubilizado, abertura do frasco e posicionamento do adaptador de seringas e fracionamento do leite em seringas conforme o volume necessário para administração individual para uso imediato do leite reconstituído e fracionado, conforme descrito no terceiro objeto e em suas concretizações.

[0039] A presente invenção apresenta como quinto objeto o uso do leite humano em pó para a produção de leite humano reconstituído e um kit contendo leite humano em pó, útil para a fabricação de uma fórmula alimentícia que protege contra infecções diarreias e alergias e promove crescimento saudável, ganho de peso e possível redução de tempo de internação de bebês prematuros.

Definição

[0040] Na presente invenção, o termo “grau de retenção de imunoglobulinas” ou “porcentagem de retenção de imunoglobulinas” refere-se à porcentagem relativa do teor de imunoglobulinas viáveis após um determinado processo, considerando o teor inicial. Na presente invenção, o grau de retenção de imunoglobulinas é calculado considerando: (i) a liofilização como processo; (ii) o teor inicial de imunoglobulinas antes da liofilização, ou seja, o teor de imunoglobulinas no leite humano congelado; e (iii) o teor final de imunoglobulinas após a liofilização, ou seja, o teor de imunoglobulinas no leite humano em pó.

Descrição Detalhada da Invenção

[0041 ] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de leite humano em pó liofilizado para preservação das imunoglobulinas e ao kit para reconstituição do material liofilizado de fácil fracionamento. O dito processo foi desenvolvido de forma inesperada e surpreendente, já que não existe no estado da técnica um processo com a vantagem de ter um grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgG e IgM do leite humano maior ou igual a 84% em relação ao leite humano congelado. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ainda ao kit de reconstituição do leite humano liofilizado de fácil fracionamento para administração de até 6 doses.

[0042] Inicialmente, foram mapeados os componentes do leite e, por ser um material biológico complexo, o foco principal da invenção foram os elementos imunológicos. Deste modo, alguns componentes foram selecionados como marcadores de qualidade e acompanhados durante o processo de desenvolvimento de liofilização do leite, capaz de preservar significativamente as imunoglobulinas.

[0043] Os principais desafios para o mapeamento e preservação significativa das imunoglobulinas são: a determinação dos melhores parâmetros a serem utilizados no congelamento e no processo de liofilização do leite humano, capazes de preservar significativamente as imunoglobulinas, o desenvolvimento de um método capaz de quantificar com exatidão aceitável as imunoglobulinas do leite e a escolha correta do material de embalagem para acondicionamento adequado do leite liofilizado.

[0044] Foram descritos diferentes métodos de congelamento e parâmetros de liofilização para obtenção do leite humano liofilizado, sendo que o processo preferencial de congelamento é o ultracongelamento e liofilização com pressão de vácuo abaixo de 200pbar.

[0045] Para realizar o processo proposto na invenção, pode ou não ser necessária a etapa de degelo do leite pasteurizado, dependendo do estado do material a ser fracionado.

[0046] O degelo do leite humano congelado visa transferir calor ao leite humano ordenhado congelado, em quantidade suficiente para mudança da fase sólida para a líquida, não permitindo que a temperatura final do produto exceda 5 °C. O tempo de degelo do leite humano varia de acordo com o volume, tipo de embalagem e equipamento utilizado no processo.

[0047] A etapa de degelo deve ser realizada à 40 °C em banho-maria com nível da água acima do nível do leite para possibilitar a penetração adequada do calor. Não se deve realizar o degelo em temperatura ambiente, pois, nesta condição, a superfície do leite se descongela mais rápido que seu interior, podendo atingir temperaturas que permitam a multiplicação de microrganismos. O degelo deve ocorrer com o recipiente em que o leite congelado está armazenado completamente fechado.

[0048] Durante o degelo é recomendada a homogeneização do leite com movimentos circulares dos recipientes, preferivelmente a cada 5 minutos, para garantir a distribuição de temperatura dele. Quando o leite estiver em sua forma líquida, acondicionar os recipientes em banho de gelo e direcioná-los a próxima etapa do processo.

[0049] O fracionamento do leite humano, proveniente de qualquer nutriz e em qualquer fase da lactação, deve ocorrer em ambiente controlado para evitar possíveis contaminações. O fracionamento deve ser realizado em ambiente limpo com procedimentos padrões de limpeza, desinfecção e esterilização de equipamentos, artigos, materiais e superfícies bem determinados, podendo ser realizado em ambiente com controle microbiológico, e/ou preferivelmente sob fluxo laminar.

[0050] A etapa de fracionamento deve ocorrer com o leite previamente pasteurizado, podendo ser realizado com auxílio de uma pipeta graduada, volumétrica, automática, balança ou outros instrumentos de medição para padronização e precisão do volume de envase.

[0051 ] O fracionamento do leite humano pode ocorrer em sachês, frascos reagentes, frasco ampola, seringas, alvéolos de alumínio, bandejas ou outros suportes para contenção do produto nas prateleiras do liofilizador. Na presente invenção, o leite humano é fracionado em sachês, sendo este preferencialmente de alumínio e especificamente em sachês de alumínio com fundo parábola.

[0052] Os sachês de alumínio são compostos por polipropileno, polietileno e demais aditivos, isento de Bisfenol A, também conhecido como BPA. O BPA pode contaminar alimentos, podendo trazer alguns riscos para a saúde, como alterações hormonais e até malformação no embrião, no caso de grávidas. Os estudos acerca deste componente e seus riscos ainda são discutidos. Por precaução, alguns países, inclusive o Brasil, optaram por proibir a importação e fabricação de mamadeiras que contenham Bisfenol A, considerando a maior exposição e susceptibilidade dos indivíduos usuários deste produto. Por este motivo as embalagens para processamento e armazenamento do leite humano liofilizado devem ser isentas deste componente.

[0053] O sachê de alumínio mantém o cheiro, sabor e coloração original do material, sendo também uma importante barreira de proteção contra oxidação, umidade e luz. Este material é quimicamente inerte e estável, sendo resistente a temperaturas baixas e altas, ou seja, o material apresenta bom desempenho e, por exemplo, não se torna quebradiço em baixas temperaturas.

[0054] Os sachês de alumínio são de fácil transporte se comparados a outras embalagens devido ao seu formato, tamanho e peso. Além disso, no processo de liofilização, durante as secagens, a maior parte da água do material é removida, reduzindo ainda mais o peso final do material embalado, no caso da presente invenção, o leite humano em pó liofilizado.

[0055] O sachê proposto deve ser utilizado na versão dose única, no que diz respeito ao uso de todo o seu conteúdo quando aberto. Logo, após aberto, o produto não pode ser armazenado.

[0056] A embalagem proposta evita sobras de produto nos cantos e o volume de envase determinado é ideal para o consumo de todo o conteúdo, evitando desperdícios.

[0057] O sachê de alumínio utilizado para o processo de liofilização do leite humano possui fundo arredondado ou parábola, que evita a perda de produto quando comparado a fundos retos com cantos, em que pode ocorrer acúmulo de produto nas pontas inferiores, especificamente na junção da parede com o fundo do sachê, formando um ângulo de 90°, de difícil acesso e remoção de conteúdo residual. Desta forma, todo o material envasado é consumido pelo receptor final sem que haja perdas na embalagem ou desperdícios. Além disso, a embalagem pode ser enxaguada com água potável presente no kit da presente invenção para garantia do uso de todo o conteúdo da embalagem. [0058] Conforme exposto anteriormente, o leite deve ser mantido resfriado durante todo o processo de fracionamento do lote. O volume a ser fracionado deve corresponder a volumes compatíveis a dose única, que garantam que todo o conteúdo seja utilizado. Este volume pode variar de 5 a 30ml_. Para volumes maiores que 5ml_, considera-se o fracionamento do leite após reconstituição em seringas individuais contendo o volume necessário a ser administrado para o bebê.

[0059] Na etapa de fracionamento, os sachês de alumínio são envasados com o volume desejado e posicionados verticalmente em recipientes/suportes que permitem manter os sachês na posição vertical e sem riscos de vazamento. Os sachês de alumínio permanecem completamente abertos nesta etapa.

[0060] Após o envase e posicionamento dos sachês nos recipientes/suportes, ditos sachês são protegidos por uma membrana plástica para evitar entrada de umidade e proteger seu conteúdo. A etapa de congelamento deve ocorrer em baixas temperaturas, inferiores a -30 °C, preferencialmente entre -80 °C a -30 °C. O tempo de congelamento pode variar de acordo com o volume que se pretende congelar, material e formato da embalagem utilizada, quantidade de amostras dentro do recipiente/suporte e temperatura utilizada durante o processo.

[0061 ] O tempo de congelamento pode variar de 30 minutos a 5 horas de acordo com o volume de envase de 5 - 30ml_, considerando o set point de temperatura do equipamento de -70 °C.

[0062] Sob aspecto do material congelado, baixas temperaturas resultam na diminuição da atividade aquosa, pois 80% da água livre do produto é transformada em gelo. Logo, as reações bioquímicas e atividades enzimáticas no produto, assim como ação de microrganismos, são retardadas ou até inibidas.

[0063] Após a etapa de congelamento, os sachês são posicionados horizontalmente nas prateleiras previamente resfriadas do liofilizador, podendo ou não estar alinhados ou sobrepostos, desde que a parte superior do sachê permaneça aberta e desobstruída para sublimação e dessorção do gelo. Se desejável, os sachês podem ser posicionados verticalmente para maximizar a capacidade do liofilizador, porém o tempo de platô de secagem será estendido, devido à menor área superficial disponível para troca de calor por condução e/ou troca por contato direto com a prateleira.

[0064] Ao término do ciclo de secagem, os sachês são analisados quanto à umidade residual do leite liofilizado e, se aprovados, são selados para fechamento hermético da embalagem para evitar ganho de umidade pelo leite liofilizado. Preferivelmente, a selagem pode ser realizada à vácuo para remoção do oxigênio da embalagem e inibição de processos de oxidação.

[0065] Adicionalmente, foi desenvolvido um kit compreendendo um exemplar dos ditos sachês de alumínio com fundo parábola contendo leite humano em pó liofilizado, um frasco com tampa contendo água potável, um adaptador de seringa, um conjunto de seringas descartáveis e um cartucho para acondicionamento de todos os materiais, a fim de facilitar a administração do leite humano reconstituído.

[0066] O mencionado kit contém todos os materiais necessários para preparo e administração do leite humano liofilizado, sendo o modo de preparo do leite humano liofilizado caracterizado pela abertura do kit de leite humano liofilizado, deixando todos os componentes do kit disponíveis para uso. A seguir, é necessário que seja realizada a lavagem das mãos e higienização do local onde o leite será preparado, para evitar possíveis contaminações externas. A água potável que acompanha o kit deve ser previamente aquecida em banho maria à 40 °C com o frasco fechado. O aquecimento da água deve ocorrer em sua embalagem original, frasco de vidro com tampa. Com a água aquecida, pode-se realizar a abertura do sachê de alumínio contendo o leite liofilizado e verter todo o conteúdo do sachê dentro do frasco contendo a água potável previamente aquecida. Após despejar todo o conteúdo do sachê, pode-se ainda enxaguar a embalagem com a própria água enviada no kit para aproveitamento completo do conteúdo. Deve-se fechar o frasco completamente e homogeneizar cuidadosamente até completa solubilização do leite. O leite humano liofilizado de acordo com a invenção é de rápida reconstituição e em menos de um minuto é possível realizar a verificação visual para certificar-se de que todo o conteúdo do leite foi solubilizado. Com o leite já preparado, abrir o frasco e posicionar o adaptador de seringas para o fracionamento do leite em porções individuais, conforme a necessidade. Após abertura do sachê e preparo do leite, este deve ser utilizado imediatamente.

[0067] Frente ao exposto, de forma inesperada e surpreendente, a presente invenção revela a otimização de condições experimentais de congelamento e secagem a fim de desenvolver um processo de obtenção de leite humano em pó para preservação das imunoglobulinas, com a vantagem de possuir um grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG do leite humano liofilizado maior ou igual a 84% em relação ao leite humano congelado. Neste contexto, a presente invenção é definida pelos seguintes objetos e suas concretizações.

[0068] Em um primeiro objeto, o processo de obtenção de leite humano em pó para preservação das imunoglobulinas compreende as etapas de:

(a) fracionamento do leite humano;

(b) congelamento;

(c) secagem; e

(d) selagem, em que o grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG do leite humano liofilizado é maior ou igual a 84% em relação ao leite humano congelado.

[0069] De acordo com uma concretização da presente invenção, a etapa (a) de fracionamento compreende aliquotar o leite humano e envasar em sachês. [0070] De acordo com uma concretização da presente invenção, os ditos sachês são de alumínio e isentos de Bisfenol A.

[0071 ] De acordo com uma concretização da presente invenção, os ditos sachês possuem o fundo parábola. Este fundo evita perdas de conteúdo acumulado nos cantos na embalagem.

[0072] De acordo com uma concretização da presente invenção, a etapa (b) de congelamento do leite humano ocorre em uma faixa de temperatura de -80 °C a -30 °C, em um intervalo de 30 minutos a 5 horas.

[0073] De acordo com uma concretização da presente invenção, que a etapa (b) de congelamento compreende:

(i) posicionar os sachês de alumínio contendo leite humano verticalmente no equipamento de congelamento, com ou sem auxílio de recipientes e suportes de apoio;

(ii) proteger com uma membrana plástica a parte superior dos sachês abertos.

[0074] De acordo com uma concretização da presente invenção, a etapa (c) de secagem ocorre em um liofilizador, em que os sachês abertos contendo leite congelado são posicionados nas prateleiras do dito liofilizador em posição horizontal ou vertical, de forma enfileirada ou sobreposta; a secagem primária ocorre a 20 °C e 150pbar; e a secagem secundária ocorre a 35 °C e 150pbar; e, em que a umidade residual do leite humano em pó liofilizado é menor ou igual a 5,0%.

[0075] De acordo com uma concretização da presente invenção, na etapa (d) o tempo de solda da dita selagem dos sachês de alumínio é de 2 a 8 segundos, com potência de solda de 1 - 5; e em que a dita solda é preferencialmente à vácuo.

[0076] Em um segundo objeto, o leite humano em pó, obtido pelo processo definido no primeiro objeto e em suas concretizações, compreende um grau de retenção de imunoglobulinas IgA, IgG e IgM maior ou igual a 84% com relação ao leite humano congelado. [0077] Em um terceiro objeto, o kit contendo o leite humano em pó, conforme definido no primeiro objeto e em suas concretizações, compreende um sachê de alumínio com fundo parábola contendo leite humano em pó liofilizado, um frasco com tampa contendo água potável, um adaptador de seringa, um conjunto de seringas descartáveis e um cartucho para acondicionamento de todos os materiais.

[0078] Em um quarto objeto, o uso do kit, conforme definido no terceiro objeto, compreende as etapas de:

(a) abrir o kit e dispor os componentes para uso;

(b) pré-aquecer o frasco contendo água potável em banho maria a 40 °C;

(c) transferir o conteúdo do sachê para o frasco de água pré-aquecida;

(d) fechar o frasco e homogeneizar até completa reconstituição do leite humano em pó liofilizado;

(e) verificar se todo o conteúdo foi solubilizado;

(f) abrir o frasco e posicionar o adaptador de seringas;

(g) fracionar o leite em seringas com o volume necessário para administração individual e imediata do leite reconstituído e fracionado.

[0079] Em um quinto objeto, a presente invenção revela o uso do leite humano em pó, conforme definido no primeiro objeto e em suas concretizações, para a fabricação de uma fórmula alimentícia que protege contra infecções, diarreias e alergias e promove o crescimento saudável, ganho de peso e possível redução de tempo de internação de bebês prematuros.

Exemplos

[0080] Os exemplos a seguir servem para ilustrar aspectos da presente invenção sem possuir, porém, qualquer caráter limitativo.

EXEMPLO 1 - Processo de preparo e liofilização do leite humano.

[0081 ] O leite humano em pó liofilizado foi preparado de acordo com o procedimento descrito a seguir. [0082] Foram envasados 20ml_ de leite humano maduro fluído em frascos de vidro borossilicato transparente com rosca. Estes frascos foram alocados no Freezer do Refrigerador duplex (refrigerador/freezer) Sanyo modelo MPR-414F com faixa de trabalho de -30 à -20 °C por 5 horas.

[0083] As prateleiras do liofilizador foram preparadas para o carregamento do material a -15 °C e início do ciclo de liofilização.

[0084] A amostra controle, leite humano maduro congelado, ficou armazenada no freezer até a data da análise das amostras.

[0085] A sublimação e dessorção da água da amostra foi explorada utilizando diferentes parâmetros de secagem, reunidos na Tabela 1 .

[0086] O leite após liofilização foi reconstituído com água para injeção pré-aquecida a 40 °C, retomando a concentração inicial de sólidos na amostra, e analisado pelo método ELISA sanduíche para quantificação das imunoglobulinas.

[0087] Para a quantificação destas amostras realizou-se a análise de proteínas totais do leite, seguindo o protocolo da Pierce® BCA Protein assay Kit da empresa ThermoScientific, seguindo as instruções do fabricante.

[0088] As medidas foram tomadas no espectrofotômetro UV-VIS. A curva de calibração foi feita usando Albumina sérica bovina [2mg/mL] 95% de pureza, diluída no mesmo tampão da amostra, com leitura realizada a 570nm. Em placa de 96 poços é feito o deposito de 25pL de amostras depois misturado com 200pL da mistura dos reagentes A + B (1/50 partes) como descrito pelo fabricante. A placa é incubada a 37 °C por 30 minutos e, após incubação, é obtida a leitura das medidas de absorbância. Após quantificação das proteínas totais do leite, as amostras são submetidas a análise por ELISA sanduíche e os resultados obtidos são normalizados pela quantidade de proteína total, verificada previamente.

[0089] Para a realização do método ELISA sanduiche, os anticorpos anti-lgA, IgM, IgG foram diluídos em tampão fosfato (PBS) pH 7,5 nas diluições de 1 :5.000 (anti-lgA e anti-lgM), e 1 :1.000 (anti-lgG) em placas de 96 poços (NUNC Maxabsorb) e mantidas a 4 °C overnight para imobilização dos anticorpos de captura. Após incubação, foram lavadas e secadas a 34 °C em incubadora para uso posterior.

[0090] As amostras de leite humano em pó foram pesadas para 15 mg cada e diluídas em 1 ml de água ultrapura a 40 °C. Essas amostras foram usadas para dosagem de proteína e, após a dosagem, foi feita a diluição corretiva para o depósito de 1 ,5mg/ml_ por poço de proteína total (1 %) da massa pesada. Essas amostras após diluição foram incubadas com as amostras controles IgA, (500-50pg) IgG (25-0, 5pg) e IgM nas diluições 1 -100pg e incubadas por 30 minutos a 37 °C em estufa.

[0091 ] Após a incubação, a placa foi lavada por 5 vezes com PBS-T (0.5%) e novamente incubada com o anticorpo secundário na diluição 1 :10.000 anti-lgA, (1 :5000) IgG, (1 :5.000) IgM conjugado com peroxidase por 30 minutos. Após incubação, a placa foi novamente lavada com tampão de lavagem (PBS-T 0.5%) por 5 vezes e incubada com reagente colorimétrico de tetrametilbenzidina (TMB) por 5 - 15 min, em seguida a reação colorimétrica é parada com solução de parada (HCI 0,1 %). O resultado da reação foi lido em leitora de placa da marca TECAN Sunrise, usando filtro de 450nm e os dados exportados para serem calculados e plotados após triplicate da reação.

[0092] Os valores de imunoglobulinas (IgA, IgM e IgG) presentes no leite após os diferentes processos de liofilização estão descritos na Figura 1 , assim como o grau de retenção (%) das imunoglobulinas quando comparadas às quantidades iniciais presentes na amostra de leite humano congelado (controle).

[0093] Não foi possível analisar o leite fluido devido ao tempo necessário de transporte e análise, por tratar-se de um material extremamente sensível em condições ambientes e com tempo limitado em geladeira. Por este motivo, optou-se por utilizar o leite congelado como amostra controle.

[0094] O congelamento do leite é o método comumente utilizado nos Bancos de Leite para armazenamento e transporte das amostras. O leite humano que é administrado em UTIs passa pelo processo de congelamento em alguma etapa de seu ciclo, desde a doação até o momento da administração. Sendo a utilização do leite congelado como amostra controle, a condição mais próxima da realidade. [0095] Durante o processo de secagem, estão envolvidas no processo 3 (três) energias: radiação, condução e convecção. A radiação consiste na transferência de calor pela radiação das paredes e prateleiras do equipamento; a condução, na transferência de calor pelo contato direto da prateleira com o sachê e entre sachês, e, por fim, a convecção é a transferência de calor pela convecção das partículas presentes na câmara. Dentre as energias envolvidas nesta etapa, a convecção é a principal forma de transferência de calor. As partículas em constante movimento e colisão entre as referidas partículas e os sachês geram troca de calor. Sendo assim, é desejável uma pressão de vácuo razoável para que ocorra uma convecção adequada.

[0096] Durante os experimentos, verificou-se que a utilização de um vácuo maior tende a preservar mais as imunoglobulinas durante o processo de liofilização quando comparado a valores mais elevados.

[0097] Surpreendentemente, foi observado que, em algumas amostras, o leite humano liofilizado possui quantidade maior de imunoglobulinas quando comparado a amostra controle, leite humano congelado. Este fato pode ser decorrente do armazenamento da amostra controle em freezer, método comumente utilizado para preservação do leite. O congelamento padrão, a -20 °C, é ideal para armazenamento de curto prazo de amostras que não são estáveis em temperaturas mais altas. Neste congelamento, a velocidade de resfriamento é lenta quando comparado a equipamentos com temperaturas mais baixas, resultando em cristais de gelo maiores, que se formam ao longo do tempo de estocagem do material e que podem danificar os componentes do leite. Nestes casos a água externa se solidifica antes que o meio intersticial, pois é menos concentrada, corroborando para possíveis danos de alguns componentes do leite pela diferença de pressão de vapor. Vale lembrar que os equipamentos convencionais de congelamento podem possuir, também, a função de degelo automático para evitar o acúmulo de gelo no equipamento. Variações de temperatura também podem impactar nos componentes da amostra.

[0098] Quando o leite humano está liofilizado, a quantidade de água na amostra é reduzida, fazendo com que possíveis reações de degradação sejam minimizadas, assim como impactos relacionados ao tamanho e formato dos cristais de gelo resultantes do armazenamento prolongado da amostra congelada.

[0099] Uma vez que a IgG se encontra em baixa quantidade no leite humano, verificou-se que em alguns testes esta imunoglobulina apresentou-se abaixo do limite de quantificação do método, ou apresentou desvio padrão alto entre as análises, dificultando a análise comparativa de IgG em alguns casos. Porém, fica nítido o ganho obtido para preservação das imunoglobulinas IgA e IgM ao ser utilizada uma pressão de vácuo mais alta.

[0100] Vale ressaltar que diversos fatores influenciam na quantidade de imunoglobulina produzida no leite das lactantes, como alimentação, período da amamentação e fatores externos. Sendo assim, cada experimento foi realizado com o mesmo lote de leite.

[0101 ] Surpreendentemente, verificou-se que as temperaturas utilizadas no experimento não possuem impacto significativo na degradação das imunoglobulinas e que o vácuo utilizado no processo é o parâmetro mais importante para a preservação das imunoglobulinas no leite liofilizado.

EXEMPLO 2 - Processo de congelamento do leite humano por meio de diferentes métodos.

[0102] O leite humano pasteurizado descongelado foi envasado conforme procedimento descrito no Exemplo 1 .

[0103] O congelamento do leite foi realizado explorando diferentes métodos, todos reunidos na Tabela 2, como freezer (P1 F), ultrafreezer (P1 UF) e nitrogênio líquido (P1 N), conforme as condições a seguir.

Tabela 2. Métodos de congelamento de leite

[0104] Para o congelamento em freezer e ultrafreezer, foi realizado o monitoramento da taxa de resfriamento do leite nos diferentes equipamentos conforme dados reunidos na Tabela 3:

Tabela 3. Monitoramento da taxa de resfriamento do leite durante o congelamento em freezer e ultrafreezer

[0105] O leite congelado pelos métodos descritos foi submetido a um mesmo ciclo de liofilização, sob os parâmetros da Tabela 4 seguir:

Tabela 4. Parâmetros de liofilização do leite congelado

[0106] O leite humano em pó obtido após a liofilização foi reconstituído e analisado conforme o Exemplo 1 .

[0107] Os valores de imunoglobulinas IgA, IgM e IgG em mg/mL estão descritos na Figura 2. As imunoglobulinas (lg) foram quantificadas individualmente. Adicionalmente, foi realizada a somatória das mesmas para obtenção da quantidade de imunoglobulinas totais lg (IgA, IgM e IgG) nas amostras, apresentadas na Figura 3.

[0108] De acordo com as imunoglobulinas totais avaliadas, o método de congelamento utilizando ultrafreezer mostrou-se promissor tal qual o método utilizando nitrogênio líquido, uma vez que se deve considerar o desvio padrão obtidos durante as análises das amostras. Entretanto, avaliando as quantificações individuais, os resultados indicam que o método utilizando ultrafreezer é o que mais preserva as imunoglobulinas, principalmente a IgA, dentre os métodos testados.

[0109] No ultracongelamento, obtém-se altas taxas de resfriamento, resultando em cristais de gelo de tamanhos menores que não danificam a estrutura dos componentes. Além disso, a água externa e o meio intersticial solidificam ao mesmo tempo, reduzindo a diferença de pressão de vapor entre eles.

[01 10] Para corroborar com os resultados encontrados pelo método acima, utilizou-se a técnica de purificação de troca iônica. As amostras de leite de 0,5ml_ foram analisadas por cromatografia de troca iônica em uma coluna Q-Sepharose™ Aniônica, pré-equilibrada com um tampão A (20mM de fosfato de sódio monobásico com pH 6,3) e eluida em um tampão B (20mM de fosfato de sódio monobásico com pH 7,0, 1 M de cloreto de sódio). As frações correspondentes foram reunidas eluindo tampão A e eluindo tampão B. A proteína total do eluido foi quantificada através de método colorimétrico BCA assay e avaliada em SDS-PAGE gel, conforme a Figura 4.

[01 11 ] Também por esta técnica, dentre os métodos testados, os resultados indicam que o método utilizando ultrafreezer é o que mais preserva as proteínas totais do leite humano liofilizado.

[01 12] Outro ponto relevante para o processo de congelamento é a questão do congelamento e descongelamento da amostra. Durante os experimentos verificou-se que um único congelamento se apresenta mais efetivo quando comparado a amostras de leite que foram descongeladas e congeladas novamente mais de uma vez.

EXEMPLO 3 - Processo de preparo e acondicionamento das amostras.

[01 13] Após a definição do método de congelamento e dos parâmetros de liofilização, verificou-se a oportunidade de melhoria no preparo e acondicionamento das amostras.

[01 14] O leite fluido foi envasado em sachês de alumínio composto por polipropileno, polietileno e demais aditivos isento de Bisfenol A, também conhecido como BPA, com fundo parábola, para evitar resíduos de leite liofilizado nos cantos do sachê.

[01 15] Foram envasados 10mL de leite em cada sachê. Estes sachês foram submetidos ao processo de congelamento no ultrafreezer Sanyo modelo MDF-U33V com set point de temperatura de -70 °C por 1 hora e liofilizados nas prateleiras do liofilizador LyoStar3 da SP Scientific com temperatura de secagens de 20 °C e 35 °C e pressão de vácuo de 150pbar, conforme Processo 1 do Exemplo 1 e método de congelamento 2 (P1 UF) do Exemplo 2.

[01 16] A Figura 5 mostra o comparativo da concentração de IgA, IgM e IgG e porcentagem de retenção para amostras de leite congelado e de leite liofilizado. De acordo com os resultados apresentados nesta figura, pode-se dizer que o processo descrito na invenção é capaz de preservar as imunoglobulinas presentes no leite com taxas de retenção maiores que 84% e preferivelmente maiores que 90%.

[01 17] Neste experimento fica evidenciado que o processo de liofilização resulta em um produto mais próximo ao leite humano fluído quando comparado ao leite congelado.

[01 18] O melhor desempenho nas amostras liofilizadas, no que diz respeito à preservação das imunoglobulinas IgA, IgM e IgG, em comparação às amostras congeladas, pode ser devido ao fato de que durante o tempo de congelamento de materiais biológicos, sabe-se que os cristais de gelo possuem morfologias específicas que continuam crescendo ao longo do tempo e tendem a danificar materiais sensíveis, conforme exposto no Exemplo 1 .

[01 19] No processo proposto, empregando rápido congelamento em ultrafreezer com posterior remoção da água, esse evento é mitigado.

EXEMPLO 4 - Avaliação das características físico-químicas e microbiológicas do leite humano liofilizado.

[0120] Além da avaliação do conteúdo imunológico do leite humano liofilizado, também foram avaliados outros parâmetros de qualidade do leite humano em pó como pH, tempo de reconstituição, umidade, contagem microbiana e presença de Bactérias Gram-Negativas Bile Tolerantes ( Enterobacteriacea) .

[0121 ] Para as análises de tempo de reconstituição e pH, foram utilizadas as mesmas amostras.

[0122] A água utilizada para análise é ultrapurificada e foi previamente aquecida a 40 °C para reconstituição do leite humano liofilizado. Transferiu-se o conteúdo do sachê para um béquer e foram adicionados 20mL da água ultrapurificada previamente aquecida, de acordo com o volume de envase inicial. A contagem de tempo foi realizada com auxílio de um cronômetro, que foi iniciado logo após a adição de todo volume de água. A amostra foi agitada e a dispersão do pó observada. O cronômetro foi pausado apenas quando todo o pó se apresentou disperso na água e o tempo obtido foi registrado. Os valores encontrados estão presentes na Tabela 5.

Tabela 5. Resultados das análises de tempo de reconstituição, pH e umidade para amostra de leite colostro e maduro liofilizados

[0123] Com o leite já preparado para o teste de reconstituição, a amostra seguiu para análise de pH. O medidor de pH utilizado estava previamente calibrado com pelo menos duas soluções tampão. O sensor de pH foi enxaguado com água e, em seguida, com algumas porções do material a ser testado. O sensor de pH foi imerso no material a ser testado e os valores de pH e temperatura foram registrados. Para todas as medições de pH, aguardou-se tempo suficiente para a estabilização da temperatura e da medição do pH. Os resultados obtidos, tanto da amostra controle quanto da amostra de leite após a liofilização encontram-se na Tabela 5.

[0124] Para análise de umidade, utilizou-se balança de infravermelho (com fonte de lâmpada de halogênio) à temperatura de 95 °C por 10 minutos. Utilizou-se cerca de 1 g de amostra e a mesma foi distribuída uniformemente de forma a cobrir toda extensão da bandeja de alumínio da balança para iniciar a medição. Os resultados encontram-se na Tabela 5.

[0125] Para as análises microbiológicas, foram utilizados sachês que foram envasados com 30ml_ de leite humano pasteurizado congelado e submetidos ao processo da invenção. Para a contagem microbiana, o conteúdo do sachê (aproximadamente 3g) foi transferido para um frasco contendo 30ml_ de água estéril e o mesmo foi aquecido e homogeneizado até a completa solubilização da amostra com no máximo 40 °C. 10ml_ do leite reconstituído foram transferidos para um frasco contendo 90ml_ do diluente TA, fundido e mantido a 45-50T ( Tryptone Azolectin Tween Broth) e homogeneizado (diluição 1 :10). Realizou-se a contagem microbiana (bactérias) pelo método de contagem em placas, transferindo 1 ml_ da preparação 1 :10 para 02 placas de Petri. Foram adicionados de 15-20ml_ de meio Tryptic Soy Agar (TSA), fundido e mantido a 45-50 °C, em 02 placas de Petri. As placas foram homogeneizadas cuidadosamente com movimentos em forma de “8” e aguardou-se a solidificação dos meios. Para a contagem de micro-organismos aeróbicos totais, as placas de TSA (invertidas) foram incubadas em estufa, na temperatura de 30-35 °C por 3 a 5 dias. Realizou-se a leitura das placas, calculou-se a média aritmética e multiplicou-se pelo fator de diluição obtido. O valor obtido é o número de UFC por ml_ do produto.

[0126] Para a pesquisa de patógenos, seguiu-se conforme procedimento acima até o preparo da solução diluída. A mesma foi homogeneizada e incubada a 22,5 ± 2,5 °C por duas horas e não mais que cinco horas (tempo necessário para reativar a bactéria, mas não o suficiente para estimular a multiplicação do microrganismo). 1 ml_ da solução diluída (1 :10) foi transferida para o Caldo de enriquecimento para enterobactérias Mossel. O preparo foi incubado a 32,5 ± 2,5 °C por 24 a 48 horas. Após este período, preparou-se a subcultura em placas contendo Ágar violeta vermelho neutro glicose e a mesma foi incubada a 32,5 ± 2,5 °C durante 18 a 24 horas. A amostra cumpre o teste se não houver crescimento de colônias. Os resultados microbiológicos encontram-se na Tabela 6.

Tabela 6. Resultados da contagem microbiana e presença de Bactérias gram- negativas Bile tolerantes para a amostra de leite maduro antes e após a liofilização

[0127] Os resultados obtidos demonstram que é possível a obtenção do leite humano liofilizado com qualidade semelhante ao leite antes da liofilização. Assim como o processo proposto na invenção não gera contaminação microbiológica.

[0128] Para o preparo do leite humano liofilizado foi desenvolvido um kit de fácil manuseio para envio do material a longas distâncias e locais com escassez de água filtrada. Este kit é composto por sachê de alumínio com fundo parábola, que evita perdas nos cantos da embalagem, frasco de 50ml_ e tampa com água potável, conjunto de seringas de 10mL e adaptador, cartucho para acondicionamento e cartilha contendo o modo de preparo do leite, conforme pode ser visto na Figura 7.

[0129] Deve-se compreender que as realizações descritas acima são meramente ilustrativas e que qualquer modificação ao longo delas pode ocorrer para um técnico no assunto. Consequentemente, a presente invenção não deve ser considerada limitada às realizações descritas no presente relatório.