CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con la agroindustria, específicamente, se refiere a formulaciones de medios de cultivos específicos para producir hongos, particularmente hongos ectomicorrizicos, preferentemente para hongos comestibles tales como el de las especies del hongo silvestre Ramaria sp. (Changle), y a los métodos de cultivo, útiles como herramientas para la producción del hongo a mediana y a gran escala. Particularmente, la invención se refiere a una formulación, y a un método de cultivo para la producción de semillas de hongos ectomicorrizicos, preferentemente semillas del hongo comestible silvestre Ramaria sp. La presente invención, permite lograr el aislamiento y propagación de micelios in vitro de hongos de dicho género, y posterior producción de semillas del hongo, independiente de la estacionalidad, del hospedero y de las condiciones ambientales, logrando con ello una producción continua y estable durante un período de tiempo independiente de la estacionalidad.

En los últimos 20 años, la producción y comercialización de hongos comestibles en todo el mundo ha aumentado en un 400%, alcanzando alrededor de 3,41 millones de toneladas por año (Wakchaure, G. C. (201 1 ). Production and Marketing of Mushrooms: Global and National Scenario, 15-23), lo que se explica en que, durante las últimas décadas, dentro de la agroindustria se ha observado un aumento significativo en el interés comercial e industrial, impulsado principalmente por la búsqueda de alternativas alimentarias saludables, con propiedades nutñcionales y organolépticas destacadas. Según datos ODEPA, en el año 2019, el mercado tuvo un valor de USD 50.000 millones a nivel mundial y se estima que crecerá a una tasa anual compuesta de 9.54%, para llegar a un valor de USD 97.000 millones en 2024. Además, se estima que el consumo de hongos en Chile es aproximadamente de 300 gramos per cápita y 5.000 toneladas al año.

En el mundo se cultivan alrededor de 30 especies de hongos a nivel industrial, entre las que se encuentran Agáricos bisporus y Pleurotos sp. Por otra parte, entre las setas silvestres más consumidas se encuentran Boletos loyo y Ramaria sp., cuyas diferentes y beneficiosas propiedades nutñcionales y farmacológicas han dotado a estas especies de un valor añadido fundamental, que a lo largo de los años les ha permitido incrementar su valor comercial y hacerlas muy deseadas y demandadas por la población. En ese sentido, uno de los principales desafíos que enfrenta la industria en términos de la producción de los hongos comestibles, sobre todo de los silvestres, es justamente que en la mayoría de las ocasiones no se han logrado obtener las condiciones óptimas para poder establecer su cultivo controlado y escalar su producción. Ese desafío es aún mayor cuando estos hongos establecen asociaciones micorrícicas con diferentes especies, lo que hace aún más difícil establecer un sustrato con características ideales para su desarrollo como cultivo industrial sin la necesidad de utilizar un hospedero.

Las técnicas de cultivo convencionales y los sustratos conocidos se enfocan principalmente en hongos comestibles saprofitos. Sin embargo, los hongos saprofitos se diferencian enormemente de los hongos micorrícicos.

En condiciones naturales, los hongos saprofitos como Lentinula edodes o Agadcus bisporus, se nutren a partir de la materia orgánica en descomposición o inerte, lo que conlleva a una mayor producción de ácidos húmicos y materia orgánica, facilitando la absorción de nutrientes y por ende la propagación del micelio y producción de carpóforos de estos hongos saprofitos. En base a esta facilidad de asimilación de nutrientes desde sustratos inertes, es posible realizar de forma efectiva y de manera artificial la propagación de hongos saprofitos utilizando condiciones controladas de cultivo similares a las naturales (temperatura de aproximadamente 25°C y fotoperiodos de 12 horas) y sustratos que contengan lignina o celulosa en su composición, lo que permite la colonización y fructificación de los hongos bajo tiempos de incubación relativamente cortos (alrededor de un mes). En contraste, los hongos micorrícicos, para su propagación y fructificación, necesitan de una simbiosis directa con un hospedero específico, el cual entrega al hongo, entre otras cosas, porcentajes de carbono (alrededor del 20%) y micronutrientes que el hongo por sí solo no puede asimilar. Además, proporciona un microclima apto para la propagación del micelio en el suelo.

Uno de los géneros de hongos micorrícicos que han captado mayor interés a nivel mundial es Ramada sp. El género Ramada incluye especies de hongos basidiomicetos ectomicorrícicos que se caracterizan por tener cuerpos fructíferos con ramas en forma de coral, cuya consistencia varía según el estado de maduración del basidiocarpo, pudiendo ser carnoso-fibroso o gelatinoso. Por lo general se encuentran en ambientes húmedos, en suelos con material vegetal en descomposición y asociados con plantas hospederas, principalmente con Nothofagus (preferentemente con Nothofagus oblicua y Nothofagus dombeyi).

Ramada sp., se considera un hongo comestible silvestre de gran interés en la gastronomía internacional, así como también en medicina. Entre las características medicinales destacadas de estos hongos se encuentran sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas y antimicrobianas, habiéndose reportado que producen múltiples moléculas bioactivas, tales como compuestos polifenólicos, aminoácidos y ceramidas que actuarían como antimicrobianos frente a patógenos humanos (Sharma & Gautam, 2017; Yaoita et al., 2007). Por otra parte, desde la perspectiva de la gastronomía, su elevado contenido de fibra y proteína, le otorgan características organolépticas y nutricionales atractivas para su consumo, que fundamentan la necesidad de desarrollar su cultivo a una escala industrial/comercial.

Actualmente la producción y comercialización de los hongos Ramaria sp. depende únicamente de la recolección artesanal de las especies silvestres que aparecen en los bosques. En ese sentido, los recolectores se enfrentan a otro problema relacionado con que, morfológicamente, no es posible diferenciar entre las distintas especies del total recolectado, lo que hace imposible establecer parámetros distintivos en cuanto a sus propiedades funcionales como antioxidantes, toxicidad, valor nutricional, entre otros. Adicionalmente, la poca información sobre las especies, su sobre recolección y las malas prácticas de cosecha han provocado un gran daño a los recursos, mermando su producción y consecuentemente su comercialización.

Debido a su carácter de hongo micorrícico, Ramaria sp. presenta múltiples dificultades técnicas para su producción a gran escala. Entre estas dificultades se encuentran por ejemplo la necesidad de la asociación de estos hongos a determinadas plantas (principalmente Nothofagus sp.) y la dificultad de obtener micelios in vitro, lo que hace imposible la obtención de carpóforos a escala industrial, limitando su cosecha solo a temporadas especificas (que se extienden solo entre uno y dos meses al año), en sectores determinados de los bosques, y cuyo desarrollo depende ampliamente de las condiciones ambientales, dado que requieren alta humedad (lluvias) y condiciones particulares de temperatura y pH. Adicionalmente, otra de las dificultades a solucionar en lo asociado con el cultivo de Ramaria sp. en condiciones controladas que dificulta aún más la obtención de esporas y posterior producción de micelio es que, al inocular el hongo en medios de cultivo convencionales, la producción del micelio se ve inhibida por la proliferación de contaminaciones propias del carpóforo, el cual, al estar en contacto directo con el suelo, se contamina mayoñtañamente con otros microorganismos, tales como Tríchoderma sp.

Una especie de particular interés del género Ramaria es Ramaria flava, un hongo comestible silvestre que crece en asociación con hospederos específicos (Nothofagus oblicua o roble y Nothofagus dombeyi o coigüe). Debido a su carácter ectomicorrícico, para poder efectuar el desarrollo de micelios, su propagación y posterior producción de carpóforos, es necesario que se establezcan asociaciones entre el hongo y los hospederos mencionados anteriormente, lo que hace prácticamente imposible su propagación si no existe una planta trampa con la que las esporas o micelios del hongo puedan establecer asociaciones simbióticas para realizar intercambios de nutrientes. Esto condiciona al hongo a crecer y desarrollarse bajo factores nutricionales y ambientales específicos que solo se producen a partir de la simbiosis entre la planta y el hongo, lo cual genera un microclima ideal para el desarrollo del micelio y la producción de carpóforos, gracias a condiciones específicas de nutrientes, pH, temperatura, humedad, interacción con otros microorganismos, entre otros.

En vista de que la obtención de Ramada sp. actualmente se lleva a cabo por la cosecha posterior al crecimiento silvestre del hongo, el problema que enfrenta la agroindustria en lo relativo a la producción de este hongo es que, en base a todas las dificultades técnicas antes descritas, hasta el momento, no existen herramientas que permitan producir hongos de Ramada sp. en ambientes controlados, ni técnicas de propagación del hongo que permitan fortalecer y facilitar su propagación in vitro, de modo de aumentar y optimizar su producción, y en último término, hacer posible su comercialización en cualquier época del año.

Por lo tanto, es necesario crear formulaciones aptas para el desarrollo de estos hongos y métodos de crecimiento que permitan mitigar la creciente demanda de este hongo comestible. Para ello, es fundamental establecer condiciones de cultivo específicas que eviten los inconvenientes antes mencionados, sobre todo los relacionados con la necesidad de asociación de estos hongos ectomicorrícicos a determinadas plantas y con la dificultad de obtener micelios in vitro, que hace imposible la producción de carpóforos a escala industrial.

La presente invención soluciona el problema técnico antes descrito a través de formulaciones de medios de cultivo específicos que permiten el desarrollo y la propagación de micelios in vitro, y de un método que las utiliza para la producción de hongos comestibles ectomicorrícicos en condiciones controladas. Más particularmente, un método para la producción de semillas de dichos hongos el cual, bajo condiciones operacionales específicas, permite el aislamiento y propagación eficiente de micelios de dichos hongos in vitro, sin la utilización de un organismo hospedero simbionte, incrementando y optimizando de este modo la producción del hongo, extendiendo sus temporadas de cosecha en invernaderos y en último término facilitando la producción a escala industrial de dichos hongos. La presente invención logra sorprendentemente, imitar las condiciones naturales de crecimiento de hongos ectomicorrícicos y establecer condiciones óptimas de crecimiento in vitro para hongos del género Ramaria, que permiten producir, aislar y propagar micelios de dichos hongos bajo condiciones controladas y sin la necesidad de una planta hospedera, superando de esta manera la barrera que generaba la necesidad de estos hongos de establecer una relación de simbiosis con un hospedero para poder propagarse y, en última instancia, fructificar.

ESTADO DEL ARTE

Actualmente la agroindustria, en el rubro de los hongos comestibles, enfrenta un aumento de demanda al cual no ha podido responder totalmente, debido a las limitadas herramientas que permiten producir hongos comestibles en condiciones controladas, a la dificultad de conseguir una producción de manera constante, sin dependencia de la estacionalidad ni de las condiciones ambientales, y a la dificultad que añaden los requerimientos particulares de las distintas especies de hongos comestibles. En ese sentido, todas estas dificultades se agudizan cuando se desea abordar la problemática relacionada con los hongos comestibles ectomicorrícicos, cuya dependencia de asociación simbiótica con un hospedero, complejiza aún más el desarrollo de estos hongos en condiciones controladas.

A la fecha, el estado del arte se ha centrado principalmente en proporcionar soluciones para favorecer o facilitar la producción de hongos comestibles saprofitos. Sin embargo, la producción de micelios y hongos saprofitos presenta desafíos técnicos no comparables a la producción de micelios y hongos ectomicorrícicos. Por lo tanto, cualquier tecnología asociada a hongos saprofitos no solucionaría los mismos problemas técnicos y propondría soluciones que no serían aplicables para la producción de hongos ectomicorrícicos. Consecuentemente, un experto en la técnica enfrentado a la problemática de la producción de micelios y de semillas de hongos ectomicorrícicos no se vería motivado a consultar ningún documento asociado a hongos saprofitos, dado que entendería cabalmente que las necesidades de crecimiento, propagación e incluso la posterior generación de carpóforos son diametralmente distintas.

A nivel académico y en el caso de los hongos micorrícicos, se ha reportado la posibilidad de obtener hongos micorrícicos comestibles de forma silvestre, mediante la inoculación del micelio en bosques o por micorhzación de plantas, en vista de que el crecimiento de estos hongos está estrechamente relacionado con las especies forestales que crecen en el bosque (Jimenez Ruiz, M., et al.; 2013). Adicionalmente, se han publicado algunos requisitos básicos para el desarrollo de especies silvestres de hongos comestibles, como un alto nivel de nitrógeno sobre carbono (Agerer et al., 2012), sin embargo, cuando los hongos establecen asociaciones micorrícicas con diferentes especies, es difícil establecer un sustrato con características ideales para su desarrollo como cultivo doméstico, lo que dificulta cualquier cultivo de hongos micorrícicos en condiciones controladas.

No obstante, científicos de diversas instituciones han realizado investigaciones en búsqueda de medios y condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento de hongos ectomicorrícicos específicos.

En el artículo científico publicado en el año 2020 por Ángeles-Argáiz, et al. se realizó un muestreo de recursos genéticos y se estudiaron medios y parámetros de cultivo para producir micelios del hongo Lacearía tríchodermophora debido a la factibilidad que tiene esta especie para producir micelios en condiciones asimbióticas. Los investigadores encontraron que el mejor rendimiento del hongo Lacearía tríchodermophora se producía utilizando un medio de cultivo BAF en donde reducían la cantidad de la fuente de carbono (glucosa) de 30 mg a 10 mg, sin vahar los otros componentes, ni sus concentraciones, y cultivando a pH 5.5 y a 25°C. Este documento se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan adecuados para el género Ramada, ya que, a modo de ejemplo, los inventores de la presente invención encontraron que la disminución de la fuente de carbono tenía el efecto contrario, ya que era su aumento el que resultaba en un mejor rendimiento. Asimismo, este documento no modifica los otros componentes del medio BAF, lo que también en el caso de Ramada genera un crecimiento bastante limitado del hongo. Además, las condiciones de cultivo tampoco son las mismas ya que el pH que utilizan los investigadores del artículo es superior al pH óptimo de cultivo de Ramada sp. Finalmente, los investigadores del artículo no generan semillas del hongo y por tanto tampoco lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención, ni logran una producción continua.

Por otra parte, la publicación científica de Rossi y Oliveira del año 2011 tuvo por objetivo estudiar el efecto de la composición del medio de cultivo en la producción de biomasa del hongo ectomicorrícico Pisolithus microcarpus. En este estudio, los investigadores probaron dos medios de cultivo que ya habían sido optimizados para el cultivo de dicha especie: medio Melin-Norkrans modificado (MMN) y medio Pridham-Gottlieb modificado (PGK), encontrando que este último comprende glucosa 10 g/L, 3,33 g/L de peptona y 0,67 g/L de extracto de levadura, junto con otras sales, era el más eficiente. Asimismo, en un intento de optimizar el medio, variaron la razón C/N y encontraron que se podía incrementar la glucosa hasta 14 g/L para producir mayor biomasa, y que el aumento de peptona, también podría resultar útil; sin embargo, concluyeron que el extracto de levadura promovía un efecto deletéreo, por lo que recomendaron explícitamente eliminar el extracto de levadura del medio y reemplazarlo con peptona. Esta publicación se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan adecuados para el género Ramaria, y que de hecho distan de los medios de cultivo aptos para su cultivo como el medio BAF. Incluso así y si se comparan los componentes de los medios, es posible observar en primer lugar que en este artículo los investigadores someten al hongo a dos medios de cultivo distintos que facilitan su desarrollo. Sin embargo, nuevamente y al igual que en el artículo antes discutido, disminuyen la concentración de la fuente de carbono, y no aumentan de modo significativo la concentración del extracto de levadura, ambas cosas relevantes y contrarias a los hallazgos de los inventores de la presente invención que encontraron que el aumento de la fuente de carbono y el aumento del extracto de levadura resultaban en un mejor rendimiento. Asimismo, no establecen condiciones de cultivo útiles para el cultivo de Ramaria y tampoco generan semillas del hongo y por tanto tampoco no lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención.

Otro artículo científico que forma parte del estado del arte de la presente invención es el publicado por Kibar y Peksen el año 2011 , que evaluó el impacto del medio de cultivo y las condiciones de cultivo en Tricholoma terreum. Los investigadores ensayaron los medios de cultivo Agar Papa Dextrosa (APD), Biotina-Aneuhna-Ácido fólico (BAF), Extracto de Malta Agar (MEA), Melin Norkans Medium (MMN) y Medio de cultivo M40 modificado, encontrando que el efecto de los mismos no era significativo, y que las mejores condiciones de cultivo eran a 25°C y pH 4,5-6. Al igual que los documentos anteriores, este artículo se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan óptimos para el género Ramaria, ya que utilizan medio BAF base, sin ninguna modificación, que según los inventores de la presente invención encontraron que producía un limitado crecimiento del hongo. Además, los investigadores del artículo no generan semillas del hongo y por tanto tampoco lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención, ni logran una producción continua.

Del mismo modo, el documento de Carrillo, et al., publicado en el año 2004, evaluó las condiciones de cultivo óptimas para el crecimiento de Lactarias deliciosas y de Saillas mediterraneensis en un biorreactor bajo condiciones de fermentación de: 23°C, pH 5,5, 60% de oxígeno disuelto, agitación a 100 rpm, y flujo de aire de 1 ,2-2 L/min, a través de la medición de la producción de ergosterol. Los investigadores realizaron los ensayos con medios Biotina- Aneurina-Ácido fólico (BAF) y Melin Norkans Medium (MMN), encontrando que el medio MMN era el más, óptimo con la adición de agar. Nuevamente y al igual que los documentos anteriores, este artículo se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan óptimos para el género Ramaria, ya que de hecho demuestran que BAF no resulta óptimo, sino que por el contrario MMN es el mejor medio. Además, indican explícitamente que la adición de agar es una condición de este óptimo resultado, lo que en la presente invención no es un componente esencial, ya que se pueden generar cultivos líquidos sin agar con excelentes resultados. Asimismo, los investigadores de esta publicación no indican haber modificado el medio BAF base, lo que, como se indicó previamente, genera un limitado crecimiento del hongo Ramada. Además, los investigadores del artículo no generan semillas del hongo y por tanto tampoco lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención.

Por otra parte, en los documentos de patentes, al igual que en el área académica, los documentos se concentran en tecnologías asociadas a hongos saprofitos tales como, métodos para la producción de micelios o incluso hongos in vitro. De este modo, fue posible constatar una vez más que, en comparación a las tecnologías para hongos saprofitos, existen acotados documentos asociados con la producción de hongos ectomicorrícicos.

El documento WO2021030057 A1 corresponde a una solicitud de patente publicada en febrero de 2021 que divulga un método para cultivar hongos ectomicorrícicos, específicamente especies de hongos micorrícicos truferos con el objetivo de producir trufas. Para ello, los inventores utilizaron un medio de cultivo que puede comprender una fuente de carbono, una de nitrógeno, KH2PO4, MgSO4 x 7H ₂ O, agar y que puede incluir también vitaminas como tiamina-HCI y/o biotina. El documento contempla una etapa de pre-cultivo de los micelios en donde se incuban con 35 g/L de glucosa, 5 g/L de peptona, 2,5 g/L de extracto de levadura, 2,5 g de KH2PO4, 1 g/L MgSO4 x 7H ₂ O, y 0,05 g/L de Tiamina-HCI, a pH 5,5 y se incuban por 5 días a 25°C y con agitación a 150 rpm. En esa etapa, los inventores no utilizan FeCh x 6H2O, ZnSC x 7H ₂ O, MnSC x 4H ₂ O, ni CaCh. Posteriormente, los micelios se transfieren a un biorreactor en donde se cambian las concentraciones de los componentes y se reemplaza la glucosa por sacarosa, pero tampoco se agregan los componentes antes individualizados. Asimismo, se refiere a un método para cultivar hongos ectomicorrízicos que comprende incubar diferentes micelios ectomicorrícicos truferos en un medio de cultivo durante 3 días a 50 días para producir una biomasa fúngica ectomicorrízica, en donde la incubación se puede llevar a cabo a una temperatura entre 20° C a 35° C y a un pH de 5 a 8,5, de manera fija, y se agrega nuevo medio de cultivo en pulsos. Este documento divulga además un método para colonizar raíces de una plántula con micelio ectomicorrízico que comprende inocular una semilla de planta con una suspensión líquida que comprende la biomasa micelial ectomicorrízica, y germinar la semilla para producir una plántula, colonizando así las raíces de la plántula. Esta solicitud de patente se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan adecuados para el género Ramaria, ya que, no incluye compuestos inorgánicos clave para el desarrollo de Ramaria sp. Asimismo, si bien este documento tiene algunos componentes de la formulación de la presente solicitud, sus concentraciones son totalmente distintas y no permitirían el adecuado desarrollo de Ramaria pudiendo limitar significativamente su crecimiento. Además, las condiciones de cultivo tampoco son las mismas ya que el pH que utilizan los investigadores del artículo es superior al pH óptimo del cultivo de Ramaria. Finalmente, los investigadores del artículo no generan semillas del hongo en sustrato inerte y por tanto tampoco lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención. De hecho, la presente invención en ningún momento coloniza una semilla de una planta como hacen los inventores de WO 2021030057, sino que, por el contrario, se genera una semilla del hongo sin estar asociado a una plántula, lo que justamente representa un efecto sorprendente de la invención.

Por otra parte, el documento CL201103013 corresponde a una solicitud de patente nacional publicada en mayo de 2012 que pretende producir a gran escala inóculos miceliales de las especies Amanita caesarea y Boletus aereus con fines de restauración forestal y producción controlada de hongos comestibles. El documento divulga un medio de cultivo sólido de avena y, un medio BAF modificado, y un procedimiento para la obtención in vitro de micelio fúngico en cultivo puro que comprende las siguientes etapas: a) aislamiento del micelio fúngico, b) inoculación del micelio aislado en la etapa a) en un medio de cultivo sólido de avena, modificado (MOM), c) purificación del micelio, d) desarrollo del micelio purificado en la etapa c) en un medio de cultivo Biotina-Aneurina-Ácido Fólico (BAF) modificado, y e) obtención del micelio fúngico, en donde el cultivo se mantuvo a 25°C, pH 6 y agitación constante de 120 rpm durante 5 días. La modificación del medio BAF que utilizaron disminuye significativamente la concentración de glucosa a 5-20 g/L, manteniendo exactamente todos los otros componentes del medio base, con sus respectivas concentraciones sin variación. Este documento se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan adecuados para el género Ramaria, ya que las concentraciones de los componentes que ellos utilizan son disímiles a las de la formulación de la presente invención. Si se comparan los componentes de los medios, es posible observar en primer lugar que en este artículo los investigadores someten al hongo a dos medios de cultivo distintos que facilitan su desarrollo. Sin embargo, nuevamente y al igual que los artículos antes discutidos, disminuyen dramáticamente la concentración de la fuente de carbono, sin cambiar ningún otro componente, lo que se contradice con lo encontrado por los inventores de la presente invención en donde es el aumento de la fuente de carbono y no su disminución lo que generaba un mejor rendimiento. Asimismo, no establecen condiciones de cultivo útiles para el cultivo de Ramaria y tampoco generan semillas del hongo y por tanto tampoco lo someten a un cultivo asociado a un sustrato y a una incubación en condiciones variables como las de la presente invención. Adicionalmente, en la solicitud de patente nacional CL 201103013 se utilizan dos medios de cultivo distintos, siendo el primero un medio de cultivo sólido de avena modificado, que ciertamente tendrá características nutricionales totalmente distintas a las de la formulación de la presente invención. Además, los micelios tienen un destino significativamente diferente, ya que en dicha solicitud los micelios se disponen para la inoculación de plantas, mientras que en la presente invención se utilizan los micelios puros en la generación de una semilla de hongo, lo que estabiliza y facilita la mantención de los hongos sin la intervención obligatoria de las plantas a mediano y largo plazo. En ese sentido, el experto podrá reconocer claramente que esto representa una ventaja técnica, por ejemplo, al momento de producir la invención a gran escala.

Finalmente, el documento US 2020385669, corresponde a una solicitud de patente publicada en diciembre de 2020, describe métodos para cultivar hongos micorrízicos y/o ectomicorrícicos, específicamente Pisolithus tinctorius, para producción a gran escala de productos derivados de los mismos. El método que propone esta solicitud comprende inocular un medio de crecimiento líquido con una cepa de hongos; suspender un portador de anclaje particulado en el medio de crecimiento líquido como un sitio para nuclear el crecimiento de hongos; añadir una o más sustancias antibactehanas (antibiótico) al medio de crecimiento líquido; y cultivar la cepa mediante fermentación aeróbica sumergida. El portador de anclaje puede ser cualquier material esterilizado adecuado para servir como sitio de nucleación para el crecimiento de hongos, tales como semillas, nueces, frijoles o incluso trozos de fruta picada. El cultivo se lleva a cabo a un pH de 2,0 a 7,0, a una temperatura preferiblemente de 25 a 30° C y el medio nutritivo líquido comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno (por ejemplo, extracto de levadura), nutrientes inorgánicos, fuentes de vitaminas, aminoácidos esenciales y microelementos. Este documento describe que se inocularon micelios de P. tínctoríus en placas de Petri que contenían agar MPG sólido que comprendía (g/l): peptona (10.0) extracto de levadura (2.0), dextrosa (30.0), agar (20.0), KH2PO4 (2.38), K2PO4 (5.65), MgSO ₄ (1.00), NH4NO3 (3.0), CuSO ₄ (0,0064), FeSO ₄ (0,001 1 ), MnCI ₂ (0,0019), ZnSO ₄ (0,0015). Se indica que el pH se mantuvo entre 5,0 y 6,0, y que las placas inoculadas se incubaron a 30 ^e C durante 5 a 10 días. Esta solicitud de patente se diferencia de la presente invención en que por un lado se enfoca en otro género de hongo comestible y además utiliza medios de cultivo que no resultan adecuados para el género Ramaria, ya que las concentraciones de los componentes difieren de las de la presente invención y no permitirían el adecuado desarrollo de Ramaria pudiendo limitar significativamente su crecimiento. Además, las condiciones de cultivo tampoco son las mismas. Finalmente, los investigadores del artículo no generan semillas del hongo en sustrato inerte a través de una incubación en condiciones variables como las de la presente invención.

Tomando todo el estado de la técnica en su conjunto es posible notar que ninguno de estos documentos se enfoca específicamente en hongos ectomicorrícicos del género Ramaria, sino que se enfocan en otros géneros muchas veces más asociados a la recuperación forestal que a la industria agroalimentaria. Por lo tanto, la presente invención se enfrenta al problema técnico de producir micelios de Ramaria sp. en condiciones controladas por primera vez y lo resuelve a través de una solución que no está descrita ni sugerida en el estado de la técnica.

En vista de los documentos del estado de la técnica antes mencionados resulta claro que el crecimiento de los hongos ectomicorrícicos depende en gran medida del medio de cultivo y de las condiciones de crecimiento, sin que puedan generalizarse parámetros únicos para todos los géneros que sean ectomicorrícicos. Así, es evidente que lo que para algunos géneros es favorable, como aumentar la cantidad de extracto de levadura o disminuir la cantidad de glucosa, para otros géneros es desfavorable. En consecuencia, existe un alto índice de impredecibilidad al momento de estudiar las condiciones de cultivo de este tipo de hongos y resulta destacadle que ni en el estado de la técnica asociado a la literatura científica, ni en los documentos de patente, existan tales estudios para el hongo del género Ramaria.

Así, si bien algunos de estos documentos divulgan un medio de cultivo y un procedimiento para la obtención in vitro de micelios fúngicos en cultivo puro, no divulgan un medio con los componentes y/o concentraciones de estos de la presente invención. Asimismo, tampoco divulgan un método para el crecimiento y propagación in vitro de hongos ectomicorrícicos en un medio como el propuesto por los inventores que incluya una etapa de inoculación de los micelios aislados para la propagación y posterior uso, y menos aún un método para la producción de una semilla de hongo a partir de dichos micelios propagados que incluye una incubación en condiciones variables.

En conclusión, en el estado del arte existen múltiples divulgaciones que hacen referencia a la producción de hongos saprofitos, para los cuales se conocen sus métodos de obtención, cultivo, y producción de semillas y carpóforos. Por otra parte, se conocen ciertas condiciones de cultivo para hongos ectomicorrícicos de otras especies, sin embargo, ninguna de ellas se ha asociado con el género Ramaria. En consecuencia, a la fecha, no existe evidencia que demuestre o sugiera que los medios y condiciones de cultivo particulares descritas en el estado del arte para otros hongos micorrícicos podrán utilizarse para la producción de micelios y de semillas de hongos del género Ramaria. De hecho, en el estado de la técnica existen evidencias tan diversas en las formulaciones de los medios de cultivo que si un experto intentara aplicarlas para hongos de otro género se encontraría con numerosas contradicciones que no le permitirían obtener una formulación sin la necesidad de realizar una acabada investigación con múltiples ensayos experimentales.

Por tanto, si bien el estado del arte enseña que es posible crecer ciertos géneros de hongos tipo ectomicorrícicos utilizando medios de cultivo y condiciones de cultivo in vitro bien definidas, no existen descritos métodos, medios de cultivo, ni condiciones de cultivo que permitan la producción de hongos ectomicorrícicos como Ramaria sp. en condiciones controladas y de una manera totalmente independiente del hospedero. Asimismo, no existe un método in vitro que utilice medios de cultivos específicos favorables para dicho género que permitan obtener semillas de hongos del género Ramaria, en ausencia de un co-cultivo de forma simbiótica con una planta y de manera independiente de la estacionalidad, y de manera continua.

SOLUCIÓN AL PROBLEMA TÉCNICO

Para subsanar el problema planteado, se presentan formulaciones de medios de cultivos específicos, y métodos que las emplean, para cultivar hongos silvestres, particularmente hongos ectomicorrícicos, preferentemente hongos Ramaria sp. Las formulaciones y los métodos de la presente invención posibilitan la producción de dichos hongos en ambientes controlados, a través de técnicas que permiten el desarrollo y la propagación de micelios de hongos ectomicorrícicos in vitro, de manera independiente de un hospedero, de manera continua durante el año y la producción de semillas de estos hongos que posteriormente se pueden utilizar para la fructificación de los mismos.

Las formulaciones de medios de cultivos específicos de la invención imitan las condiciones ambientales naturales en las cuales estos hongos se desarrollan, y las condiciones operacionales del método que las utiliza permiten, a diferencia de lo descrito en el estado del arte, el desarrollo, crecimiento y propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos, y la obtención de semillas de dichos hongos, en ausencia de un co-cultivo simbiótico con una planta. Esta capacidad de cultivo in vitro permite el cultivo intensivo de la especie, a lo largo del año, independiente de hospedero y sin depender de la temporada de crecimiento natural, lo que posibilitará posteriormente un mejor control de forma, tamaño, peso y color de los carpóforos, con el fin de obtener productos homogéneos útiles en la industria.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una fotografía del crecimiento micelial de Ramaria flava en placa, crecido en medio Agar Papa Dextrosa (APD). A la izquierda se observa una fotografía de la placa desde arriba, y a la derecha, una fotografía de la placa desde debajo. Se observa que los micelios crecen de forma rastrera (por debajo del agar), sin micelio aéreo y de color blanco/transparente.

La Figura 2 muestra la identificación de micelios de Ramaria flava a través de microscopía óptica con magnificación de 40X. Se observa claramente la presencia de micelios rastreros. A la izquierda se muestra la presencia de septos (círculos negros) y clips o clamps (rombos negros). A la derecha se muestran las ramificaciones o branches (flechas negras). Todas las estructuras identificadas son características del género Ramaria sp.

La Figura 3 muestra la identificación de micelios de Ramaria flava a través de microscopía de epifluorescencia. A) Formación de clips o clamps, con vista de núcleos al interior del micelio. B) y C) Vista de septos del micelio vegetativo. D) Núcleos del micelio vegetativo. Se observan claramente los micelios rastreros, la presencia de núcleos al interior del micelio y de estructuras específicas como septos y entre-septos con cuatro o dos núcleos.

La Figura 4 muestra la evaluación de condiciones de crecimiento de Ramaria sp. en medio Agar Papa Dextrosa (APD), en distintas condiciones de temperatura y pH. A) Se sembraron micelios aislados en placas APD, suplementadas con 5 mg/mL de gentamicina, manteniendo el pH del medio sin alterar (pH 5.4) e incubando las placas a cinco temperaturas diferentes: 10°C, 15°C, 20°C, 25°C y 30°C. B) Se realizó el mismo experimento, manteniendo la temperatura a 25°C y variando el pH del medio según: pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0. Se observó que el hongo no crece entre 10°C y 15°C, ni entre pH 6.5 y 7.0.

La Figura 5 muestra la evaluación del crecimiento micelial, medido según el diámetro en milímetros, de Ramaria flava en medio sólido APD o medio base suplementado con distintas fuentes de carbono (carboximetilcelulosa (CMC), glucosa, sacarosa y almidón), en rangos de pH entre 4.3 y 6.8 y temperaturas entre 20°C y 30°C. La Figura 5A) muestra el crecimiento micelial de R. flava en medio de cultivo sólido a 20°C. La figura 5B) muestra el crecimiento micelial de Ramaria flava en medios de cultivo sólido a 25°C. La figura 5C) muestra el crecimiento de R. flava en medio de cultivo sólido a 30°C. La figura 5D) muestra un gráfico que resume las mediciones de peso seco en las condiciones de cultivo, es decir, entre 20°C y 30°C y entre pH 4.3 y 6.8, utilizando glucosa como fuente de carbono. Es posible notar que, a 20°C, solo se observó crecimiento a los pH 5.3 y 5.8, mostrando el crecimiento más bajo en aquellas muestras cultivadas en medio de cultivo APD y medio base suplementado con CMC, y el mayor crecimiento se observó en las muestras cultivadas en sacarosa. Por su parte, se puede apreciar que a 25°C el crecimiento solo fue visible a pH 5.3, mostrando el mayor rendimiento en el medio de cultivo base suplementado con sacarosa o con almidón como fuentes de carbono, y el menor crecimiento se observó en medio de cultivo base suplementado con CMC. Finalmente, se puede apreciar que, a 30°C también solo se observó crecimiento del hongo a pH 5.3, siendo la glucosa la fuente de carbono donde se observó menor crecimiento, mientras que CMC y sacarosa fueron las fuentes de carbono que presentaron mayor crecimiento micelial en el medio de cultivo. Barras de error: 95% Cl.

La Figura 6 muestra una fotografía del crecimiento micelial de Ramaria flava en placa, con micelios crecidos en medio Biotina-Aneurina-Ácido fólico base (arriba izquierda), modificado 1 (arriba derecha), modificado 2 (BAF modificado 2; abajo izquierda), y modificado 3 (abajo derecha) a pH 5,3 y a 25°C. A la izquierda se observa una fotografía de la placa desde arriba. Se observa que los micelios crecen en gran cantidad en el BAF modificado 2, de forma aérea, no uniforme y de color blanco.

La Figura 7 muestra una representación gráfica del crecimiento micelial de Ramaria flava, en términos de peso seco (g), en medio de cultivo BAF base, BAF modificado 1 , BAF modificado 2, y BAF modificado 3, todos crecidos a 25°C y a pH 5,3. Cada condición experimental contó con 6 repeticiones. La Figura 8 muestra imágenes representativas del crecimiento del micelio en medio de cultivo Biotina-Aneurina-Ácido fólico modificado 2 (BAF modificado 2) con distintas fuentes de carbono. A) Control con medio APD; fuentes de carbono: B) CMC; C) Glucosa; D) Almidón; E) Sacarosa.

La Figura 9 muestra una fotografía del crecimiento micelial de Ramaria flava en medio líquido. A) Micelios crecidos en medio Biotina-Aneurina-Ácido fólico modificado 2 (BAF modificado 2), a pH 5,3 y a 25°C, por triplicado. B) Micelios crecidos en medio BAF modificado 2 (al centro), en medio APD líquido (a la derecha), así como también el control en donde no se inocularon micelios (a la izquierda), a pH 5,3 y a 25°C, por triplicado. Se observa que los micelios crecen formando esferas del hongo color blanco.

La Figura 10 muestra una representación gráfica del crecimiento micelial de Ramaria flava, o en otras palabras de la producción de biomasa, en términos de peso seco (g), utilizando medio de cultivo APD sólido, Biotina-Aneurina-Ácido fólico modificado 2 (BAF modificado 2) sólido, APD líquido, o BAF modificado 2 líquido, todos ensayados a pH 5,3 y a 25°, y cultivados por 7 días

La Figura 1 1 muestra una representación gráfica de la producción de biomasa promedio de Ramaria flava, evaluada utilizando el medio de cultivo Biotina-Aneurina-Ácido fólico modificado 2 (BAF modificado 2) líquido, vahando la fuente de carbono como suplemento del medio de cultivo (carboximetilcelulosa (CMC), glucosa, sacarosa y almidón), y distintas condiciones de pH (4,8, 5,3, 5,8, 6,3 y 6,8) y temperaturas (A. 20°C; B. 25°C; y C. 30°C). A) Evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 20°C. B) Evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 25°C. C) Evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 30°C. A partir de los gráficos, se observa que, si bien en todas las condiciones se logró producir biomasa de Ramaria flava, las mejores condiciones de cultivo se obtuvieron utilizando glucosa como fuente de carbono, a 25°C y a pH 4,8; utilizando sacarosa como fuente de carbono, a 20°C y a pH 5,8; y utilizando almidón como fuente de carbono, a 30°C y a pH 6,8. Barras de error: 95% Cl.

La Figura 12 muestra una representación gráfica de la colonización de Ramaria flava en distintos sustratos y mezclas de estos a temperaturas de entre 20°C y 30°C y humedad de 0%; 50% y 80%. Las muestras fueron evaluadas durante un mes, hasta que se completó la colonización de los primeros sustratos. En los gráficos, el orden de los sustratos de izquierda a derecha es: arroz, arroz + biofert®, arroz + trigo, aserrín, aserrín + arroz, aserrín + biofert®, aserrín + trigo, biofert®, trigo, y trigo + biofert®. A) Evaluación del porcentaje de colonización del micelio en los distintos sustratos, a 20°C y a humedades de 0, 50 y 80%. B) Evaluación del porcentaje de colonización del micelio en los distintos sustratos, a 25°C y a humedades de 0, 50 y 80%. C) Evaluación del porcentaje de colonización del micelio en los distintos sustratos, a 30°C y a humedades de 0, 50 y 80%. El mayor porcentaje de colonización se obtuvo utilizando arroz como sustrato, incubado a una temperatura de 20°C y a 50% de humedad. Barras de error: 95% Cl.

La Figura 13 muestra una fotografía del crecimiento micelial de Ramaria flava en donde se observa la colonización completa del sustrato (arroz), luego de un mes de incubación a 20°C y a 50% de humedad.

La Figura 14 muestra el desarrollo del micelio a los 5, 10, 15, 20 y 22 días, a través de imágenes tomadas desde arriba de las placas utilizando como sustrato: A) trigo/biofert® ; B) biofert®; C) arroz; D) trigo; E) arroz/biofert®; F) arroz/trigo; G) aserrín; H) aserrín/arroz; I) aserrín/biofert® ; o J) aserrín/trigo. En cada panel superior, se muestra el desarrollo del micelio cuando las placas fueron incubadas a una temperatura constante de 25°C por 22 días y sin humedad. En cada panel inferior, se muestra el desarrollo del micelio cuando las placas fueron incubadas bajo condiciones variables, específicamente, en tres etapas: i) días 1 -14 a 20°C y 45% de humedad; ¡i) días 15-20 a 25°C y 80% de humedad; y iii) día 21 - 22 a 10°C y 30% de humedad.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a formulaciones de medios de cultivo específicos, útiles para el crecimiento, desarrollo y propagación de micelios de hongos in vitro, preferentemente de hongos micorrícicos, más preferentemente de hongos ectomicorrícicos y aún más preferentemente de hongos Ramaria sp., en donde las formulaciones y los métodos de la presente invención posibilitan la producción de dichos hongos en ambientes controlados, a través de técnicas que permiten el desarrollo y la propagación de micelios de hongos ectomicorrícicos in vitro, de manera independiente de un hospedero, de manera continua y la producción de semillas de estos hongos que posteriormente se pueden utilizar para la fructificación de los mismos.

Las formulaciones de medios de cultivo de la presente invención comprenden los siguientes componentes: fuente de carbono, peptona, extracto de levadura, KH2PO4, MgSC x 7H ₂ O, FeCh x 6H ₂ O, ZnSC>4.7H ₂ O, MnSC x 4H ₂ O, CaCI ₂ , agar y agua destilada. La fuente de carbono para elaborar una formulación de un medio de cultivo de acuerdo con la invención, preferentemente y sin limitación, puede ser seleccionada del grupo que comprende, glucosa, sacarosa, carboximetilcelulosa (CMC), y almidón.

Asimismo, las formulaciones de medios de cultivo de la presente invención pueden comprender, adicional y opcionalmente, vitaminas. Preferentemente y sin limitación, las vitaminas se seleccionan del grupo que comprende tiamina HCI, biotina, ácido fólico e inositol.

Preferentemente, las formulaciones de medios de cultivo conforme a la presente invención comprenden: 30-60 g de fuente de carbono, 2-4 g de peptona, 0,2-1 g de extracto de levadura, 0,5-1 g de KH2PO4, 0,5-1 g de MgSC x 7H ₂ O, 10-20 mg FeCh x 6H ₂ O, 1 -5 mg de ZnSC>4.7H ₂ O, 5-10 mg de MnSC x 4H ₂ O, 100-200 mg de CaCI ₂ , y 1 L de agua destilada. Asimismo, cuando se utilizan los medios de cultivo en estado sólido, a los componentes antes enumerados, se agregan 12-18 g de agar. Adicional y opcionalmente, las formulaciones de medios de cultivo conforme a la presente invención comprenden 0,05-0,5 mg de tiamina HCI, 0,001 -0,1 mg de biotina, 0,1 -0,2 mg de ácido fólico y 50-100 mg de inositol.

Más preferentemente, las formulaciones de medios de cultivo conforme a la presente invención comprenden: 40 g de fuente de carbono, 3 g de peptona, 1 g de extracto de levadura, 0,5 g de KH ₂ PC>4, 0,5 g de MgSC x 7H ₂ O, 10 mg FeCh x 6H ₂ O, 5 mg de ZnSC>4.7H ₂ O, 5 mg de MnSÜ4 x 4H ₂ O, 100 mg de CaCI ₂ , y 1 L de agua destilada. Asimismo, cuando se utilizan los medios de cultivo en estado sólido, a los componentes antes enumerados, se agregan preferentemente 15 g de agar. Adicional y opcionalmente, las formulaciones de medios de cultivo conforme a la presente invención comprenden más preferentemente 0,5 mg de tiamina HCI, 0,1 mg de biotina, 0,1 mg de ácido fólico y 60 mg de inositol.

La invención también se refiere a un método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos, particularmente hongos ectomicorrícicos silvestres comestibles, preferentemente del género Ramaria.

El método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos comprende las siguientes etapas:

(i) inoculación de micelios aislados de hongos ectomicorrícicos;

(¡i) incubación de los micelios inoculados; y

(iii) obtención de micelios de hongos ectomicorrícicos propagados in vitro. Los micelios aislados se aíslan a través de métodos convencionales para el experto, a partir de ramas obtenidas desde los hongos de interés, desde las cuales posteriormente se aíslan los micelios vegetativos.

Dicha obtención de ramas desde los hongos de interés, previa a la ejecución del método se puede realizar, por ejemplo, pero sin limitación, según las etapas de: colección de los carpóforos de los hongos de interés; desinfección de los carpóforos; secado de los carpóforos; separación de los tallos, las esporas y las ramas desde los carpóforos; y corte de las ramas en pequeñas fracciones de 1cmx1cm, para posteriormente proceder al cultivo de estas últimas que en último término permiten el aislamiento de los micelios vegetativos.

La desinfección de los carpóforos se puede realizar a través de medios conocidos por el experto en el arte, que limiten, disminuyan o eliminen los microorganismos contaminantes, sin afectar el crecimiento del micelio de los hongos ectomicorrícicos. A modo de ejemplo y sin representar una limitación, los carpóforos se pueden desinfectar con alcohol, preferentemente, con etanol al 95%. La aplicación del desinfectante se podrá realizar a través de métodos rutinarios, tales como, pero sin limitación a, rociamiento o inmersión. El tiempo de desinfección puede variar entre 5 y 10 minutos.

El secado de los carpóforos se puede llevar a cabo por distintos métodos conocidos en el arte, de modo que se mantenga la integridad de la muestra sin afectar mayormente la microbiota propia y asociada al hongo. Preferentemente, el secado de los carpóforos se realiza a través de convección. La temperatura de secado puede variar en un rango de 45- 60°C. Más preferentemente, la temperatura de secado es de entre 55 y 60°C. El tiempo de secado puede vahar entre 12-72 horas; más preferentemente el tiempo de secado es de entre 12-24 horas.

La separación de los tallos, las ramas y las esporas desde los carpóforos se realiza a través de métodos convencionales, tales como cortes del tejido y suspensión de esporas en PBS (Buffer fosfato salino) o suero fisiológico (NaCI 0.8%). Posteriormente, se seleccionan las ramas y se cortan en pequeñas fracciones. Preferentemente, las ramas se cortan en pequeñas fracciones de entre 0,5-1 ,5 cm

El aislamiento del micelio vegetativo de los hongos ectomicorrícicos, se realiza a partir de dichas fracciones de las ramas de los hongos de interés (obtenidas según métodos convencionales), a través de métodos conocidos por el experto en el arte. Así, dicho aislamiento se puede realizar, por ejemplo, pero sin limitación, conforme a las etapas de: inoculación de cortes de las ramas en medio de crecimiento suplementado con antibiótico; incubación de las muestras hasta observar crecimiento del micelio; y aislamiento del micelio.

La inoculación de los cortes de las pequeñas fracciones de las ramas se lleva a cabo en un medio de crecimiento apto para hongos micorrícicos. Dicho medio de crecimiento puede ser seleccionado de cualquier medio de crecimiento que contenga como fuente de carbono al menos un azúcar simple, como glucosa o dextrosa. Preferentemente, dicho medio de crecimiento se selecciona entre la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, medio de cultivo de Agar Papa Dextrosa (APD), Extracto de Malta (EM), Rosa Bengala, y medio de cultivo BAF (Biotina/Aneurina/Ácido fólico). Para la propagación de los hongos en dichos medios de cultivo, se pueden utilizar distintos soportes conocidos en el arte, tales como placas Peth, tubos Falcon, tubos de ensayo, entre otros, los cuales deben estar en condiciones estériles, deben permitir el intercambio gaseoso y deben estar cerrados. El medio de crecimiento se puede suplementar con uno o más antibióticos, preferentemente antibióticos de amplio espectro, tales como estreptomicina, cloranfenicol y gentamicina. La concentración del(los) antibiótico(s) se ajusta dependiendo de su actividad, de modo tal que no se observe crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo se suplementa con gentamicina a una concentración entre 0,5-5 mg/mL. Más preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo se suplementa con gentamicina a una concentración de entre 0,5-0, 8 mg/mL.

La incubación de las muestras inoculadas se puede realizar a una temperatura de entre 20 a 25°C, por un período de tiempo tal que se observe un crecimiento completo de la muestra en el soporte, lo cual se evalúa observando cuando el micelio ha cubierto toda la superficie del soporte, por ejemplo, cuando haya cubierto toda la placa Peth o cuando haya agotado el medio líquido. Preferentemente, la muestra se incuba por un período de entre 5 y 15 días. Más preferentemente, por un período de entre 5 y 10 días. La incubación se realiza con condiciones de humedad ambiental, preferentemente con una humedad entre el 40-50%. Preferentemente, las muestras se incuban con condiciones de fotoperíodo controladas, más preferentemente, utilizando una condición de fotoperíodo de 12 horas luz y 12 horas sombra. El pH del medio de crecimiento se ajusta a un pH ligeramente ácido. Preferentemente, el pH del medio se ajusta a entre 4,5 y 6,8. Más preferentemente, el pH se ajusta a entre 4,8 y 5,8.

El crecimiento del micelio se puede evaluar por diversos métodos conocidos por el experto. Preferentemente, el crecimiento se evalúa midiendo el crecimiento radial del hongo (cm). Dicha medición se puede realizar, por ejemplo, pero sin limitación, a través de microscopía, preferentemente microscopía óptica o microscopía electrónica.

Una vez crecido, el aislamiento del micelio se puede llevar a cabo por diversas técnicas conocidas en el arte que permitan obtener micelios puros del hongo. Preferentemente, el aislamiento se realiza a través de diluciones seriadas, utilizando medios conocidos por el experto, tales como, pero no limitados a, tubos de ensayo, frascos, entre otros, con, por ejemplo, agua destilada, suero fisiológico NaCI (0.8%) o medio de cultivo líquido, tales como APD, BAF u otros medios de cultivo conocidos por el experto, preferentemente agua destilada estéril.

Las muestras de micelios aislados a partir de las diluciones seriadas se pueden opcionalmente resembrar en las mismas condiciones especificadas anteriormente, para análisis adicionales posteriores.

Opcionalmente, las muestras de micelios aislados se pueden analizar morfológicamente utilizando, por ejemplo, microscopía. Preferentemente, el análisis morfológico se realiza a través de microscopía óptica, microscopía de fluorescencia o microscopía de epifluorescencia, evaluando estructuras claves, tales como, pero no limitadas a, septos, entre septos, clips y dobles núcleos.

Adicionalmente, opcionalmente, la identidad de los micelios se puede corroborar utilizando medios conocidos por un experto, tales como microscopía de epifluorescencia, secuenciación, análisis por espectrometría de masas, preferentemente MALDI-TOF/TOF, o combinaciones de los mismos.

Utilizando los micelios aislados a través de métodos convencionales tales como los antes descritos, pero sin limitación a los mismos, se realiza la etapa (i) del método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos, en donde los micelios aislados son inoculados en un medio de crecimiento apto para hongos micorrícicos y son incubados en condiciones específicas de temperatura y de pH.

Dicho medio de crecimiento puede ser seleccionado de la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, medio Agar Papa Dextrosa (APD), Extracto de Malta (EM), Rosa Bengala, y medio de cultivo BAF (Biotina/Aneurina/Ácido fólico). Preferentemente, los micelios aislados son inoculados en la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención. Para la inoculación y posterior propagación de los hongos en dichos medios de cultivo, se pueden utilizar distintos soportes conocidos en el arte, tales como placas Petri, tubos Falcon, tubos de ensayo, entre otros, los cuales deben estar en condiciones estériles, deben permitir el intercambio gaseoso y deben estar cerrados. El medio de crecimiento se puede suplementar con uno o más antibióticos, preferentemente antibióticos de amplio espectro, tales como estreptomicina, cloranfenicol y gentamicina. La concentración del(los) antibiótico(s) se ajusta dependiendo de su actividad, de modo tal que no se observe crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo se suplementa con gentamicina a una concentración entre 0,5-5 mg/mL. Más preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo se suplementa con gentamicina a una concentración de entre 0,5-0, 8 mg/mL.

La incubación de los micelios aislados e inoculados se realiza a una temperatura de entre 20°C y 30°C y ajustando el pH del medio a entre 4,8 y 6,8. El período durante el cual los micelios son incubados para permitir la propagación de los micelios varía entre 7 y 15 días, tras lo cual se obtienen los micelios de hongos ectomicorrícicos propagados in vitro.

Preferentemente, el método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos comprende las siguientes etapas:

(i) inoculación de micelios aislados de hongos ectomicorrícicos en la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, suplementado con antibiótico a una concentración de 0,5-5 mg/mL;

(¡i) incubación de los micelios inoculados a una temperatura de entre 20°C y 30°C, con un pH del medio ajustado a entre 4,8 y 6,8, y por un período de 7 a 15 días; y

(iii) obtención de micelios de hongos ectomicorrícicos propagados in vitro.

Más preferentemente, el método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos comprende las siguientes etapas:

(i) inoculación de micelios aislados de hongos ectomicorrícicos en la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención, suplementado con gentamicina a 5 mg/mL;

(¡i) incubación de los micelios inoculados a una temperatura de 25°C, con un pH del medio ajustado a entre 5,3, y por un período de 7; y

(iii) obtención de micelios de hongos ectomicorrícicos propagados in vitro. Opcionalmente los micelios propagados pueden someterse a análisis adicionales para corroborar nuevamente su identidad. Por ejemplo, se pueden analizar morfológicamente utilizando microscopía óptica, microscopía de fluorescencia, microscopía de epifluorescencia, o cualquier otro análisis que permita la evaluación de estructuras propias y características del hongo, tales como, pero no limitadas a, septos, entre septos, clips y dobles núcleos. Adicional y opcionalmente, la identidad de los micelios se puede corroborar utilizando medios conocidos por un experto, tales como microscopía de epifluorescencia, secuenciación, análisis por espectrometría de masas, preferentemente MALDI-TOF/TOF, o combinaciones de los mismos.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método para la producción de semillas de hongos ectomicorrícicos, particularmente hongos ectomicorrícicos silvestres comestibles.

El método para la producción de semillas de hongos ectomicorrícicos de acuerdo con la presente invención comprende las etapas de:

(1 ) aislamiento de micelios vegetativos desde hongos ectomicorrícicos;

(2) crecimiento y propagación in vitro de los micelios aislados en la etapa (1 );

(3) acondicionamiento de un sustrato de propagación;

(4) inoculación de los micelios propagados en la etapa (2) en el sustrato acondicionado en la etapa (3);

(5) incubación del sustrato inoculado en la etapa (4); y

(6) obtención de semillas del hongo.

El aislamiento de los micelios vegetativos de la etapa (1 ) se lleva a cabo a través de métodos convencionales como los antes descritos.

El crecimiento y propagación in vitro de los micelios de la etapa (2) se lleva a cabo a través del método para la propagación in vitro de micelios de hongos ectomicorrícicos de acuerdo con la presente invención, antes descrita.

El sustrato de propagación de la tercera etapa (3) se puede elegir desde una amplia diversidad de sustratos, los cuales deben ser altos en fibra y carbohidratos. Preferentemente, y sin limitación, el sustrato puede elegirse desde el grupo que comprende arroz, aserrín, por ejemplo, de roble, trigo, biofertilizantes comerciales, y combinaciones de los mismos.

El acondicionamiento del sustrato de propagación puede comprender una o más de las siguientes subetapas: lavado del sustrato de propagación, dispersión del sustrato de propagación en un soporte, humidificación del sustrato de propagación y/o esterilización del sustrato de propagación.

El lavado del sustrato puede realizarse mediante cualquier método conocido por un experto. Preferentemente, la etapa de lavado se realiza con agua destilada, más preferentemente, con agua destilada estéril. El tiempo de lavado puede vahar entre 15-30 horas. Preferentemente, el tiempo de lavado del sustrato varía entre 22-24 horas.

La dispersión del sustrato se puede realizar en cualquier soporte cerrado que permita el intercambio de gases en el sistema, tales como, envases autoclavables o estériles. El experto reconocerá que hay múltiples alternativas, tales como bolsas, tubos, entre otras. Preferentemente la dispersión del sustrato se realiza en bolsas de polipropileno.

La humidificación del sustrato se realiza utilizando una solución que contenga una fuente de carbono a un pH ligeramente ácido. Preferentemente, la humidificación se realiza utilizando como base una solución de medio de cultivo BAF. Más preferentemente, la humidificación se realiza utilizando la formulación de medio de cultivo de acuerdo con la presente invención. Asimismo, preferentemente, la fuente de carbono es un azúcar. Más preferentemente la fuente de carbono se selecciona del grupo que comprende glucosa, sacarosa, carboximetilcelulosa y almidón. Preferentemente el pH de la solución se ajusta a un pH entre 4,5 y 6,8. Más preferentemente, el pH de la solución se ajusta a entre 4,8 y 5,8.

La humidificación se puede realizar a través de métodos convencionales, dentro de los cuales se encuentran, sin estar limitados a, inmersión, regado, inoculación de los sustratos directamente desde su medio de crecimiento (sólido o líquido), inyección dentro del soporte, entre otros. La humidificación se realiza hasta que todo el sustrato haya absorbido la solución, sin que la solución se acumule en el soporte.

La esterilización del sustrato se puede realizar a través de métodos convencionales, entre los que se encuentran, sin estar limitados a, calor seco, calor húmedo, UV, entre otros. Preferentemente la temperatura de esterilización por calor se encuentra en un rango de temperatura entre 120°C y 170°C. Preferentemente, la esterilización se lleva a cabo a través de calor húmedo. Más preferentemente la esterilización por calor húmedo se lleva a cabo a una temperatura entre 120 y 135°C. Aún más preferentemente la esterilización por calor húmedo se lleva a cabo a una temperatura de 121 °C y a 1 atm de presión. Para realizar la inoculación del sustrato de la etapa (4), se prepara una solución de los micelios obtenidos a partir de la segunda etapa (2), a través de métodos convencionales. Para ello, micelios propagados en la segunda etapa (2), con crecimiento máximo, es decir, que ocupan todo el soporte en el cual se encuentran, son homogenizados en una solución acuosa, preferentemente en medio de cultivo BAF, medio de cultivo APD o agua destilada estéril. El crecimiento máximo se logra, por ejemplo, cuando los micelios de la etapa (2) se propagan ocupando toda la placa o cuando agotan el medio de cultivo líquido en el cual se encuentran. Preferentemente, la solución se prepara con entre 1 y 5 g de micelio fresco homogenizados en 200 mL de agua destilada estéril.

La inoculación de la solución antes preparada se puede realizar a través de métodos convencionales, dentro de los cuales se encuentran, sin estar limitados a, inmersión, regado, inoculación de los sustratos directamente desde su medio de crecimiento (sólido o líquido, sin preparar una solución anteriormente), inyección, entre otros. Preferentemente, la inoculación se realiza de modo que el inoculo se distribuya de manera homogénea en el sustrato, más preferentemente, a través de inyección o regado.

Adicionalmente, se puede realizar una homogenización del sustrato inoculado a través de métodos convencionales. Preferentemente, se realiza a través de agitación. Más preferentemente a través de agitación orbital. El tiempo durante el cual se homogeniza la muestra puede vahar entre 20 y 30 horas, la velocidad entre 120 y 160 rpm y la temperatura entre 20 y 28°C.

La incubación de la etapa (5) se puede realizar con condiciones fijas o con condiciones variables para lograr la propagación del hongo en el sustrato y la subsiguiente obtención de la semilla del hongo.

Si la incubación se realiza con condiciones fijas, el sustrato inoculado se incuba durante un período de entre 22 y 30 días, a una humedad de entre 0% y 50% y a una temperatura de entre 20 y 30°C.

Por otra parte, si la incubación de las muestras se realiza con condiciones variables, se ejecuta en al menos tres etapas: en la primera (i) etapa las muestras se incuban durante un período de entre 12 y 16 días a una humedad de entre 40% y 50% y a una temperatura de 18 y 22°C; en la segunda (¡i) etapa las muestras se incuban durante un período de entre 1 y 8 días a una humedad de entre 60% y 90% y a una temperatura de entre 23 y 28°C; y en la tercera (iii) etapa las muestras se incuban durante un período de entre 1 y 4 días a una humedad de entre 25% y 50% y a una temperatura de entre 8 y 15°C.

En una realización preferida del método, que no limita de modo alguno el mismo, la incubación de la etapa (5) se realiza en condiciones variables, específicamente en tres etapas: en la primera (i) etapa las muestras se incuban durante por 14 días a 20°C y 45% de humedad; en la segunda (¡i) etapa las muestras se incuban por 6 días a 25°C y 80% de humedad; y en la tercera (iii) etapa las muestras se incuban por 2 día a 10°C y 30% de humedad.

La obtención de semillas de hongos de la etapa (6) se realiza una vez que se observa la colonización completa del sustrato, que se refiere al crecimiento del hongo en toda la superficie del sustrato. Dicha colonización completa se puede observar, por ejemplo, a través de la apreciación de una capa gruesa de micelio blanco que cubre totalmente la superficie inoculada. De ese modo, una vez cubierta la superficie, se obtienen las semillas de hongos.

Opcionalmente, una vez obtenida la semilla, si esta se desea conservar por tiempos prolongados, puede dejarse secar a temperatura ambiente (18-20 ^e C) por 24-72 horas, con el fin de eliminar el exceso de humedad de la semilla y evitar contaminación.

Asimismo, opcionalmente, las semillas de hongos pueden ser utilizadas posteriormente en una séptima etapa (7) opcional de fructificación y cosecha del hongo a partir de la semilla producida en la tercera etapa (6), ya sea en su forma fresca, es decir, utilizándola inmediatamente al momento de obtener la colonización completa del hongo en el sustrato, o con la semilla seca preservada según lo anteriormente detallado.

En la séptima etapa (7) opcional se establecen plantas que se asocien en una relación simbiótica con el hongo ectomicorrícico, por ejemplo, pero sin limitación, en invernaderos o cámaras climáticas, de modo de imitar las condiciones naturales de crecimiento. Dichas plantas se inoculan, a través de métodos convencionales, de manera que la semilla del hongo producida según las etapas anteriormente descritas quede de manera homogénea y en contacto directo con las raíces, con el fin de establecer la micorrización del hongo y la posterior formación de cuerpos fructíferos.

Preferentemente, la séptima etapa (7) de fructificación se lleva a cabo estableciendo plantas Nothofagus dombeyi o Nothofagus obliqua y utilizando semillas del hongo Ramaria flava. Los métodos conforme a la presente invención pueden ser aplicados o utilizados para la propagación de micelios de hongos ectomicorrícicos in vitro y/o para la obtención de semillas de dichos hongos ectomicorrícicos de diversos géneros. Algunos hongos de tales características son, pero no están limitados a, los de los géneros: Ramaria sp., Boletus sp., Morchella sp., y Lactarios sp. Preferentemente, los métodos de la presente invención se pueden utilizar, sin estar limitados, para la propagación de micelios y/o producción de semillas de hongos de las especies Boletus loyo, Morchella cónica y Lactarios deliciosos.

Más preferentemente los métodos de la presente invención se utilizan para la propagación de micelios y/o producción de semillas de hongos del género Ramaria sp., aún más preferentemente, pero sin estar limitados a, la producción de Ramaria flava, Ramaria botritys y Ramaria valdiviana. Sin embargo, la invención no está limitada a los mismos, sino que se puede utilizar en cualquier otro hongo silvestre comestible y ectomicorrícico; preferentemente en aquellos que compartan características comunes o condiciones de crecimiento similares a las de los hongos Ramaria sp., tales como las condiciones climáticas, químicas y nutricionales óptimas para el desarrollo.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

EJEMPLO 1 : Aislamiento de micelios vegetativos de Ramaria flava.

Se colectaron nueve carpóforos de Ramaria flava desde cuatro sectores de recolección de la comuna de Carahue, Región de La Araucanía, Chile.

Los carpóforos se desinfectaron por inmersión con etanol al 95% por 5 minutos. Luego, los carpóforos desinfectados fueron secados por convección a una temperatura de 55°C por 24 horas. Transcurrido ese tiempo, se separaron los tallos, las ramas y las esporas desde los carpóforos, y se cortaron fracciones de 1 cm ² de las ramas.

Dichas fracciones de ramas se inocularon directamente en placas Petri de 6 cm, con medio Agar Papa Dextrosa (APD) sólido, con pH ajustado a 5,3, suplementado con gentamicina a 0.5mg/mL. Las placas se incubaron cerradas por 5 días a 25°C, a una humedad ambiental del 50% y con fotoperíodo de 12 horas luz y 12 horas sombra, hasta que se observó el crecimiento completo en placa. Para ello se evaluó diariamente el crecimiento radial en placa (en cm) a través de una lupa con un aumento 40X, desde donde era posible observar las ramificaciones por debajo del agar. Posteriormente, se realizó una identificación molecular de los micelios obtenidos desde dichos carpóforos de Ramaria sp., a través de secuenciación utilizando los partidores ITS1 (5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG3') e ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGATATGC3'), (IDT). Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1 .

Tabla 1 : Identificación molecular de los micelios obtenidos desde carpóforos de Ramaria sp., a través de secuenciación utilizando los partidores ITS1 e ITS4.

En base a la caracterización molecular, se eligió la muestra proveniente del carpóforo H (que contenía la SEQ ID NO: 12 del micelio de Ramaria flava) para los siguientes experimentos. De este modo, posteriormente se extrajeron muestras realizando cortes de 1cm x 1 cm del medio de agar con el hongo (alrededor de 10 mg de hongo), que se homogenizaron utilizando 1 mL de agua destilada estéril. Seguidamente, con la finalidad de aislar los micelios de Ramaria, se realizó una batería de 10 tubos, se sembraron dichos micelios aislados por dilución seriada a partir de cada tubo por triplicado en nuevas placas con el mismo medio de cultivo APD suplementado con 5 mg/mL de gentamicina, y se incubaron con las mismas condiciones definidas anteriormente y se analizaron para corroborar la identidad de los micelios.

Al analizar las muestras, se observó que, en las primeras cuatro diluciones, si bien se observaba el crecimiento de Ramaria, también se observaba el crecimiento de Tríchoderma en conjunto como contaminante. Sin embargo, desde la dilución cinco en adelante, con múltiples repeticiones experimentales, Tríchoderma ya no crecía, por lo que era posible aislar los micelios de Ramaria flava, libres de cualquier contaminación. Al analizar dichas muestras utilizando una lupa con un aumento 40X se observó la aparición de micelio correspondiente a Ramaria sp., el cual bajo las condiciones ensayadas crece de forma rastrera, es decir, las ramificaciones están por debajo del agar, es de un color blanco/transparente y no genera micelio aéreo (Figura 1 ).

EJEMPLO 2: Caracterización microscópica de los micelios aislados.

Una vez finalizada la incubación de los micelios aislados en el ejemplo 1 , particularmente los de la dilución seriada 5, se extrajo una muestra realizando un corte de 1 cm x 1cm del agar que contiene los micelios aislados (alrededor de 10 mg de micelios), el cual se evaluó inicialmente a través de microscopía óptica, utilizando una magnificación de 40X (Figura 2). Se observa claramente la presencia de micelios rastreros, largos, lisos y septados que forman estructuras de septos (círculos negros), clips o clamps (rombos negros), y ramificaciones o branches (flechas negras), justo a nivel de cada septo, en donde en la magnificación 40X se observan con forma de tridentes. Todas esas estructuras son características del género Ramaria

Adicionalmente, se evaluaron los micelios a través de microscopía de epifluorescencia. Con dicha finalidad, se extrajo una muestra, realizando un corte de 1cm x 1 cm del agar (alrededor de 10 mg de micelios) que contiene los micelios aislados de acuerdo a lo descrito en el ejemplo 1 , y se caracterizaron a través de un mareaje fluorescente usando la sonda azul- fluorescente HOESCH 33248. Para esto, una pequeña porción de micelio fue obtenida en condiciones de esterilidad y fue inoculada en 200pL de solución fosfato salina (PBS 1 X) en pH 7,2 suplementado con 10ng/mL de HOESCH. Las muestras fueron incubadas a 37°C por 15 minutos y posteriormente fueron centrifugadas a 300g por 10 minutos. Luego, las muestras fueron resuspendidas en 20pL de PBS1 X y montadas en un portaobjeto limpio. Posteriormente, las muestras fueron observadas en microscopio de epifluorescencia usando el filtro de excitación de 300nm y de emisión de 410nm. Se focalizó el análisis en observar septos en los micelios y estructuras como entre-septos (Figura 3). En la Figura 3A se observa la formación de clips o clamps, con vista de núcleos al interior del micelio. En las Figuras 3B y 3C se observa una vista de los septos del micelio vegetativo. Finalmente, en la Figura 3D se observan núcleos del micelio vegetativo. Desde dichas figuras, se puede apreciar claramente los micelios rastreros, la presencia de núcleos al interior del micelio y de estructuras específicas como septos y entre-septos con cuatro o dos núcleos. Como se puede apreciar, se observaron micelios largos, lisos y septados, donde entre cada septo se pueden observar vahos núcleos si es que se trata de micelio primario (homocariótico), o dos núcleos si se trata de micelio secundario (dicahótico). A nivel de septo se forman estructuras en forma de clips, que dan inicio a las ramificaciones y separan los núcleos del micelio secundario. Las fluorescencias se pueden observar en los núcleos y septos, por lo que es muy fácil distinguir si existe algún otro contaminante.

Tras haber identificado la identidad de los micelios y haberlos caracterizados se continuaron con los siguientes experimentos.

EJEMPLO 3: Evaluación de condiciones de crecimiento de Ramaria sp. en medio APD

El primer objetivo de los inventores fue determinar las condiciones de cultivo que permiten el desarrollo in vitro de micelios vegetativos de hongos ectomicorrícicos, particularmente el hongo representativo, Ramaria sp.

Para ello, inicialmente se probaron distintos medios de cultivo con la finalidad de determinar posibles modificaciones que potenciaran el desarrollo de los micelios in vitro.

En primer lugar, se probó el medio Agar Papa Dextrosa (APD).

En el experimento se sembraron micelios aislados desde el ejemplo 1 , correspondientes a Ramaria sp., en placas con medio Agar Papa Dsdaextrosa (APD) suplementado con 5 mg/mL de gentamicina, al pH normal del medio (pH 5,4), y se incubaron utilizando distintas condiciones de temperatura, particularmente 10°C, 15°C, 20°C, 25°C y 30°C. Los resultados se muestran en la Figura 4A. Los inventores observaron que entre los 10°C y 15°C no se produjo crecimiento del hongo, sin embargo, entre los 20°C y 30°C sí hubo crecimiento. Asimismo, se determinó que la mejor velocidad de crecimiento en las condiciones experimentales ensayadas se obtenía a los 25°C.

Posteriormente, en base a los resultados anteriores, se evaluaron distintas condiciones de pH, particularmente pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0, realizando todas las incubaciones a 25°C (Figura 4B). Se observó que solo se producía un crecimiento del hongo entre pH 5.0 y pH 6.0, y que el mejor crecimiento fue a pH 5.5.

En todas las condiciones experimentales ensayadas, los micelios presentaron el mismo comportamiento y las mismas características morfológicas antes descritas, es decir, el micelio crece de forma rastrera, con las ramificaciones por debajo del agar, es de un color blanco/transparente y no genera micelio aéreo.

Seguidamente, se analizó el impacto del uso de distintas fuentes de carbono en el crecimiento de Ramaria flava. Para ello, se comparó el crecimiento micelial (en milímetros) de Ramaria flava en medio de cultivo APD y medio de cultivo base BAF suplementado con distintas fuentes de carbono (carboximetilcelulosa (CMC), glucosa, sacarosa y almidón), en rangos de pH entre 4.3 y 6.8 y temperaturas entre 20°C y 30°C (Figura 5).

El crecimiento micelial (en centímetros) de R. flava en medio de cultivo sólido a 20°C, solo se observó a los pH 5.3 y 5.8, teniendo el crecimiento más bajo en aquellas muestras cultivadas en medio de cultivo APD y medio base suplementado con CMC y el mayor crecimiento en las muestras cultivadas en sacarosa (Figura 5A). Por otra parte, el crecimiento (en centímetros) de Ramaria flava en medios de cultivo sólido a 25°C, solo fue visible a pH 5.3, mostrando el mayor rendimiento en el medio de cultivo base suplementado con sacarosa o con almidón como fuentes de carbono y el menor crecimiento en medio de cultivo base suplementado con CMC. Finalmente, el crecimiento (en centímetros) de R. flava en medio de cultivo sólido a 30°C, solo se observó a pH 5.3, siendo la glucosa la fuente de carbono donde se observó menor crecimiento, mientras que CMC y sacarosa fueron las fuentes de carbono que presentaron mayor crecimiento micelial en el medio de cultivo. Con la finalidad de determinar la cantidad de micelio que crece en estas condiciones, es decir, en las condiciones de incubación de 20-30°C y pH 4.3-6.8, utilizando como fuente de carbono glucosa, adicionalmente se midió el peso seco del hongo generado (Figura 5D). Para ello, una vez crecido el hongo se raspó desde la placa sobre un disco estéril de papel filtro de 10cm de diámetro aproximadamente y se secó en estufa de convección a 65°C durante 24 horas. Luego del secado se evaluó el peso en balanza analítica. Cabe señalar que, si bien se produjo crecimiento de Ramaria flava en medio de cultivo sólido APD o en un medio base suplementado con distintas fuentes de carbono, este no tuvo un buen rendimiento en términos de la biomasa obtenida, creciendo de forma rastrera y poco uniforme en la placa, lo que dificultaba la manipulación y las mediciones de la muestra.

EJEMPLO 4: Evaluación del crecimiento de Ramaria sp. en medio BAF y BAF modificado

Con la finalidad de aumentar la producción de biomasa, se ensayó el uso de un segundo medio de cultivo, el medio Biotina-Aneuñna-Ácido fólico (BAF). Asimismo, se evaluaron distintas formulaciones de medios de cultivo, en donde se utilizó la composición del medio BAF como base y se modificaron las cantidades de sus distintos componentes, según lo que se indica en la tabla 2.

Tabla 2: Composición del medio BAF base y de sus respectivas modificaciones. Tal como se puede apreciar desde la tabla 2, la primera modificación que se ensayó (BAF modificado 1 ) fue duplicar la concentración de todos los componentes del medio de cultivo. Por otra parte, en la segunda modificación (BAF modificado 2) se alteraron únicamente las concentraciones de los siguientes componentes: glucosa, peptona, extracto de levadura, ZnSC . HsO, Tiamina HCI, Biotina e Inositol. Finalmente, en la tercera modificación se utilizaron las mismas concentraciones de la segunda modificación, pero no se agregaron las vitaminas, es decir, no se agregó Tiamina HCI, Biotina, Ácido fólico ni Inositol. Los pH no fueron modificados, por lo que en todos los casos se utilizó pH 5,3 correspondiente al pH del medio base BAF. Además, dicho pH coincide con el pH al que se obtuvo mejor crecimiento en medio APD.

En el experimento se sembraron micelios aislados desde el ejemplo 2, correspondientes a Ramaria sp., en placas con medio BAF base, o con cada uno de los medios BAF modificados (1 -3), suplementados con 5 mg/mL de gentamicina, a pH 5.3, y se incubaron a 25°C.

Con el medio de cultivo base (BAF), se obtuvo presencia de micelio aéreo, sin embargo, se observó un crecimiento limitado. Con la primera modificación (BAF modificado 1 ), no se obtuvo crecimiento del micelio. En contraste, con la segunda modificación (BAF modificado 2), se obtuvo el mejor crecimiento, observándose micelio aéreo, de color blanco y con una cantidad significativa de biomasa (Figura 6). Finalmente, visualmente no se obtuvieron diferencias significativas entre el crecimiento del micelio en el medio BAF modificado 2 con respecto al medio BAF modificado 3.

Posteriormente, se midió la biomasa promedio de Ramaria flava en peso seco después de una semana de cultivo. Para ello, una vez crecido el hongo se raspó desde la placa sobre un disco estéril de papel filtro de 10cm de diámetro aproximadamente y se secó en estufa de convección a 65°C durante 24 horas. Luego del secado se evaluó el peso en balanza analítica, para posteriormente ser comparados en relación al peso seco. Cada condición experimental se realizó con 6 repeticiones (Figura 7).

La caracterización del crecimiento en términos cualitativos y cuantitativos se resume en la tabla 3. Tabla 3: Resumen cualitativo y cuantitativo del crecimiento observado en placa al cultivar micelios aislados de Ramaria flava, a pH 5,3 y a 25°C.

Al comparar la biomasa del hongo obtenida desde el crecimiento con el medio BAF modificado 2 y la del medio BAF modificado 3 (Figura 7), los resultados indicaron que no existen diferencias significativas entre aquellos tratamientos que contienen vitaminas y los que no las contienen, por lo que la influencia de las vitaminas no afectaría la producción de biomasa de Ramaria flava.

No obstante, dado que en la literatura se ha reportado que la adición de vitaminas a los medios de cultivos de hongos, entre otros beneficios, estimula la producción de diversos metabolites de interés, los inventores decidieron continuar los experimentos utilizando el medio de cultivo BAF modificado 2 para los siguientes experimentos.

Seguidamente, se evaluó el crecimiento de los micelios en placas al utilizar el medio BAF modificado 2, con variaciones en la fuente de carbono y manteniendo todos los otros componentes sin ninguna modificación (Figura 8). Las condiciones del cultivo fueron las mismas a las antes enunciadas (medio a pH 5,3 y cultivo a 25°C) y el cultivo se realizó por 7 días. A partir de los resultados, se pudo observar una clara preferencia por las fuentes de carbono glucosa y almidón (Figuras 8C y 8D, respectivamente).

Posteriormente, se repitieron estos experimentos en los mismos medios, utilizando glucosa como fuente de carbono en todos ellos, pero esta vez usando medios líquidos para facilitar la manipulación del hongo y los posteriores análisis. Cabe señalar que la única diferencia entre el medio BAF modificado 2 sólido y líquido es la presencia de agar en el primero. La Figura 9A muestra una fotografía del crecimiento micelial en medio líquido (BAF modificado 2), a pH 5,3 y a 25°C. Tal como se puede apreciar, los micelios crecen formando esferas del hongo color blanco, las cuales son visiblemente más fácil de manipular. Asimismo, cuando se comparó el crecimiento en medio líquido utilizando medio BAF modificado 2 y medio APD, se comprobó que el primero permitía la generación de micelios de mayor calidad y abundancia (Figura 9B).

Seguidamente, para poder comprobar que el cultivo en medio líquido era más apropiado y óptimo, se comparó el crecimiento micelial de Ramaria flava, midiendo la producción de biomasa en términos de peso seco (g), utilizando medio de cultivo APD sólido, Biotina-Aneurina-Ácido fólico modificado 2 (BAF modificado 2) sólido, APD líquido, o BAF modificado 2 líquido, todos ensayados a pH 5,3 y a 25°C.

Tal como se puede observar en la Figura 10, resulta evidente que el medio líquido es mucho más conveniente para la producción de biomasa de Ramaria sp., y que el medio BAF modificado 2 nuevamente resulta muy superior al medio APD tanto en medio sólido como en medio líquido. En consecuencia y si bien el experto en la técnica podría decidir utilizar medio sólido, teniendo resultados favorables, los inventores decidieron continuar los ensayos en medio líquido con el fin de obtener mayor biomasa y facilitar la manipulación del hongo.

Ejemplo 5: Evaluación de condiciones de crecimiento de Ramaria sp. in vitro en medio BAF modificado

Con la finalidad de aumentar la cantidad de biomasa y la velocidad de crecimiento del hongo, se repitieron los experimentos del ejemplo 4, utilizando el medio de cultivo BAF modificado 2, esta vez como medio líquido, y evaluando distintas fuentes de carbono, condiciones de pH y temperaturas de incubación.

Particularmente, se analizó el efecto de cuatro fuentes de carbono utilizadas como suplemento del medio de cultivo (carboximetilcelulosa (CMC), glucosa, sacarosa y almidón), cinco pH (4,8, 5,3, 5,8, 6,3 y 6,8) y tres temperaturas distintas (20°C; 25°C; y 30°C) en el crecimiento del hongo y su respectiva producción de biomasa. Cabe señalar que previo a este análisis se realizó uno similar con el fin de descartar temperaturas inferiores a 20°C y superiores a 30°C, a las cuales no se obtuvo crecimiento del hongo.

Se realizaron cultivos líquidos donde se incubó el hongo por una semana en 100mL del medio BAF modificado 2, cambiando las condiciones antes mencionadas (pH, temperatura y en los componentes se cambió la fuente de carbono) según correspondiera y se midió la biomasa promedio de Ramaria flava en peso seco (g/mL), después de una semana de cultivo. Cada tratamiento se realizó con 5 repeticiones. Cabe señalar que la inoculación en medio líquido se realiza desde placas de medio sólido, desde donde se extraen cuadrados de 1 cmx1 cm del medio sólido que contiene el hongo (aproximadamente 10 mg de hongo fresco recién sacado de la placa), que luego se colocan a crecer en el frasco con medio de cultivo líquido.

Una vez finalizado el ensayo, se filtró y seco los micelios, los cuales fueron comparados en relación al peso seco. Obtenido los datos, estos fueron analizados mediante un ANOVA de 3 factores, bajo (o sobre) la interacción de las tres temperaturas, cuatro fuentes de carbono y cinco valores de pH (Figuras 11 A-C).

La evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 20°C (Figura 11 A), evidencia que la mayor producción de biomasa de Ramaria sp. se obtuvo a pH 5,3 utilizando sacarosa, y a pH 4,8 y 5,3 utilizando glucosa como fuente de carbono, mientras que la menor producción se obtuvo a pH 6,3 utilizando almidón como fuente de carbono.

Por otra parte, la evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 25°C (Figura 1 1 B), muestra que la mayor producción de biomasa de Ramaria sp. se obtuvo a pH

4.8 utilizando glucosa como fuente de carbono, obteniéndose aproximadamente 0,75 gramos de materia seca, seguido por almidón a pH 4,8, 5,3 y 5,8 con una producción aproximada de 0,7 gramos de materia seca. En contraste, la menor producción a 25°C se obtuvo a pH 5,3 y

5.8 utilizando CMC como fuente de carbono, con una producción aproximada de 0,5 gramos de materia seca.

Finalmente, a partir de la evaluación de las cuatro fuentes de carbono y los cinco pH a 30°C (Figura 11 C), se observa que la mayor producción de biomasa de Ramaria sp. se obtuvo a pH 6,8 utilizando almidón como fuente de carbono, con lo cual se produjo aproximadamente 0,71 gramos de materia seca; mientras que el menor crecimiento se observó utilizando sacarosa como fuente de carbono en todos los pH evaluados.

En conclusión y a partir de la figura 1 1 A-C, se puede observar que, la formulación de BAF modificado 2 sorprendentemente permite el crecimiento de micelios aislados in vitro para todas las condiciones ensayadas, es decir, utilizando diversas fuentes de carbono, en un rango amplio de pH (4, 8-6, 8) y también en un rango de temperatura relevante (20-30°C).

Si bien en todas las condiciones experimentales se logró producir biomasa de Ramaria flava, las mejores condiciones de cultivo in vitro se obtuvieron utilizando glucosa como fuente de carbono a 25°C, a pH 4,8; utilizando sacarosa como fuente de carbono, a 20°C y a pH 5,8; y utilizando almidón como fuente de carbono, a 30°C y a pH 6,8.

Al momento de elegir la mejor condición experimental para el aislamiento y la propagación del micelio in vitro, se tomaron en cuenta las condiciones de crecimiento más similares a las naturales, junto con otros beneficios adicionales. De ese modo, considerando que los hongos ectomicorrícicos tienen un carácter acidóf ilo cuando crecen en cultivos puros, es que para su multiplicación se eligieron condiciones de pH desde 5,3 hacia abajo. En consecuencia, el cultivo de R. flava a 25°C y pH 4,8 en glucosa entregaría las mejores condiciones necesarias la propagación del micelio in vitro, de la manera más similar a las condiciones naturales de cultivo de dicho hongo y generando la mayor cantidad de biomasa. No obstante, usando el medio BAF modificado 2 de la invención, cualquiera de las otras condiciones ensayadas se podría utilizar para el aislamiento y propagación de micelios de Ramaria sp. in vitro.

Además, se ha reportado que la influencia de compuestos como el ácido oxálico, induce la formación de carpóforos en setas como Lactaríous sp. (micorrizas) y Pleurotos ostreatus (saprofitos). Estos compuestos están disponibles en el suelo y sustratos a pH entre 4,0 y 5,0, por lo que la producción de biomasa en estas condiciones aumentaría la probabilidad de inducir la formación de carpóforos en condiciones controladas. Por otro lado, el uso de azúcares simples como la glucosa, complementando el medio como fuente de carbono para el crecimiento micelial, facilita la g lucólisis y por tanto la formación de moléculas de ATP. En vista de ello, se determinó que la mejor alternativa para la producción de biomasa in vitro era utilizando los medios de cultivo BAF modificados según la invención, con glucosa como fuente de carbono, y realizando los cultivos a una temperatura de 25°C y a pH 4.8.

EJEMPLO 6: Evaluación del porcentaje de colonización del micelio en diferentes sustratos y obtención de semillas del hongo.

Con la finalidad de identificar el sustrato en el cual se podrían producir semillas de hongos Ramaria sp., se evaluó el porcentaje de colonización del micelio utilizando diez sustratos distintos: aserrín, arroz, trigo, biofertilizante comercial (Biofert®, Empresa Rosario S.A.), aserrín con arroz, aserrín con trigo, aserrín con biofertilizante comercial, arroz con trigo, arroz con biofertilizante comercial y trigo con biofertilizante comercial (Figura 12).

Inicialmente se realizó el acondicionamiento de los sustratos de propagación. Para ello, se pesaron 250 g de cada uno de los distintos sustratos arriba indicados, los cuales fueron lavados con 300 mL de agua destilada estéril por 24 horas. Pasado este tiempo, cada uno de los sustratos se dispersó en bolsas de polipropileno de 250 g y se humedeció rociándolos con una solución de 100mL de medio de cultivo BAF suplementado con glucosa 20g/L a pH 4.8. Las bolsas fueron cerradas con tubos Falcon de 50mL sin fondo, con la finalidad de dividir la bolsa en dos compartimientos (sustrato y abertura de la bolsa) separados por el tubo en donde se coloca algodón hidrófobo. Posteriormente, fueron esterilizadas a 121 °C.

Para la inoculación del sustrato, se preparó una solución del hongo en 200mL de agua destilada estéril, para lo cual se utilizaron dos placas, producidas de acuerdo al ejemplo 4, es decir, en condiciones de crecimiento a 20°C, pH 5,3 y medio de cultivo suplementado con glucosa, que tuvieran crecimiento máximo; en donde el crecimiento máximo se obtiene cuando el micelio alcanza el borde de las placas Petri que tienen un diámetro de 15 cm (lo que se obtiene en torno a los 5 días y corresponde a alrededor de 1 gramo de micelio fresco). Para hacer la solución, se raspó el micelio de la placa con bisturí, para sacar todo el micelio aéreo disponible.

Esta solución fue inyectada a través del tubo cierre de las bolsas, sobre cada uno de los sustratos, tras lo cual se homogenizaron las muestras utilizando agitación orbital, durante 24 horas a 150 rpm y a 25°C.

Finalmente, se analizó la colonización de Ramaria flava en los distintos sustratos y mezclas de ellos, evaluando tres temperaturas de incubación (20°C, 25°C y 30°C) y tres porcentajes de humedad (0%, 50% y 80%). El porcentaje de colonización en cada sustrato se evaluó tomando como 100% el total de colonización del sustrato (250g de sustrato), cuya superficie aproximada es de 50 cm. Las muestras fueron evaluadas durante un mes, hasta que se completó la colonización de los primeros sustratos (Figura 12). Los datos se analizaron mediante ANOVA en el programa estadístico JMP donde se observó que existían diferencias significativas entre todas las condiciones ensayadas (p<0,05).

Los inventores encontraron que el mayor porcentaje de colonización del micelio a 20 °C, en donde se observó aproximadamente un 100% de colonización en el sustrato, se producía a 50% de humedad y utilizando arroz como sustrato, mientras que en los demás sustratos la colonización solo alcanzó un máximo de alrededor de un 80% en un mes de evaluación; ese es, por ejemplo, particularmente el caso del aserrín a una humedad del 50% (Figura 12A). Por otra parte, al evaluar la colonización del micelio a 25 °C, en general se observó un bajo porcentaje de colonización, el cual, en la mejor condición experimental, es decir utilizando arroz como sustrato y una humedad de 50%, alcanzó en torno a un 35%. Dicho resultado fue seguido por la condición experimental que utilizaba una mezcla de aserrín con arroz, a una humedad del 50%, en donde se obtuvo alrededor de un 30% de colonización. A 25°C también se observó crecimiento o colonización del sustrato a 0% de humedad, sin embargo, dado que en dicha condición hubo menos de un 30% de colonización durante el mes de evaluación, se concluyó que la mejor condición evaluada era a un 50% de humedad (Figura 12B).

Finalmente, al evaluar la colonización del micelio a 30°C, el mayor porcentaje de colonización se observó a 50% de humedad utilizando arroz como sustrato (en torno a un 60% de colonización) y a 0% de humedad utilizando arroz como sustrato (alrededor de un 50% de colonización). Cabe señalar que a 30°C se observó que no había colonización en muchos de los sustratos probados (Figura 12C).

A partir de estos resultados, en términos generales, no pudo observarse la colonización de R. flava utilizando un 80% de humedad, debido a la proliferación de microorganismos contaminantes (hongos y levaduras) que inhibían el crecimiento del hongo de interés. Por otra parte, al utilizar el biofertilizante comercial (biofert®) como sustrato por sí solo, no se pudo observar crecimiento del micelio en ninguna de las condiciones experimentales. De hecho, utilizar dicho biofertilizante en combinación con otros sustratos en los cuales sí se observaba colonización por sí solos, generó que o disminuyera o no se observara colonización del hongo en las mezclas de sustratos (Figuras 12A-C).

Finalmente, considerando los resultados anteriormente detallados, se concluyó que la mejor condición experimental era utilizar arroz como sustrato para la formulación de la semilla del hongo, incubando la muestra a 20°C y a 50% de humedad, puesto que se observaba el mejor porcentaje de colonización y en consecuencia el mejor rendimiento de producción de semillas del hongo.

Luego se realizaron nuevas inoculaciones siguiendo las recomendaciones de los resultados obtenidos, pero en vez de bolsas se utilizaron frascos con semillas de arroz inoculadas (Figura 13).

Una vez conseguida la colonización total del frasco con arroz inoculado, se pudo observar sobre la superficie del frasco, una capa gruesa de micelio blanco que cubre totalmente el arroz inoculado, obteniéndose con esto, lo que se conoce como “semillas del hongo”, el cual será utilizado como inoculo para los siguientes ensayos (Figura 13).

Ejemplo 7: Optimización del método de producción de semillas del hongo.

Con la finalidad de continuar optimizando la producción de “semillas del hongo” se evaluaron además distintas condiciones de incubación del sustrato. Específicamente se evaluó la incubación en tres etapas en donde la temperatura y la humedad fueron modificadas y comparadas con la incubación en condiciones fijas, es decir con una temperatura y humedad fijas. En este ensayo, las placas fueron incubadas en primer lugar a 20°C y 45% de humedad por 14 días, luego, la temperatura y humedad se elevaron a 25°C y 80%, respectivamente, por 6 días, para finalmente disminuir la temperatura y humedad a 10°C y 30%, respectivamente, por 48 horas, resultando en un total de 22 días para la colonización completa del sustrato.

Adicionalmente, y con la finalidad de optimizar el método, las condiciones variables antes indicadas se compararon con la condición de incubación fija utilizando distintos sustratos: trigo, biofert®, arroz, aserrín y combinaciones de los mismos. La Figura 14 muestra los resultados en A) trigo/biofert®; B) biofert®; C) arroz; D) trigo; E) arroz/biofert®; F) arroz/trigo; G) aserrín; H) aserrín/arroz; I) aserrín/biofert®; y J) aserrín/trigo.

Como se puede observar en la Figura 14, independiente del sustrato, se obtiene un mejor y mayor crecimiento del micelio en la incubación en tres etapas, en comparación con la incubación en condiciones fijas.

En consecuencia, los inventores observaron que, sorprendentemente, un cambio en las condiciones de incubación tuvo numerosas ventajas por sobre la incubación en condiciones fijas. En primer lugar, la producción del micelio se produce en menos tiempo, lo que resulta evidente, por ejemplo, desde las Figuras 14A, 14C, 14F y 14H. En segundo lugar, es evidente que en condiciones variables o en tres etapas, se produce micelio puro, ya que en las condiciones variables no se observa contaminación, mientras que en la incubación en condiciones fijas, se produce contaminación por levadura. A modo de ejemplo de esto último, en la Figura 14C (sustrato arroz) se observa que el micelio crecido a humedad y temperatura constantes, alrededor de los 15 días, comienza a desarrollar contaminación por levaduras, lo que ciertamente es un efecto indeseable al momento de producir micelios y aún más semillas de hongos destinadas a producir carpóforos. Finalmente, otra de las ventajas significativas de la incubación en condiciones variables es que se observa una producción homogénea del micelio en el sustrato.

Resulta particularmente favorable el resultado obtenido utilizando arroz como sustrato, en donde se puede observar la colonización completa del sustrato aproximadamente a los 20 días. Cabe señalar que esto representa una ventaja adicional a las antes discutidas, ya que la colonización total del micelio en un determinado sustrato y la producción del micelio aéreo es importante ya que autores como Ohta y Fujiwara, 1998, han descrito que a mayor producción de micelio aéreo es mayor la factibilidad de producir carpóforos.

Los ejemplos previamente detallados se refieren a realizaciones preferidas de la invención que no limitan de modo alguno el alcance de la misma.

Diferentes opciones descritas para características técnicas diferentes pueden combinarse entre sí, o con otras opciones conocidas para una persona normalmente versada en la materia, sin que esto limite el alcance de la presente solicitud.

En el contexto de la presente solicitud, sin que esto limite el alcance de la misma, se entenderá como “al menos un” a uno o más de los elementos a los que se hace referencia. En consecuencia, el número de elementos a los que se haga referencia no limita el alcance de la presente solicitud. Adicionalmente, en caso de que se proporcione más de un elemento, dichos elementos pueden o no ser idénticos entre sí, sin que esto limite el alcance de la presente solicitud.

Para subsanar el problema planteado, se presentan formulaciones de medios de cultivos específicos, y métodos que las emplean, para cultivar hongos silvestres, particularmente hongos ectomicorrícicos, preferentemente hongos Ramaria sp. Las formulaciones y los métodos de la presente invención posibilitan la producción de dichos hongos en ambientes controlados, a través de técnicas que permiten el desarrollo y la propagación de micelios de hongos ectomicorrícicos in vitro, de manera independiente de un hospedero, de manera continua durante el año y la producción de semillas de estos hongos que posteriormente se pueden utilizar para la fructificación de los mismos.