DISPOSITIVO Y PROCEDIMIENTO PARA LA MEJORA DE LA ESTABILIDAD Y EL LÍMITE DE DETECCIÓN DE SENSORES DE ONDA ACÚSTICA

Sector de la técnica

Destinado al sector industrial fabricante de dispositivos de medición basados en cristales de cuarzo.

Antecedentes

Los resonadores acústicos, y entre ellos los basados en cristales de cuarzo piezoeléctrico, son dispositivos que se utilizan para medir de forma precisa tanto variaciones en la masa por unidad de superficie como las propiedades viscoelásticas y cambios conformacionales de los medios depositados sobre ellos, a través de los cambios que sufre la frecuencia de resonancia compleja de dichos cristales operando como resonadores.

Estos dispositivos son ideales para monitorizar procesos fisicoquímicos in situ, pero las condiciones ambientales como temperatura, humedad, presión, velocidad de flujo pueden producir derivas y variaciones en la respuesta del sensor. Por este motivo, es necesario mantener constantes todos aquellos factores que pudiesen afectar a la estabilidad del sensor enmascarando las señales de interés. Esto no es tarea fácil, y suele incrementar la complejidad y el coste de los dispositivos de ensayo, impidiendo en muchas ocasiones el desarrollo de instrumentos ligeros y portátiles que puedan ser utilizados en aplicaciones fuera del laboratorio.

Por ejemplo, en el caso de la temperatura, se emplean sistemas de control térmico activo, basados normalmente en la inclusión de elementos termorreguladores, como células Peltier, para controlar la temperatura de la muestra y del sensor durante el experimento.

Numerosos autores han tratado de buscar soluciones alternativas al uso de sistemas de control costosos y complejos. Una de las primeras aproximaciones se basó en el uso de dos resonadores, uno de los cuales se emplea como referencia ( Mecea , V. M.; Carlsson, J. O.; Heszler, P.; Bártan, M. Development and Testingof a High TemperatureQuartzCrystalMicrobalance. Vacuum 1995, 46 (7), 691-694. https://doi.org/10.1016/0042-207X(94)00147-2). Si se restan las variaciones en la frecuencia de ambos resonadores, es posible cancelar en efecto de las fluctuaciones de la temperatura en la medida. Este procedimiento funciona bien cuando se cumplen dos condiciones: que la temperatura sea igual en ambos resonadores y que la respuesta de ambos resonadores frente a la temperatura coincida. Estas dos condiciones no siempre se cumplen. En caso de aplicar este procedimiento, es necesario un adecuado diseño térmico del instrumento y también de los resonadores.

Rahtu et. al. ( Rahtu , A.; Rítala, M. Compensaron of Temperature Effects in Quartz Crystal Microbalance Measurements. Appl. Phys. Lett. 2002, 80 (3), 521-523. https://doi.Org/10.1063/1.1433904) comparan el funcionamiento del procedimiento anterior con un enfoque alternativo basado en modelar la variación de frecuencia producida por los cambios de temperatura mediante un polinomio de tercer grado. A partir de un ajuste numérico de los datos experimentales a dicho modelo, se corrigen los efectos térmicos sin necesidad de incluir un sensor adicional que sirva como referencia. Los resultados ofrecidos con este procedimiento son comparables a los obtenidos empleando el sensor de referencia. Esta aproximación solamente es válida para variaciones monótonas de la temperatura y puede tener problemas de convergencia para experimentos con una duración prolongada (mayor de 15 minutos). Además, es necesaria la inclusión de un sensor de temperatura en el dispositivo.

Otros autores ( Pierce , D. E. A TemperaturelnsensitiveQuartzMicrobalance. IEEE Trans. Ultrason. Ferroelectr. Freq. Control 1998, 45 (5), 1238-1245. https://doi.org/10.1109/58.726449) proponen cancelar el efecto de la temperatura empleando para ello resonadores acústicos de cuarzo en corte SC. Estos resonadores están específicamente diseñados para compensar su respuesta frente a la tensión mecánica y además su respuesta frente a la temperatura no depende de la velocidad de variación de ésta. Midiendo simultáneamente dos modos armónicos del resonador y suponiendo un régimen de trabajo gravimétrico, es posible calibrar la respuesta del cristal frente a la temperatura sin necesidad de incorporar un termómetro externo. La principal desventaja de los resonadores en corte SC es su mayor coste debido al complejo proceso de doble rotación necesario para su fabricación. Asimismo, la compensación térmica basada en este procedimiento no se aplica a la medida de disipación ni a experimentos donde el espesor de la capa depositada sobre el sensor o sus propiedades viscoelásticas o hidrodinámicas no aseguren un régimen de trabajo gravimétrico. Además de la temperatura, otros factores como presiones y tensiones mecánicas debidas a la celda de medida, envejecimiento del resonador, vibraciones externas, adsorción superficial no específica, presencia de impurezas o dislocaciones en el cuarzo o humedad pueden afectar a la estabilidad de la frecuencia de resonancia y el factor de calidad, dificultando la medida y degradando el límite de detección de la técnica.

En estos casos, el estado de la técnica refiere diferentes procedimientos que tratan de corregir la deriva de manera “ciega”, independientemente del mecanismo que la produzca en sensores individuales. La mayoría de ellos se basan en la calibración del sensor a partir de una muestra de referencia que se emplea para compensar la línea base aplicando una corrección aditiva o multiplicativa a posteriori. Estos procedimientos no se pueden aplicar en tiempo real e introducen la necesidad de una fase de calibración en la medida. Otros procedimientos se basan en el análisis frecuencial para filtrar de la señal de interés las componentes debidas a ruido electrónico o derivas aplicando promediados, suavizados o filtrados. Suelen funcionar bien para reducir las fluctuaciones de alta frecuencia (ruido), pero no dan buenos resultados en el caso de señales de baja frecuencia (deriva), cuyo espectro suele solaparse con las componentes de interés, lo que dificulta su filtrado.

Otros autores han propuesto el uso de herramientas estadísticas para mejorar la estabilidad frecuencial. Uno de estos procedimientos es el conocido como Análisis de componentes principales o en sus siglas en inglés (Principal Component Analysis, PCA). Se basa en la reducción dimensional de un gran conjunto de datos para resaltar sus componentes estadísticamente más significativas, que idealmente se relacionan con las señales de interés, mientras que se eliminan las componentes menos significativas, que se podrían asociar con inestabilidad frecuencial. Recientemente, se ha usado el procedimiento PCA para mejorar el límite de detección ( Corradi , £.; Agostini, M.; Greco, G.; Massidda, D.; Santi, M.; Calderisi, M.; Signore, G.; Cecchini, M. An Objective, Principal-Component-Analysis (PCA) Based, Method Which Improves the Quartz-Crystal-Microbalance (QCM) Sensing Performance. Sensors Actuators, A Phys. 2020, 315, 112323. https://doi.Org/10.1016/j.sna.2020.112323) de sensores acústicos en medidas con múltiples armónicos. Suponiendo un régimen de trabajo gravimétrico, las medidas de todos los modos se reducen a una medida individual con un límite de detección mejorado. También se ha reportado el uso combinado de PCA y redes neuronales para eliminar el efecto de la humedad en la medida de tolueno gas (, Mumyakmaz , B.; Ozmen, A.; Ebeoglu, M. A.; Ta§altin, C.; Gürol, I. A Studyon the Developmentof a Compensation Method forHumidityEffect in QCM Sensor Responses. Sensors Actuators, B Chem. 2010, 147 (1), 211-282. htps://doi.org/10.1016/j.snb.2010.03.019)rea\ zada por un conjunto de sensores QCM. Debido a su alto coste computacional, estos procedimientos estadísticos basados en PCA se suelen emplear para la clasificación de medidas y no para la corrección de señales en tiempo real.

No son conocidas por tanto invenciones y procedimientos que resuelvan ventajosamente el problema técnico como la invención preconizada.

Objeto

Proporcionar un dispositivo y procedimiento para la medición mediante sensores de onda acústica que permitan una medición en tiempo real y que ofrezcan una estabilidad frecuencial mejorada. Proporcionar una medida que no se vea alterada por las condiciones ambientales. Obtener un procedimiento y dispositivo de menor complejidad y coste.

Descripción detallada de la invención

La presente invención propone un procedimiento y un dispositivo para mejorar la estabilidad y el límite de detección (LoD) de las microbalanzas de cristal de cuarzo también llamados sensores QCM, resolviendo uno o más de los inconvenientes expuestos anteriormente.

El procedimiento explota el elevado grado de correlación existente entre dos resonadores acústicos integrados en un mismo substrato piezoeléctrico (Monolithic Quartz Crystal Microbalance, MQCM) sometidos a condiciones ambientales (temperatura, humedad, flujo, presión, ...) semejantes. Uno de los resonadores, al que denominaremos sensor, se pone en contacto con la muestra que se pretende analizar mientras que el otro, al que denominaremos referencia, se mantiene aislado de ésta. Ambos resonadores deben encontrarse idealmente muy próximos.

Denominaremos x(t) a la señal en el dominio del tiempo (ya sea de frecuencia de resonancia o de disipación) medida en el sensor e y(t) a la misma señal en el dominio del tiempo medida en el resonador de referencia. El resultado proporcionado por este procedimiento será una señal corregida a la que denominaremos z(t), con una mejora en su estabilidad con respecto a la señal del sensor x(t), tanto para tiempos de integración largos (deriva) como cortos (ruido).

El procedimiento propuesto es capaz de eliminar de la medida los factores comunes a ambos resonadores, que están relacionados con los factores externos ajenos a la muestra. De esta manera, se minimiza el impacto de las condiciones ambientales en la estabilidad de la medida, tanto en tiempos de integración cortos (ruido) como en tiempos largos (derivas). Al basarse en un análisis diferencial que mide la correlación temporal entre la señal de referencia y la del sensor, es muy robusto frente a pequeñas diferencias en la respuesta absoluta de los resonadores a la magnitud o magnitudes externas que están afectando a la medida.

El procedimiento proporciona una medición en tiempo real para la caracterización simultánea de un conjunto de sensores QCM integrados en un sustrato monolítico durante la monitorización de un proceso químico o físico cuyo resultado puede evaluarse en términos de la variación de masa y/o de la modificación de las propiedades geométricas, hidrodinámicas o viscoelásticas de un recubrimiento depositado sobre un sensor piezoeléctrico enfrentado a un medio fluido o gaseoso. El procedimiento también puede ser aplicado en la caracterización de diferentes modos armónicos de resonancia en un mismo resonador acústico (integrado en una matriz de sensores MQCM) durante dicho proceso experimental.

Para la aplicación del procedimiento no se requiere el uso de medidores externos para determinar la humedad, temperatura, presión, vibración, etc. Corrige no solamente uno de estos factores sino el efecto simultáneo de todos ellos en la respuesta del sensor. Los cálculos necesarios para su implementación tienen un coste computacional reducido, pudiendo ser realizados por un microprocesador de bajo coste en tiempo real.

El procedimiento funciona tanto para el régimen gravimétrico como para experimentos donde las propiedades viscoelásticas o hidrodinámicas no son despreciables.

El procedimiento propuesto no necesita del empleo de una muestra de referencia para la corrección de inestabilidades en la línea base.

Durante el análisis, el dispositivoque implementa el procedimiento monitoriza la frecuencia de resonancia y el factor de disipación de ambos resonadores en tiempo real. El dispositivo comprende:

- un interfaz mecánico y electrónico donde se puede insertar fácilmente un array monolítico compuesto por un conjunto de varios sensores QCM;

- un sistema microfluídico que permite dispensar la muestra sobre la superficie de los sensores y que aísla dicha muestra de los contactos eléctricos de los resonadores; - una fuente de señal de frecuencia determinada, de gran estabilidad en frecuencia y bajo ruido de fase que proporciona una señal entre 1 y 300 MHz;

- un subsistema de síntesis de frecuencia;

- un subsistema de multiplexado que permite la excitación/interrogación de un resonador concreto del array;

- un subsistema de acondicionamiento y de adquisición de señal;

- un subsistema de control térmico que permite variar la temperatura del array entre 0 y 70 °C.

- un subsistema de control basado en el uso de circuitos integrados digitales que permita el control coordinado de los diferentes subsistemas que componen el dispositivo.

-un subsistema de procesado compuesto por una unidad de cálculo de coma flotante y las unidades de memoria necesarias para almacenar los resultados del cálculo. Dicho subsistema es capaz de calcular la frecuencia serie dinámica y el factor de disipación del resonador piezoeléctrico que está siendo interrogado a partir de los datos proporcionados por el subsistema de adquisición.

El procedimiento caracteriza la respuesta resonante de un sensor, la frecuencia de resonancia y las pérdidas (factor de Calidad), y comprende las siguientes operaciones:

1.- Medición, con un período de muestreo de entre 0.01 y 1 segundos, de la frecuencia de resonancia y las pérdidas (factor de Calidad) de los resonadores (sensor y referencia) mediante el dispositivo referido anteriormente, capaz de monitorizar la admitancia eléctrica de un conjunto de sensores QCM integrados monolíticamente en un sustrato común de cuarzo en corte AT.

2.- Inyectar la muestra sobre la superficie del resonador que actúa como sensor con una velocidad de flujo comprendida entre 1 y 200 ul/min.

3.- Aplicar la transformada wavelet de tipo Daubechies de nivel 2 o superior a las señales temporales x(t) y y(t). Esta transformada generará varias series de coeficientes (componentes) para cada señal: una componente de aproximación y tantas componentes de detalle como niveles, /, se hayan configurado. Esta serie de coeficientes se calcularán en el subsistema de procesado del dispositivo y se almacenarán en su memoria. La nomenclatura que utilizaremos para referirnos a estas componentes de la transformada wavelet será X _A (n),X _D1 (n),X _D2 (n), ...,X _m (n) para las componentes de la señal del sensor y Y _A (n), Y _D1 (n), Y _D2 (n), ..., Y _m (n) para las componentes de la señal de referencia. En el dominio transformado, n indica el número de la muestra. Cada una de estas componentes captura el comportamiento de la señal en un determinado sector del dominio tiempo-frecuencia y tiene una longitud distinta.

4. -Aplicar un proceso en el que todas las componentes wavelets cuya magnitud sea inferior a un cierto umbral, al que denominaremos Th, serán eliminadas por no suponer una contribución significativa a la energía total de la señal, o por presentar características de ruido aleatorio gaussiano. Las componentes tratadas con el umbral Th se denominan X _A (n),X _D1 (n),X _D2 (n), ...,X _m (n) para el sensor y Y _A (n), Y _D1 (n), Y _D2 (n), - ¾¡(n)para la referencia. Estas componentes se calculan en el subsistema de procesado del dispositivo y se almacenan en su memoria. Este procedimiento contribuye significativamente a eliminar el ruido de alta frecuencia de la señal de frecuencia de resonancia y disipación adquirida por el dispositivo.

5.- Calcular la derivada numérica de las componentes tratadas con el umbral Th a las que nos referiremos referiremos como X ^r _A {n),X ^r _D1 {n),X ^r _D2 {n), ...,X ^r _m {n) para el sensor y Y' _A (n),Y' _D1 (n), Y' _D2 (n), ..., Y' _Di (n) para la referencia. Estas derivadas se calculan en el subsistema de procesado del dispositivo y se almacenan en su memoria. El procedimiento parte de la hipótesis de que, aunque los valores absolutos de la magnitud de las componentes puedan diferir, las variaciones temporales de éstas están linealmente correladas en el caso de que se deban a factores comunes a los dos resonadores.

6.- Calcular el coeficiente de correlación R entre cada muestra n de cada una de las derivadas de las componentes tratadas con el umbral Th del sensor y su contraparte en la señal del resonador de referencia. Se considera una ventana de w muestras alrededor de cada muestra n para el cálculo. A partir del coeficiente de correlación R, se obtendrá también el valor P consignado que establece si la hipótesis de no correlación es estadísticamente significativa. Estos cálculos se realizan en el subsistema de procesado del dispositivo y sus resultados se almacenan en su memoria.

7. -Calcular la derivada temporal corregida de las componentes de la transformada Wavelet de la nueva señal corregida z(t), a las que nos referimos como Z' _A (n),Z' _D1 (n),Z ^r _D2 (n), ...,Z' _Di (n).S las componentes están relacionadas estadísticamente de un modo significativo (P<5%), la nueva derivada de la componente corregida se calcula como:

Z' _K (n) = X' _K (n) - a - bY' _K (n)

Siendo k- A,D1,D2, ..., DI ya, b los coeficientes que minimizan el ajuste lineal entre X' _K e Y' _K en la ventana de w muestras centrada en la muestra n. Si el coeficiente de correlación calculado no indica una alta probabilidad de correlación (P> 5%), %), la nueva derivada de la componente corregida se calcula como:

X' K(J ⁼ X' K(J — Y' k( ^h )

Estos cálculos se realizan en el subsistema de procesado del dispositivo y sus resultados se almacenan en su memoria.

8.- Reconstrucción de los coeficientes Wavelet de la señal corregida z{t),Z _A (n),Z _D1 (n),Z _D2 (n), ...,Z _m (n). por medio de integración numérica. Dicho cálculo se realiza en tiempo real en el subsistema de procesado del dispositivo.

9.- Recuperación de la señal temporal mediante el cálculo de la transformada Wavelet inversa. Dicho cálculo se realiza en tiempo real en el subsistema de procesado del dispositivo.

Breve descripción de los dibujos

Para la mejor comprensión de cuanto queda descrito en la presente memoria, se acompañan unos dibujos en los que, a título de ejemplo, se representa una relación de las figuras de la invención propuesta.

En la figura 1 puede verse un array MQCM en el que se señala dos resonadores, uno se emplea como sensor (2), mientras que otro se emplea como referencia (1).

La figura 2 muestra un diagrama de bloques del procedimiento preconizado.

Modo de realización preferida

Se cita a modo de ejemplo una forma de realización preferida siendo independiente del objeto de la invención los materiales empleados en su fabricación, así como los procedimientos de aplicación y todos los detalles accesorios que puedan presentarse, siempre y cuando no afecten a su esencialidad.Este modo preferente de realización refleja la materialización y corporeidad de la invención especificando detalles que ayuden a entender ésta.

El procedimiento y el dispositivo propuestos mejoran la estabilidad y el límite de detección (LoD) de los sensores QCM. Específicamente, el procedimiento está basado en el elevado grado de correlación existente entre los resonadores acústicos integrados en un mismo substrato piezoeléctrico (Monolithic Quartz Crystal Microbalance, MQCM). Estos resonadores son del tipo High Fundamental Frequency Quartz Crystal Microbalance (HFFQCM) y se caracterizan principalmente por su robustez mecánica, su elevada frecuencia y su reducido tamaño. Su implementación se basa en la tecnología “inverted-mesa” y sus frecuencias típicas de operación van de 30 MHz a 300 MHz. La superficie típica de estos resonadores oscila entre 0.3 y 4 mm ² . Uno o varios de los resonadores, a los que denominaremos sensores, se ponen en contacto con la muestra que se pretende analizar mientras que otros, a los que denominaremos referencias, se mantienen aislados de ésta. Como se observa en la Gráfica 1 (b), cuando ambos resonadores están sometidos a condiciones ambientales semejantes (en este caso velocidad de flujo), existe una correlación notable en las derivadas de las componentes de aproximación del sensor 0 _A (n)) y la referencia (Y' _A (n)). En cambio, cuando se inyecta una muestra en el sensor, las derivadas de las componentes difieren como se puede apreciar en la Gráfica 1 (a). La base del procedimiento propuesto es la eliminación de la fracción de señal común a los coeficientes de las componentes wavelets de la señal y la referencia, puesto que estas variaciones comunes se deberán a efectos externos no deseados.

El dispositivo propuesto tiene la capacidad de monitorizar la frecuencia de resonancia y las pérdidas (factor de Calidad) de los resonadores (sensor y referencia) a partir de la medida de su admitancia eléctrica. Dicho dispositivo comprende:

- un interfaz mecánico y electrónico donde se puede insertar fácilmente un array monolítico compuesto por un conjunto de varios sensores QCM;

- un sistema microfluídico que permite dispensar la muestra sobre la superficie de los sensores y que aísla dicha muestra de los contactos eléctricos de los resonadores;

- una fuente de señal de frecuencia determinada, de gran estabilidad en frecuencia y bajo ruido de fase que proporciona una señal entre 1 y 300 MHz;

- un subsistema de síntesis de frecuencia;

- un subsistema de multiplexado que permite la excitación/interrogación de un resonador concreto del array;

- un subsistema de acondicionamiento y de adquisición de señal; - un subsistema de control térmico que permite variar la temperatura del array entre 0 y 70 °C.

Asimismo, el dispositivo dispone de un subsistema de control y un subsistema de procesado que permite la implementación en tiempo real de todos los algoritmos y cálculos necesarios descritos.

La gráfica 2 muestra un ejemplo de aplicación del procedimiento. El experimento consiste en el paso de agua bidestilada con un caudal controlado de 20 mI/min sobre la superficie de dos resonadores (sensor y referencia) integrados en un array MQCM con una frecuencia de resonancia nominal de 50 MHz. La superficie de los resonadores es de oro y ha sido tratada previamente con un proceso de limpieza basado en la aplicación de rayos UV y ozono para eliminar las posibles impurezas que puedan afectar a la línea base. El dispositivo descrito se emplea para monitorizar el experimento. Dicho dispositivo se emplea también para controlar el caudal de la muestra y la temperatura en el array. Para emular la influencia de parámetros externos se modifica la temperatura del dispositivo tal y como muestra la gráfica 2 (c). En la gráfica 2 (a) y en la gráfica 2 (b), la frecuencia de resonancia y la disipación se ven afectadas tanto en el sensor (traza con marcadores circulares blancos) como en la referencia (traza con marcadores circulares negros). Cuando se aplica el procedimiento de compensación propuesto, se obtiene como resultado (traza con marcadores cuadrados negros), una señal de una estabilidad mucho mayor, tanto en tiempos cortos como en tiempos largos de integración. Para estimar la bondad del procedimiento, se ha incluido en la gráfica una señal compensación de referencia (traza con marcadores triangulares blancos), que se ha calculado restando directamente la señal en el sensor y en la referencia, promediando después para eliminar ruido. Se hace notar la forma de onda que se comporta como un diente de sierra entre los segundos 1000 y 2000. Este efecto se debe a la modificación intencionada de la velocidad de flujo entre 15 y 35 mI/min. Podemos concluir que las señales de frecuencia y disipación medidas en los resonadores sensor y referencia, si bien tienen un elevado nivel de correlación en su evolución temporal, no tienen una respuesta exacta en valor absoluto frente a factores externos como la temperatura y la velocidad del flujo. En estas condiciones, el resultado proporcionado por el procedimiento propuesto es mucho mejor, tanto a nivel de deriva como a nivel de ruido de alta frecuencia que el método de referencia que se suele emplear en el estado del arte basado en restar las señales y promediar.

En la gráfica 3, se muestra otro ejemplo de aplicación. En este caso, el experimento se ha diseñado para evaluar el límite de detección genérico del método y consiste en la monitorización de la frecuencia de resonancia de dos resonadores en contacto con agua bidestilada con una velocidad de flujo de 0 mI/min. La temperatura del dispositivo se configura para que se mantenga constante a 25 ± 0.05 °C. En este escenario, solamente los factores intrínsecos del resonador y los efectos de posibles tensiones residuales en la celda de medida pueden afectar a la estabilidad en frecuencia. La gráfica 3 (a) muestra la evolución temporal de las señales del sensor (traza con marcadores circulares blancos), la referencia (traza con marcadores circulares negros), el resultado proporcionado por el procedimiento de compensación propuesto (traza con marcadores cuadrados negros) y una señal compensación de referencia (traza con marcadores triangulares blancos), que se ha calculado restando directamente la frecuencia en el sensor y la frecuencia en la referencia, promediando después para eliminar ruido. La gráfica 3 (b) muestra el diagrama de la desviación de Alian, empleado habitualmente para evaluar la estabilidad en frecuencia de resonadores para diferentes tiempos de integración (T). Se ha calculado la desviación de Alian en el rango de t de 0.5 a 1024 segundos para el sensor, la resta sensor- referencia, la compensación de referencia y el procedimiento propuesto. Se aprecia claramente una mejora en la estabilidad para todo el rango de t con respecto a la señal original del sensor, a la resta y al método alternativo de compensación. Concretamente, la mejora de estabilidad con respecto a la señal original es de 2 órdenes de magnitud, mientras que es aproximadamente de un orden de magnitud con respecto al método de compensación de referencia.

La gráfica 4 muestra los límites de detección calculados para el sensor, la resta sensor-referencia, la compensación de referencia y el procedimiento propuesto en el experimento descrito en el párrafo anterior. El LoD se ha calculado como tres veces el valor cuadrático medio de la señal de frecuencia multiplicado por la constante de Sauerbrey para un resonador de 50 MHz. Para mejorar la robustez estadística del cálculo, se ha segmentado la señal adquirida (de una hora de duración) en 100 intervalos, se ha calculado el valor cuadrático medio del LoD en cada uno de ellos y después se ha obtenido el promedio y la desviación típica usando los 100 intervalos. El límite de detección obtenido con el procedimiento propuesto es 0.2 ng/cm2. El límite de detección de la señal original es de 8.38 ng/cm2 y el LoD ofrecido por el método de compensación de referencia es 1.56 ng/cm2. Es posible concluir que el LoD del procedimiento propuesto es más de dos órdenes de magnitud mejor que la señal original y más de un orden de magnitud mejor que la corrección de referencia.

En la gráfica 5 (a) y (b) se muestran la disipación y la frecuencia de resonancia monitorizada durante otro experimento diseñado para validar el procedimiento y el dispositivo que se presentan en esta patente. En este caso, el experimento consiste en la inyección consecutiva de dos muestras de proteína por la superficie del sensor. La primera inyección consiste en Neutravidina (NaV) a una concentración de 20 pg/ml y se realiza aproximadamente en el instante de tiempo 1000 s. La segunda inyección consiste en albúmina de suero bovino biotinilada (BSA biotinilada), a una concentración de 20 pg/ml y se realiza aproximadamente en el instante de tiempo 3000 s. El experimento se realiza en un medio salino con un caudal controlado de 20 ul/min sobre la superficie de ambos resonadores (sensor y referencia), con la salvedad de que la inyección de la muestra solamente se realiza en el sensor. La superficie de los resonadores es de oro y ha sido tratada previamente con un proceso de limpieza basado en la aplicación de rayos UV y ozono para eliminar las posibles impurezas que puedan afectar a la línea base. El experimento se realiza en un instrumento que también permite controlar la temperatura en el array. Para emular la influencia de parámetros externos se modifica la temperatura del instrumento durante la inyección de NaV tal y como muestra la gráfica 5 (c). Como se puede ver en la gráfica 5 (a) y en la gráfica 5 (b), la disipación y la frecuencia de resonancia del sensor (traza con marcadores circulares blancos) se ven afectadas por el efecto conjunto de los cambios de temperatura y la inyección de la muestra, mientras que el resonador de referencia (traza con marcadores circulares negros), solamente se ve afectado por las variaciones de temperatura. Cuando se aplica el procedimiento de compensación propuesto, se obtiene como resultado (traza con marcadores cuadrados negros) una señal que elimina los efectos comunes a ambos resonadores y por tanto cancela el efecto de la temperatura. En ese caso, se puede apreciar la señal típica que corresponde a un ensayo de adsorción de proteína con temperatura controlada. El método de referencia (traza con marcadores triangulares blancos) basado en la resta directa y el promediado parece funcionar también para eliminar grandes variaciones de temperatura si los dos resonadores tienen una respuesta absoluta frente a la temperatura idénticas. Sin embargo, cuando las respuestas frente a los fenómenos externos que deseamos compensar no son exactamente iguales, la efectividad del método tradicional disminuye. Para ilustrar esta situación, hemos modificado ligeramente la velocidad de flujo alrededor del instante de tiempo 6000 s entre 15 y 35 mI/min. Esta modificación se traduce en una interferencia en diente de sierra que afecta a los dos resonadores. Sin embargo, al encontrarse en canales de flujo distintos, la interferencia está muy correlada pero no es idéntica. La gráfica 6 muestra un detalle del mismo experimento presentado previamente en la gráfica 5, en el intervalo de tiempo entre 5700 y 6400 segundos, donde se aprecia con claridad este efecto. En este caso el procedimiento propuesto corrige adecuadamente los efectos de la variación en la velocidad de flujo, mientras que el método de referencia lo no consigue.

Gráfica 1. Derivada del coeficiente de aproximación (CA) de la transformada wavelet para el resonador que actúa como sensor (barras claras) y para el resonador de referencia (barras grises) (a) Detalle de un experimento en el que se muestra la inyección de la muestra en el sensor (b) Detalle del experimento en el que se muestra una variación en la velocidad de flujo tanto en el sensor como en el resonador de referencia.

Gráfica 2. Evolución temporal de la disipación (a) y la frecuencia de resonancia (b) para el sensor, la referencia, la resta de ambos y la señal proporcionada por el algoritmo propuesto. El experimento se realiza con agua bidestilada sometiendo al array a cambio en la temperatura y en la velocidad del flujo. En la gráfica (c) se muestra la temperatura durante el experimento.

Gráfica 3. (a) Evolución temporal de la frecuencia de resonancia para el sensor, la referencia, la resta de ambos y la señal proporcionada por el algoritmo propuesto cuando el array se encuentra en condiciones de temperatura estable (25 ^a ) y velocidad de flujo igual a 0 mI/min. (b) Estabilidad en frecuencia medida como Alian deviation.

Gráfica 4. Límite de Detección (LoD) obtenido con diferentes métodos.

c)

Gráfica 5. Evolución temporal de la disipación (a) y la frecuencia de resonancia (b) para el sensor, la referencia, la resta de ambos y la señal proporcionada por el algoritmo propuesto. El experimento consiste en la inyección de Neutravidina (NaV) con una concentración de 100 pg/ml y la posterior inyección de BSA biotinilada, también con una concentración de 100 pg/ml en condiciones de temperatura y velocidad de flujo cambiante. En la gráfica (c) se muestra la temperatura durante el experimento.

Gráfica 6. Detalle de la evolución temporal de la frecuencia de resonancia (a) y de la disipación (b) en el intervalo 5700 y 6400 segundos obtenido en el experimento descrito en la Gráfica 5. Se muestran las señales del sensor, la referencia, la resta de ambos y la señal proporcionada por el algoritmo propuesto. La gráfica muestra un detalle de la señal donde se produce un cambio en las condiciones de flujo.