[01] A presente invenção trata-se de peptídeos biomiméticos derivados do fator multifuncional timosina-B4 (TB4) funcionalizados com serotonina (5-HT- ou 5-hydroxytryptamine) e/ou seu precursor biológico 5-hidroxitriptofano (5- HTP*). Mais particularmente, a presente invenção refere-se a moléculas 5-HT- peptídeo e 5-HTP*-peptídeo que possuem em seus sítios de ligação uma configuração molecular precisa para conferir a elas alto desempenho/eficácia nos processos de cicatrização, regeneração de tecidos, renovação celular, e especificamente no processo de angiogênese (formação de novos vasos a partir de vasos pré-existente). Incluídas como modalidades da presente invenção estão composições dermocosméticas e bio-farmacêutica contendo esses peptídeos e que apresentam os efeitos mencionados.

[02] Com o avanço das pesquisas nas últimas décadas sobre a biologia e função das plaquetas, tem sido evidenciadas várias facetas dessas células anucleadas que as apontam com grande potencial biotecnológico. Como células secretoras e altamente responsivas, as plaquetas podem ser exploradas para desenvolver soluções que alteram microambientes de lesões teciduais, por meio de materiais sintéticos espelhados ao seu conteúdo (plaquetário), e assim utilizados como “pistas” / sinais extracelulares instrutivos para morfogênese e como consequência para os processos de cicatrização e regeneração tecidual [1-3], Neste contexto, surge a plataforma biomimética do conteúdo plaquetário, a Biotech-educated platelets detalhada e publicada em artigos científicos, sendo o conteúdo plaquetário a nossa “fábrica natural de fatores de crescimento” [2,4], Com esses dados foram desenhados peptídeos com assinaturas plaquetárias, peptídeos bio-similares/biomiméticos do conteúdo das plaquetas através de plataformas de “high throughput screening”, para produzir soluções biomiméticas sintéticas para a indústria de dermocosméticos. Sabe-se que os fatores de crescimento plaquetários (enfaticamente no plural) são uma vasta coleção de compostos de alto valor biológico, modelos biomiméticos, e permitem a convergência entre os sistemas biológicos (de ocorrência natural) e a química sintética para criar (in silico) uma nova geração de peptídeos biomiméticos, os PlateSimilis, uma biblioteca de peptídeos e outras biomoléculas de sinalização artificiais capazes de desempenhar suas conhecidas funções biomiméticas ou até novas funções [(1)van der Meijden, P.E.J.; Heemskerk, J.W.M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat. Rev. Cardiology. 2019, 16, 166- 179. (2) Andrade, S.S.; Faria, A.S.; Queluz, D.P.; Ferreira-Halder, C. Platelets as a ‘natural factory’ for growth factor production that sustains normal (and pathological) cell biology, Biological Chemistry 2020, 401 , 471 -476. (3) Faria, A.V.S.; Andrade, S.S.; Reijm, A.N.; Spaander, M.C.W.; de Maat, M.P.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V.; Fuhler, G.M. Targeting Tyrosine Phosphatases by 3-Bromopyruvate Overcomes Hyperactivation of Platelets from Gastrointestinal Cancer Patients. J. Clin. Med. 2019, 8, 936. (4) Andrade, S.A.; Faria, A.V.S.; Fuhler, G.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V. Biotech-educated Platelets: beyond tissue regeneration 2.0. in press. 2020],

[03] De maneira mais específica, na presente invenção, com o uso da plataforma Biotech-educated platelets (agonista plaquetário dependente) foi possível identificar assinaturas plaquetárias para os processos de cicatrização e regeneração tecidual como a i) amina biogênica serotonina (5-HT), que é umas das substâncias estratégicas da cicatrição liberada a partir dos grânulos densos plaquetários, e o ii) polipeptídeo multifuncional timosina-B4 (TB4) que é liberado a partir dos grânulos alfa.

[04] A 5-HT (também conhecida como 5-hidroxitriptamina) é produzida a partir de seu precursor biológico o 5-hidroxitriptofano (5-HTP) por uma descarboxilação. A 5-HT produzida é armazenada nos grânulos plaquetários, é liberada pelas plaquetas diante de uma lesão tecidual intensa, principalmente em tecidos com alto poder regenerativo, como o fígado. Ela atua como um potente mitógeno e modula a remodelação do tecido [5-7], A serotonina (5-HT) também pode aumentar a permeabilidade vascular, induzir a dilatação dos capilares e causar a contração do músculo liso não vascular. O bloqueio de seus receptores com antagonistas dos receptores 5-HT2A e 2B, mostrou inibir a regeneração hepática [5], Esses resultados sugerem que a serotonina derivada de plaquetas está envolvida no início da regeneração hepática [(5)Lesurtel M, Graf R, Aleil B, Walther DJ, Tian Y, Jochum W, Gachet C, Bader M, Clavien PA. Platelet-derived serotonin mediates liver regeneration. Science. 2006 Apr 7;312(5770): 104-7. doi: 10.1126/science.1123842. (6) T. Vitalis, J. G. Parnavelas, Dev. Neurosci. 25, 245 (2003). (7) M. Matsuda et al., Dev. Cell 6, 193 (2004)].

[05] Já o fator TB-4, é um polipeptídeo que atua na diferenciação e aceleração da migração de células endoteliais, com ação direta na angiogênese (processo de produção de novos vasos a partir de vasos pré- existentes, vascularização) [2-7], Timosina-beta 4 (TB4) atua como agente quimiotático, antimicrobiano e regulador do sistema hematopoiético, aumentando a taxa de renovação, adesão e disseminação de células endoteliais, epiteliais e mesenquimais da pele, que reforça o processo de cicatrização e regeneração celular, aumentando a sustentação da pele (do tecido cutâneo) por estimular a síntese de componentes da matriz extracelular, com um plus funcional homeostático [8-10] [ (8) Faria, A.V.S.; Andrade, S.S.; Reijm, A.N.; Spaander, M.C.W.; de Maat, M.P.M.; Peppelenbosch, M.P.; Ferreira-Halder, C.V.; Fuhler, G.M. Platelets in aging and cancer double-edged sword. Cancer and Metastasis Reviews, 2020, v. 1 , p.1205-1221. (9) Sorgdrager Freek J. H.; Naudé Petrus J. W.; Kema Ido P.; Nollen Ellen A.; Deyn Peter P. De.Tryptophan Metabolism in Inflammaging: From Biomarker to Therapeutic Target Frontiers in Immunology. 2019, 10, 2565. (10) Mannherz H. G.; Hannappel E. The [3-thymosins: intracellular and extracellular activities of a versatile actin binding protein family, Cell. Motil. Cytoskel. 2009, 66, 839-851],

[06] Mantendo o contexto em órgãos com grande potencial regenerativo, a pele, tem na sua estrutura cutânea (isso inclui suas camadas mais profundas) um sistema modelo muito interessante para estudos experimentais de processos regenerativos, isso se deve à sua incrível capacidade de regeneração e à sua facilidade e acessibilidade em se obter dados/resultados fundamentais de processos relacionados a biologia regenerativa. As descobertas de tais pesquisas na pele contribuíram para a elucidação de novos princípios fundamentais na biologia regenerativa. Destacando a função de barreira externa, a pele é um dos órgãos mais desafiadores do nosso organismo, por uma série de fatores de estresse externo que é capaz de suportar, resultando em danos frequentes às células e às estruturas da barreira cutânea. Assim, a pele desenvolveu um conjunto de mecanismos naturais complexos para se proteger e restaurar a sua integridade quando lesionado, sem resultar em septicemia. Em condições fisiológicas normais, a restauração de uma barreira epidérmica funcional é altamente eficiente, enquanto o reparo da camada dérmica mais profunda é menor e pode resultar em formação de cicatriz com perda substancial da estrutura e função do tecido original, quando a resposta normal de reparo não funciona [11], [ (11 ) Gould, J. Superpowered skin. Nature 563, S84-S85 (2018). doi: https://doi.org/10.1038/d41586-018- 07429-3 ] .

[07] Existe, portanto, uma necessidade técnica de se identificar novos agentes capazes de desencadear o processo de regeneração da pele, não apenas para fins experimentais, mas, para fins dermocosméticos e terapêuticos a fim de resgatar a saúde e vitalidade da pele, prejudicada por qualquer perda, dano ou comprometimento da pele, como cicatrizes, queimaduras ou feridas, mas também para prevenir e reverter sinais do processo de envelhecimento. Nesse sentido, a presente invenção fornece uma solução para prevenir, retardar ou reverter os sinais do processo de envelhecimento da pele através da promoção do recrutamento de células-tronco, com o uso de agentes peptídicos derivados do fator TB-4 funcionalizados com 5-HT e/ou seu precursor 5-HTP* Mais especificamente, a invenção atua no equilíbrio entre a senescência natural ou induzida em favor da substituição do tecido ou da pele, com o acesso ao reservatório de células-tronco dependendo da cronologia da pele analisada.

[08] Em buscas realizadas em bancos de patentes foram encontrados documentos que descrevem o uso de Timosina-B4 em composições para inibição ou reversão do envelhecimento da pele e na regeneração tecidual, como por exemplo o documento O documento EP2311485A1 apresenta composições de Timosina B4 para reparo de feridas compreendendo timosina beta 4 (TB4) tendo a sequência SDKP DMAEI EKFDK SKLKK TETQE KNPLP SKETI EQEKQ AGES (SEQ ID NO:2), uma isoforma do referido TB4, uma isoforma de TB4 que compreende LKKTET (SEQ ID NO:1); O documento US2013149397A1 apresenta métodos para prevenir, melhorar ou reduzir os sinais dermatológicos do envelhecimento que empregam agentes ativos, além de um retinóide, que estimulam a expressão de timosina beta - 4 na pele. Também são fornecidos métodos para triagem de substâncias que estimulam os níveis de expressão de timosina beta-4 e os métodos de uso de agentes ativos identificados pelo protocolo de triagem no tratamento da pele; O documento CA2426200A1 descreve a inibição ou reversão do envelhecimento da pele por peptídeos sequestradores de actina. A degradação da pele associada ao envelhecimento é inibida ou revertida pela administração de um peptídeo sequestrante de actina, como a timosina beta-4 , uma isoforma de timosina beta-4 ou timosina oxidada beta-4 isolados ou administrados em conjunto com pelo menos um agente que auxilia ou estimula a redução do envelhecimento da pele, em que o referido agente é selecionado do grupo que consiste em fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador beta (TGF-B), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF-2), interleucina 1 (IL-1), protimosina alfa e timosina alfa 1 ; O documento KR102079067 descreve uma composição cosmética para cuidados com a pele compreendendo proteína de fusão com T4.

[09] No entanto, não foi encontrado no estado da técnica documentos que relatam o uso de Timosina-B4 com 5-HT e/ou seu precursor 5-HTP* na regeneração, renovação e cicatrização tecidual da pele. Como já foi citado acima, sabe-se do efeito da seretonina na regeneração hepática, mas essa monoamina é pouco explorada com relação à pele, além disso, sua liberação nesse órgão não é igual à do fígado.

[010] Portanto, considerando-se que a Serotonina (5-HT) (e/ou seu precursor 5-HTP*) e a Timosina-B4 são moléculas liberadas de diferentes compartimentos das plaquetas a partir do estímulo de agonistas diferenciados, em situações diferentes e tempos diferentes, somado ao fato de que o uso da serotonina e/ou seu precursor na regeneração e cicatrização tecidual da pele é pouco explorado, a grande vantagem da presente invenção é a junção molecular dessa monoamina e/ou seu precursor (5-HTP*) com a proteína Timosina-B4 ou com seus derivados peptídicos, através de uma reação de cross-link não covalente, originando novos peptídeos com elevado potencial de uso dermocosmético e biofarmacêutico.

[011] Sendo assim, nessa invenção foi demonstrado pela primeira vez sequências peptídicas derivadas do TB-4 funcionalizadas com cross-link não covalente com 5-HT e/ou 5-HTP (seu precursor biológico), apresentando efeitos diretos ou indiretos de renovação celular, promotor do processo de cicatrização e regeneração tecidual, demonstrando ser um potente ingrediente ativo para formulações dermocosméticas, por serem biomiméticos (sintéticos) a fatores e moléculas plaquetários que atuam na regeneração tecidual e na cicatrização de fendas.

Breve Descrição das Figuras

[012] Figura 1. Mapa de interações entre 50 proteínas intra-plaquetárias (pontos pretos), para início da plataforma Biotech-educated platelets. Interações complexas de proteínas multifuncionais centrais em múltiplos processos fisiológicos: em azul. Cor da borda proporcional à pontuação MiST; espessura da borda proporcional às contagens espectrais. As interações físicas entre as proteínas plaquetárias (linhas pretas finas) foram selecionadas de CORUM, IntAct e Reactome.

[013] Figura 2. Ensaio de cresci mento/proliferação de fibroblastos HFF-1 por contagem celular na presença das sequências da Tabela 1. Fibroblastos (HFF-1 ) foram tratados com as sequências destacadas na Tabela 1 . O crescismento/proliferação foi acompanho pela contagem de células por até 50 horas de cultivo, (ensaio em triplicate) *p<0,001 .

[014] Figura 3. Análise da viabilidade celular por redução de MTT, células expostas aos PlateSimilis 1 e 2. Queratinócitos de pele humana (HaCat) destacadas na figura foram tratadas com PlateSimilis 1 e 2 1% p/v (A e B respectivamente). O tratamento das células com PlateSimilis 1 e 2 não alteraram o metabolismo celular, as células se mantiveram viáveis e com metabolismo ativo, (ensaio em triplicata) *p<0,001.

[015] Figuras 4. Análise de Cicatrização pelo Processo de Migração Celular, linhagem HaCat analisadas em 24h e 48h sob tratamento do PlateSimilis 1. Os ensaios de “wound healing” por “scratch” na cultura de HaCat (queratinócitos de pele humana, com mais de 90% confluência) foram realizados na presença (A-C) ou na ausência do (D-F) PlateSimilis 1 (1 %). Observamos redução da ferida/aumento da cicatrização de 50% em 24 h de tratamento com PlateSimilis 1. Assim, como observamos em (C) uma cicatrização de 80 ± 1 ,2. (D-F) Controle com SFB (soro fetal bovino). As imagens representativas são mostradas com ampliação de 10X. A área de migração foi quantificada pelo software ImageJ. (G) Gráfico representativo da quantificação da ferida versus o tempo (24 e 48 h), e controle SFB. Estatística ANOVA GraphPad. Imagens representativas de três experimentos independentes.

[016] Figuras 5. Análise de Cicatrização pelo Processo de Migração Celular, linhagem HaCat analisadas em 24h e 48h sob tratamento do PlateSimilis 2. Os ensaios de “wound healing” por “scratch” na cultura de HaCat (queratinócitos de pele humana, com mais de 90% confluência) foram realizados na presença (A-C) ou na ausência do (D-F) PlateSimilis 2 (1 %). Observamos redução da ferida/aumento da cicatrização de 40% em 24 h de tratamento com PlateSimilis 1. Assim, como observamos em (C) uma cicatrização de 70 ± 1 ,2. (D-F) Controle com SFB (soro fetal bovino). As imagens representativas são mostradas com ampliação de 10X. A área de migração foi quantificada pelo software Imaged. (G) Gráfico representativo da quantificação da ferida versus o tempo (24 h e 48 h), e controle SFB. Estatística ANOVA GraphPad. Imagens representativas de três experimentos independentes.

[017] Figura 6. Diâmetro Hidrodinâmico Médio (DHM - tamanho do nanopolímero) versus potencial zeta. PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico (PoL-2), analisado em diferentes tempos de armazenamento.

[018] Figura 7. Diâmetro Hidrodinâmico Médio (DHM - tamanho do nanopolímero) versus potencial zeta. PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico (PoL-2), em diferentes condições de análise/variáveis.

[019] Figura 8. Análise da viabilidade celular por redução de MTT, células expostas aos PlateSimilis 1 (1x conc. e 4x conc.) em seu sistema nanopolimérico bifásico. Queratinócitos de pele humana (HaCat) destacadas na figura foram tratadas com PlateSimilis 1 (1x e 4x conc.) (A-B). O tratamento das células com PlateSimilis 1 não (1x e 4x conc.) alteraram o metabolismo celular, as células se mantiveram viáveis e com metabolismo ativo, (ensaio em triplicate) *p<0,001.

[020] Figura 9. Formação de esferoide de células HaCat previamente tratadas com PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico. Células HaCat foram plaqueadas de acordo com métodos para formação de esferoides na presença e ausência de PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico. (A) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X (A1- PlateSimilis 1 e A2- Controle). (B) Gráfico demonstrando média do tamanho dos esferoides e taxa de crescimento da massa esferoidal. Imagens representativas dos experimentos realizados em triplicate. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Escala 100 pm, gráficos representam o aumento do tamanho do esferoide na presença de PlateSimilis 1 e na ausência. Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.

[021] Figura 10. Formação de esferoide de células HaCat para posterior tratamento com PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico. Células HaCat foram plaqueadas de acordo com métodos para formação de esferoides na presença e ausência de PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico. (A) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X. (B) Gráfico demonstrando média do tamanho dos esferoides e taxa de crescimento da massa esferoidal. Imagens representativas dos experimentos realizados em triplicate. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Escala 100 pm, gráficos representam o aumento do tamanho do esferoide na presença de PlateSimilis 1 e na ausência. Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.

[022] Figura 11. Esferoides de queratinócitos de pele humana tratados com PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico - quantificação da produção de laminina e colágeno tipo I pós tratamento. Células HaCat foram plaqueadas de acordo com métodos para formação de esferoides na presença e ausência de PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico. (A) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X, esferoides tratados com PlateSimilis 1 plus laminina. (B) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X, esferoides tratados com PlateSimilis 1 plus colágeno tipo I. (C) Gráfico com a quantificação de laminina e colágeno totais dos esferoides tratados com PlateSimilis 1. Imagens representativas dos experimentos realizados em triplicate. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Escala 100 pm das imagens, controles representam o tratamento dos esferoides com laminina e colágeno tipo I sem PlateSimilis 1. Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.

[023] Figura 12. Esferoides de queratinócitos de pele humana tratados com PlateSimilis 1 e PlateSimili em sistema nanopolimérico bifásico - coordenação da renovação celular na presença de PlateSimilis funcionalizado ou não com 5-HT e/ou 5-HTP*. Células HaCat foram plaqueadas de acordo com métodos para formação de esferoides na presença de PlateSimilis funcionalizado ou não com 5-HT em sistema nanopolimérico bifásico. (A) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X, esferoides tratados com PlateSimilis 1. (B) Imagens em microscopia de contraste de luz em magnificação de 10X, esferoides tratados com PlateSimilis 2. Imagens representativas dos experimentos realizados em triplicata. Número de experimentos realizados (formação de esferoides, n=3). Escala 100 pm das imagens, controles representam o tratamento dos esferoides com laminina e colágeno tipo I sem PlateSimilis 1. Barras representam ± médias e desvio padrão, teste utilizado ANOVA GraphPad.

[024] Figura 13. Géis representativos da extração de proteínas totais dos esferoides de queratinócitos de pele tratadas com PlateSimilis 1 em sistema nanopolimérico bifásico - detecção de p53 e ki67. As amostras celulares foram submetidas a extração de proteínas totais para posterior dosagem de proteínas totais utilizando o kit BCA para análise por Western Blotting. (A) Resultado para detecção de p53 (diluição 1 :1000) cell signaling e anticorpo secundário human na diluição de 1 :10000, das amostras dos esferoides das Figuras 9 e 10. (B) Resultado para detecção de ki67 (diluição 1 :500) ThermoFisher e anticorpo secundário humano na diluição de 1 :10000, das amostras dos esferoides das Figuras 9 e 10.

[025] Figura 14. Co-cultura com Feeder de fibroblastos de pele humana (HFF-1) e células endoteliais (HUVEC) na presença de PlateSimilis 1 para formação de estruturas tubulares angiogênicas. Células endoteliais (4 x 10 ³ céls/poço) foram plaqueadas sobre uma camada de fibroblastos de pele (feeder/alimentador) e estimuladas com PlateSimilis 1 (1%). As imagens (duplicadas) foram tiradas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, EUA), os círculos amarelos indicam as estruturas tubulares; e as setas vermelhas indicam o ponto de ligação entre células endoteliais. Imagens em ampliação de 10X (barra de escala 50 pm) após 24 horas de cultura. Imagens representativas de três experimentos independentes.

[026] Figura 15. PlateSimilis 1 da plataforma Biotech -educated platelets - consolidando o fenômeno de formação de “crowded cellular environment” com células endoteliais (HUVECs). Interações ativadas por PlateSimilis 1 (1 %), imagens ilustram a perspectiva da matriz Fibrin Merck e organização de feixes de F-actina no citoesqueleto (A), a perspectiva nuclear e a sobreposição das imagens. Marcadores de imunofluorescência para núcleo (DAPI, azul) (B) e filamentos de F-actina (faloidina, verde) (C) representados em sobreposição/localização. As imagens foram obtidas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, EUA) em uma ampliação de 10X (barra de escala 100 pm) após 72 horas de cultura.

[027] Figura 16. Adesão e proliferação de HaCat sob tratamento com PlateSimilis 1, ácido ascórbico e niacinamida, em plataforma cytation “time-lapse”. Imagens representativas dos vídeos capturados por 24 h (1 imagem capturada a cada 10 min por 24 h). (A) HaCat PlateSimilis 1 (1%); (B) HaCat PlateSimilis 1 (1%) + ácido áscórbico 5% (Nano Vit C); (C) HaCat PlateSimilis 1 (1 %) + Niacinamida PC 4%; (D) controle HaCat SFB 10%; (E) controle ácido ascórbico 5%; (F) controle niacinamida 4%. *Os vídeos podem ser solicitados.

[028] Figura 17- Incorporação do PlateSimilis 1 em Formulaçõs cosméticas - spray, creme e gel

[029] Figura 18. Imagens retiradas dos relatórios/laudos dos testes de segurança e toxicidade in vitro pela empresa InvitroCell. Primeria imagem: resultado do teste com a pele humana reconstituída da Epskin. Segunda imagem: resumo com as características do teste de irritabilidade/opacidade e permeabilidade, e resultado da avaliação do PlateSimilis 1 usando córnea bovina. Terceira e última imagem: resumo do teste de fototoxicidade in vitro e resultado da análise do PlateSimilis 1. Todos os testes mostraram a segurança e biocompatibilidade do PlateSimilis 1 = PlateSimilis Éris.

[030] Figura 19. Imagens retiradas dos relatórios/laudos finais dos testes de toxicidade e fototoxicidade. (w) avaliação do potencial de irritabilidade primária, acumulada e sensibilização cutânea de um produto em condições controladas e maximizadas (RIPT) e (B) do teste do potencial de fotoalergia e fototoxicidade cutânea do PlateSimilis 1. Ambos os testes em voluntários sustentaram os claims/atributos de dermatologicamente testado e hipoalergênico.

[031] Figura 20. Resultado dos testes anti-aging, realizados por empresa especializada. A imagem retirada do relatório/laudo final traz como resultado a sustentação dos claims anti-aging, anti-idade e anti-rugas.

Descrição Detalhada da Invenção

[032] Através da identificação dos alvos 5-HT (e/ou precursor 5-HTP*) e timosina-B4, através de estudos realizados com plaquetas estimuladas por diferentes tipos de agonistas, foram desenhados e sintetizados peptídeos biomiméticos derivados da proteína multifuncional timosina-B4 funcionalizados, através de uma reação de cross-link não covalente, com a serotonina (5-HT) e/ou com o precursor da amina-bioativa serotonina (5-HTP*). Essa ligação cross-link não covalente permite projetar uma variedade de redes de fibras peptídicas funcionais graças aos modos dinâmicos de ligação supramolecular e reversibilidade. A partir daí foram realizados estudos de viabilidade do uso da molécula peptídeo derivado do Timosina-B4-5HTP e/ou peptídeo derivado do Timosina-B4-5HT, ligadas por cross-link não covalente, no reparo tecidual da pele.

[033] Portanto, a presente invenção trata-se da inédita funcionalização da proteína timosina-B4 com serotonina (5HT) e ou seu precursor 5-HTP e seu uso na preparação de composições dermocosméticas e para uso em processo de cicatrização, renovação celular, reparo tecidual e regeneração de tecidos.

[034] As composições dermocosméticas e bio-farmacêuticas da presente invenção caracterizam-se por compreender pelo menos uma das sequências representadas por SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 17 e excipientes de uso farmacêutico e/ou cosmético aceitáveis. Elas podem se apresentar na forma de spray, gel, creme.

[035] As composições em spray caracterizam -se por consistir de pelo menos um dos peptídeos biomiméticos representados por SEQ ID N°1 a SEQ ID N° 17 de 0,2 a 3%, pantenol 0,2 a 3%, glicerina vegetal de 0,1 a 1 ,0 %, fenoxietanol de 0,1 a 1 ,0%, água deionizada (q.s.p.).

[036] As composições em creme caracterizam -se por consistir de pelo menos um dos peptídeos biomiméticos representados por SEQ ID N°1 a SEQ ID N° 17 de 0,2 a 3%, cera polawax de 5 a 20%, TCM de 1 a 10%, glicerina vegetal de 1 a 10%, Vitamina C de 1 a 10% ou Niacinamida PC de 1 a 10%, vitamina E líquida de 0,1 a 3%, EDTA de 0,01 a 2%, Clorometilisotiazolinona/Metilisotiazolinona de 0,1 a 3%, Fenoxietanol de 0,1 a 3% e água deionizada (q.s.p.).

[037] Já as composições em gel caracterizam-se por consistir de pelo menos um dos peptídeos biomiméticos representados por SEQ ID N°1 a SEQ ID N° 17 de 0,2 a 3%, natrosol de 0,5 a 5%, pantenol de 0,5 a 5%, glicerina vegetal 0,5 a 6%, Clorometilisotiazolinona/Metilisotiazolinona de 0,1 a 3%, Fenoxietanol de 0,1 a 3% e água deionizada (q.s.p.).

[038] A invenção poderá ser melhor compreendida a partir dos exemplos, não limitantes, que seguem: [039] Exemplo 1- Identificação da assinatura plaquetária e síntese das moléculas

[040] Análises ômicas - análise de sistemas de alta complexidade biológica - do conteúdo plaquetário agonista dependente, foco em Proteômica, Shedômica e Peptidômica

[041] A partir de cada condição de ativação agonista dependente, foi analisado o conteúdo plaquetário recrutado, tanto intra como extra (secretoma) plaquetário. Uma vez organizadas, as amostras foram submetidas a análise por cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas, proteômica de peptídeos intraplaquetários multifuncionais e moduladores de funções plaquetárias. Também se realizou a análise de peptídeos gerados por ação de proteases de membrana (shedômica). De maneira simplificada, descrevemos o método utilizado: a análise por LC-MS foi realizada em um sistema Easy-nLC II nanoHPLC acoplado a um LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha) por meio de uma fonte de íons nanoeletrospray. Cada amostra foi aplicada a uma coluna de cromatografia C18 com “beads” de 10 pm (Phenomenex, Inc., Torrance, CA). A separação foi realizada em coluna analítica C18. A eluição dos peptídeos foi realizada através de um gradiente de 5% à 45% de acetonitrila, em 0,1 % de ácido fórmico, em 90 min a 200 nl_ / min. O espectrômetro foi operado em modo dependente de dados, e os 10 picos mais intensos foram selecionados para fragmentação de dissociação induzida por colisão (CID) após adquirir cada varredura completa com parâmetros específicos pré-determinados de tempo de injeção, resolução e varredura de fragmentação.

[042] Nossa análise de dados seguiu o modelo DIKW (Data-lnformation- Knowledge-Wisdom), muito utilizado em análises biotecnológicas, como "ômicas". Os arquivos de dados brutos foram submetidos a pesquisas contra Bancos de dados NCBI nr_20130601 , UniProt e Moonlightpro filtrado para taxonomia D. rerio usando PEAKS Studio (versão 8; Solução de Bioinformática, Waterloo, Canadá). [043] Nossas análises utilizando ferramentas ômicas para alimentar a plataforma Biotech-educated platelets permitiu correlacionar o conteúdo plaquetário agonista dependente à sinalização de plaquetas no contexto funcional de redes integradas em processos estratégicos para a manutenção da pele. Exploramos as informações sobre interações proteína-proteína e relações fatores de crescimento plaquetários e a multifuncionalidade em processos fisiológicos relacionados a regeneração tecidual (incluindo o processo de cicatrização de feridas). O uso de visualização gráfica para sub- redes específicas permitiu e permite a investigação dos principais módulos de sinalização envolvidos na ativação plaquetária. Destacamos na figura 1 uma fração de nossas análises em um modelo de interatoma de proteínas plaquetárias, como citocinas, quimiocinas, fatores da coagulação e fatores de crescimento.

Plataforma Biotech-educated platelets - Modelos in silico e Síntese de peptídeos

[044] Em posse dos resultados das análises ômicas e da plataforma multiplex MagPix, seguiu-se para os modelos in silico. Para a construção e validação da Plataforma Biotech-educated platelets, foram utilizadas as ferramentas de molecular docking e dinâmica molecular, para analisar com detalhes as proteínas e peptídeos (fatores plaquetários) alvos na nossa análise por shedômica e peptidômica, e assim selecionar os mais promissores candidatos a ativos para formulações dermocosméticas, através da caracterização biológica dessa nova classe de moléculas bioativas, os peptídeos biomiméticos (de origem intraplaquetária) e peptídeos biomiméticos liberados pela ação de metaloproteases, todos denominados PlateSimilis. Na presente invenção, os peptídeos biomiméticos foram funcionalizados com assinatura plaquetária, sendo a serotonina (5-HT) a bioamina biogênica identificada em processos de remodelação tecidual a mais promissora para a funcionalização por cross-link não covalente, assim como seu precursor biológico o 5-HTP. Em seguida seguiu-se para os testes celulares in vitro, de segurança e eficácia. Desta forma, descrevemos de maneira simplificada o método de síntese utilizado.

[045] A síntese seguiu a metodologia de fase sólida por Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonil), conforme descrito por Hirata et al [12], As extremidades dos peptídeos foram devidamente bloqueadas de acordo com nossos alvos celulares. Os peptídeos sintéticos foram caracterizados em cromatografia líquida analítica de alta eficiência, em uma coluna de fase reversa Econosil C18 (4,6 mm X 150 mm), acoplada a um sistema de bombas e detector de UV-Vis (215 e 280 nm) ambos Shimadzu. (12) Hirata, I.Y., Cezari, M.H.S., Nakaie, C.R., Boschcov, P., Ito, A.S. & Juliano, M.A. Internally quenched fluorogenic protease substrates: solid phase synthesis and fluorescence spectroscopy of peptides containing ortho- aminobenzoyl/dinitrophenyl groups as donor-acceptor pairs. Lett. Pept. Sci. 1 , 299-308 (1994). Os peptídeos sintetizados foram analisados por espectrometria de massas, através do método da medição do tempo do vôo do íon em um espectrômetro de massas modelo Microflex LT, dotado de tecnologia MALDI- TOF (Matrix Laser Desorprtion Ionization Time-of-Flight). Em todas as análises, a matriz empregada foi o ácido a-ciano-4-hidroxicianamínico. Os fragmentos de hidrólise foram determinados através de cromatografia líquida de alta eficiência associada a um espectrômetro de massas do tipo “eletron spray”, utilizando equipamento LC/MS-2010, ShimadzuSi. As amostras foram analisadas por cromatografia através de detectores de UV (215 a 365 nm), Shimadzu UV-vis SPD-20AV, a coluna utilizada foi uma C18 Ultrasphere (4.6 mm X 250 mm), utilizando-se os seguintes solventes com gradiente já validado: (A) TFA/H2O (1 :1000) e (B) TFA/ACN/H2O (1 :900:99).

[046] A partir das análises múltiplas conseguimos destacar pelas análises in sílico os peptídeos derivados de fatores plaquetários, descritos na tabela 1 , e destacados aqui: Palmitoyl-octapeptide-5-HT ou -5-HTP* - [Palmitoyl ou Acetyl]- TXXEHXXD-5-HT ou -5-HTP* ou [Palmitoyl ou Acetyl]- TXXEHXXD- COOH- (podendo ser M também D) ou Palmitoyl-TETQEKND-5-HT ou -5-HTP* - [Palmitoyl ou Acetyl]- TETQEKND-5-HT ou 5-HTP* ou [Palmitoyl ou Acetyl]- TETQEKND-COOH-

Exemplo 2- Formação do Cross-link entre as moléculas Timosina- B4, Serotonina (5-HT) e/ou seu precursor 5-HTP*

Estrutura dos peptídeos à base TB4 contendo sítios de ligação a metais e coordenação de ligação ao precursor de serotonina 5-HTP* e à 5-HT

[047] Para as sequências peptídicas derivadas do fator TB-4 (ver tabela I) Palmitoyl ou Myristoyl ou Acetyl- TXXEHXXD-5-HT (Myristoyl-Thr-X-X-Glu-His- X-X-Asp-5-HT, X= Ala-Glu — Glu-His-Asp-5-HT) ou Palmitoyl ou Myristoyl ou Acetyl- TXXEHXXM-5-HT ou 5-HTP (Myristoyl-Thr-X-X-Glu-His-X-X-Met-5-HT ou 5-HTP, X= Ala-Glu — Glu-His-Met-5-HT ou -5-HTP) Palmitoyl ou Myristoyl ou Acetyl-TETQEKND-COOH-, as soluções de peptídeo-metal foram preparadas em tampão pH 8,0 contendo 20 mM de fosfato de sódio e 400 pM a 1 mM de Zn ²⁺ Cu ²⁺ ou Ni ²⁺ para obter uma concentração de peptídeo de 230 pM. Os peptídeos (0.00001 % solução estoque) foram dissolvidos em pH 7,4 e tampão fosfato de sódio 20 mM e misturados com vários íons metálicos (160 pM) e incubados com serotonina (5-hydroxytryptamine, 5-HT) ou seu precursor 5-hydroxytryptophan (5-HTP*). Todas as soluções peptídicas foram incubadas em condições controladas de temperatura a 4°C por pelo menos 24 h antes da incorporação no sistema de delivery e posterior análises celulares.

[048] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, são fornecidos peptídeos derivados do fator TB-4 com sítios de ligação para serotonina (5-HT) e/ou seu precursor 5-HTP com uma constante de dissociação inferior a 10’ ⁷ M. Especificamente estes sítios de ligação compreendem os resíduos de aminoácidos metionina ou aspartato ou glutamato na posição I (em relação a região C-terminal), e seus equivalentes funcionais. Todos os peptídeos são sintetizados com grau de pureza de > 98%. Tabela 1- Timosina-B4 e seus derivados, sintetizados e ligados à serotonina (5HT) e/ou seu precursor 5-HTP

[049] Foram realizados ensaios de crescimento/proliferação com Fibroblastos de pele (HFF-1 ) com as sequências citadas na Tabela 1 .

[050] No texto seguinte os derivados serão denominados;

[051] PlateSimilis 1 ou PlateSimilis Éris [Palmitoyl ou Acetyl]-TXXEHXXD-5-

HT e/ou 5-HTP (podendo ser D ou M na região C-terminal) [052] PlateSimilis 2 [Palmitoyl ou Acetyl]- TXXEHXXD-COOH- (D ou M) sem funcionalização.

Exemplo 3- Ensaios celulares com as sequências derivadas de TB-4 funcionalizadas (PlateSimilis 1) ou não (PlateSimilis 2) com 5-HT e/ou 5- HTP

Linhagens Celulares

[053] A linhagem celular HaCat (Ha = human adult, Cat = Calcium temperature) queratinócitos normais de pele humana, foi mantida/cultivada em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), suplementação com 10% de FBS e/ou InGrowth-S e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 pg/mL)). Por apresentar um índice de proliferação 3,8 em 48h, que corresponde a um alto nível de renovação celular, o meio das células foi substituído a cada subcultivo, e com as células aderidas a cada 2 dias. A linhagem de fibroblastos normais de pele humana, a HFF-1 , mantidas/cultivadas em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), suplementação com 10% de FBS e/ou InGrowth-S e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 pg/mL)). Já a linhagem HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) foi cultivada em meio cultura Roswell Park Memorial Institute (RPMI), suplementação com 10% e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 pg/mL)). Todas as células foram cultivadas/mantidas a 37 °C sob tensão de 2,5% de CO2 e seguimos sempre com os subcultivos e monitoramento da morfologia a cada passagem celular.

Ensaio de cresci mento/proliferação de fibroblastos HFF-1 por contagem celular na presença das sequências da Tabela 1

[054] Fibroblastos de pele humana (HFF-1 ) foram cultivados em placa de 96 poços, até atingirem confluência de ~80%, em meio DMEM alta glicose (Invitrogen, EUA), suplementação com 10% de FBS e antibióticos (penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 pg/mL)), para posterior tratamento com as sequências da Tabela. Como resultados observamos na Figura 2, que algumas sequências se destacaram com eficácia em relação ao crescimento/proliferação dos fibroblastos de pele, como SEQ 5 e SEQ 14, PlateSimilis 1 e 2, respectivamente.

Viabilidade celular pela análise da redução do MTT sob tratamento com os peptídeos derivados de TB-4 funcionalizados (ou não com 5-HT - e/ou 5-HTP)

[055] As células HaCat (queratinócitos de pele normal) foram plaqueadas na densidade de 5 x 10 ³ células/mL em placas de 96 poços (volume de plaqueamento por poço: 250 uL), suplementadas com 10% de SFB, e incubadas a 37° C, 5% de CO2 por 48h. Subsequentemente, a capacidade de redução do MTT pelas células (5 x 10 ³ células/mL) foi analisada utilizando o kit da Promega. Foram avaliados os efeitos dos peptídeos PlateSimilis 1 e 2, na concentração de 1 % (p/v), sob a viabilidade da linhagem HaCat. Para isso, o meio foi removido e adicionado aos poços meio sem suplementação contendo MTT (0,5 mg/mL), seguindo as orientações do fabricante. Após incubação por 4h a 37° C, o meio foi removido cuidadosamente e então adicionado à solução de inativação e solubilização do formazan (100 pL). As placas foram agitadas por 10 min e a absorbância correspondente a cada poço foi lida em espectrofotômetro (Elx 800 BIO-TEK) em comprimento de onda de 570 nm. Os valores nos gráficos foram expressos em porcentagem de viabilidade celular. O SFB foi utilizado a título de comparação e a redução do MTT nessa condição, foi considerada como 100%.

[056] Na Figura 3 podemos observar que os tratamentos com PlateSimilis 1 e 2 (ambos a 1 % p/v) não alteraram a capacidade metabólica dos queratinócitos de pele humana, utilizando como controle o SFB. Portanto, os PlateSimilis 1 e 2 preservaram, de forma adequada, a morfologia/fenótipo e metabolismo celular da linhagem HaCat. Indicando um metabolismo celular ativo e regulado com células saudáveis, sem perda de viabilidade, após o tratamento com PlateSimilis 1 e 2 in vitro em sistema de monocamada. Migração Celular pelo método “wound healing” ou “wound migration”

[057] As células HaCat (queratinócitos de pele normal) (5 x 10 ⁴ céls) foram cultivadas em placa de 24 poços (suplementadas SFB 10%) e mantidas em estufa até atingirem 100% de confluência. Em seguida as células foram lavadas com PBS (1x) e subsequente a lavagem foi feito um risco (“ferida”) com auxílio de uma ponteira de 1000 pL no centro de cada poço. O meio de cultivo foi reposto contendo 0,2% de SFB, para sincronizar o ciclo celular das células em questão. Nesta etapa as células HaCat foram tratadas com os peptídeos PlateSimilis 1 e 2 a 1% (p/v) (separadamente e avaliadas individualmente). As células foram acompanhadas ao microscópio nos tempos 0, 24 h e 48 h ou até o fechamento da “ferida”. A eficiência de migração das células, ao longo de 24h e 48h, foi analisada em microscópio LumaScope (Etaluma Inc, Carlsbad, CA, USA) em 10X de magnificação. Barra de escala referente à 100 pm. A análise foi feita por software Imaged (NIH, USA) e a área de migração foi quantificada em unidades arbitrárias (A.U.). O resultado desse ensaio foi determinante para a escolha das sequências mais eficazes na migração de células epiteliais/queratinócitos de pele humana.

[058] Como resultados representativos desse experimento mostramos as imagens do cultivo da HaCat sob o tratamento dos PlateSimilis 1 e 2 (ambos 1 % p/v). As Figuras 4 e 5 mostram que os queratinócitos normais de pele (HaCat) tratados com PlateSimilis 1 apresentaram maior habilidade de migração do que quando tratadas com o PlateSimilis 2 (não funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP), utilizamos como controle as células cultivadas com SFB. Observamos uma redução da ferida/aumento da cicatrização da ferida de 80% ± 4,5 nos queratinócitos de pele tratadas com PlateSimilis 1 em 48h (Figura 4C e G). Já a ferida exposta ao tratamento com PlateSimilis 2 levou a uma redução da ferida/e aumento da cicatrização da ferida de 70% ± 4,5 nos queratinócitos de pele (Figura 5C e G). Desta forma, concluímos que o PlateSimilis 1 a 1 % acelera significativamente o processo regulado de migração celular, performance melhor que o PlateSimilis 2. PlateSimilis em seu sistema de delivery nanopolimérico bifásico, um co- polímero nano-estruturado (Poloxamers)

[059] A redução do tamanho de partículas em escala nanométrica (nanotecnologia) tem sido empregada como plataforma para o desenvolvimento de sistemas de “drug delivery” em formulações farmacêuticas e dermocosméticas inovadoras a fim de se obter maior eficácia e segurança. Tal técnica permite aumentar a biocompatibilidade e alcance de ingredientes ativos de uso tópico pouco solúveis em água a estruturas de difícil permeação/penetração. As nano suspensões (nano-polímeros) apresentam vantagens, tais como, o aumento da solubilidade, da estabilidade e da velocidade de dissolução, decorrentes do aumento da área superficial da partícula. Além dessas vantagens, os sistemas de nanopolímeros proporcionam uma propriedade estratégica para aumento da eficácia, apresentam maior adesividade às membranas biológicas, membrana celular. Como indicado na proposta inicial deste projeto, testamos dois poloxamers, tensoativos copolímeros, com estrutura em bloco. Copolímeros em bloco de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) (PEO-PPO- PEO) na presença de glicerol [13,14], como carreadores dos PlateSimilis, a fim de tornar suas habilidades de estabilidade e entrega ao estrato córneo mais eficazes. Os tensoativos/copolímeros/sistemas de drug delivery PoL-1 e PoL-2 (conforme métodos) foram testados com base na concentração dos copolímeros, nas características térmicas e de compatibilidade com os ativos PlateSimilis. Nossos dados mostraram que a obtenção das nano suspensões poloxamers-PlateSimilis foi possível, tendo resultados mais promissores e eficazes com o PoL-2 (poloxamer 407) na presença ou ausência de glicerol. Os testes de compatibilidade da concentração de incorporação dos PlateSimilis (5000 ng/mL) a faixa de concentração do tensoativo/co-polímero (0,5 - 10%), se mostrou eficaz na obtenção de um sistema nanopolimérico. O tempo de incubação para a incorporação dos PlateSimilis ao core central hidrofóbico do sistema nanopolimérico formado variou de 12 à 48 h, sob leve agitação a temperatura controlada de 4 °C, em câmara fria. A faixa de pH a qual observamos a estabilidade das nano suspensões foi de 4,0 a 8,0. Como mencionamos, os ajustes desses parâmetros resultaram num sistema nanopolimérico bifásico para entrega eficaz dos PlateSimilis funcionalizados ou não com 5-HT e/ou seu percursor biológico 5-HTP. [(13) Bodratti, A. M.; Alexandridis, P. Formulation of Poloxamers for Drug Delivery. J. Funct. Biomater. 2018, 9, 11 ; doi:10.3390/jfb9010011 ; (14) Chiappetta, D. A.; Sosnik, A. Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide) block copolymer micelles as drug delivery agents: Improved hydrosolubility, stability and bioavailability of drugs. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007, 66, 303-317],

Determinação do diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) do sistema nanopolimérico bifásico

[060] Com o objetivo de estabelecer condições ideais para as leituras de diâmetro hidrodinâmico médio (DHM) e o índice de polidispersão pelo método de espalhamento de luz dinâmica, foram realizadas diluições de 1 :100 e 1 :200 da amostra em solução saturada de peptídeos PlateSimiles 1 e 2. As análises/medições foram realizadas em triplicata à um ângulo de 90° utilizando equipamento de parceiros o Zetsizer Nano ZS90 (Malvem Instrumensts, Malvern, UK).

[061] Na presente invenção, o tamanho das nanoestruturas (DHM) foi determinante para o alcance dos PlateSimilis ao estrato córneo da pele (comprovado nos testes clínicos). Já, as medidas de PZ (potencial Zeta) proporcionam desafios práticos que devem ser levados em consideração ao caracterizar as propriedades interfaciais das nanopartículas com morfologia irregular, como partículas coloidais não esféricas. Diversos estudos mostram que o PZ não é uma propriedade constante, mas depende da morfologia do sistema de dispersão, das propriedades físico-químicas das partículas (pH) e das propriedades da solução eletrolítica em que as partículas estão suspensas (no nosso caso PBS). A caracterização físico-química revelou que no início do preparo das nano suspensões (PoL-2 com PlateSimilis), foi observado um DHM de 100 nm a 200 nm e PZ de -34,9 mV, como mostrado na Figura 6. Tais valores foram levemente alterados principalmente após os três meses de produção das nano suspensões (PoL-2 com PlateSimilis), ao qual observamos um DHM de 225 nm e PZ de 30,9 mV, indicando que as nano suspensões se mostram estáveis até três (3) meses após seu preparo. Sobre as análises de estabilidade dos PlateSimilis em seu sistema nanopolimérico bifásico, por meio de testes de agitação mecânica (centrifugação), variação do pH e análise térmica (Figura 6), não observamos alteração no DHM em todas as condições testadas, especificamente o DHM se manteve entre 100 nm a 200 nm. No entanto, observamos uma leve alteração no PZ que foi alterado de -34,9 mV do início das análises para -25,9 mV (Figura 7). A análise térmica constituiu uma avaliação crítica, porém essencial no estudo da compatibilidade do sistema nanopolimérico bifásico dos PlateSimilis funcionalizados ou não com 5-HT e/ou seu precursor, sendo observado instabilidade com redução drástica do tamanho das nanoestruturas para 50 nm com o aumento da temperatura de 25° C a 75° C (temperatura ideal de 0° a 6°C para a incorporação). O desenvolvimento e validação do sistema nanopolimérico bifásico dos PlateSimilis, revelou características de linearidade, especificidade, precisão e robustez adequadas e satisfatórias de acordo com a regulamentação vigente (RDC-166 ANVISA, 2017). Vale reforçar que testes de viabilidade celular com queratinócitos de pele humana (HaCat) também foram executados, mostrando a segurança do sistema nanopolimérico bifásico dos PlateSimilis 1 (funcionalizado com 5-HT e/ou com 5-HTP) em duas diferentes concentrações (Figura 8).

Determinação do potencial zeta (PZ) do sistema nanopolimérico bifásico

[062] As análises para determinação do potencial zeta (PZ) também foram conduzidas utilizando o equipamento Zetasizer ZS90 (Malvem Instrumensts, Malvern, UK), pelo método de mobilidade eletroforética, que como consequência é convertida em PZ (mV) de acordo com a equação de Henry [15], A determinação do PZ é crucial para garantir a estabilidade da nano- estrutura, e leva em consideração a magnitude da repulsão ou da atração eletrostática ou das cargas entre partículas. Com a equação de Henry, leva-se em consideração a viscosidade e a constante dielétrica, da solução a 25 °C. Na mobilidade eletroforética a força do campo aplicado foi determinado em 20 V/cm. A faixa de condutividade avaliada foi de 10 a 60 pS/cm empregando solução de NaCI 0,9%. [(15) Cosgrove, T. Colloid Science: principles, methods and applications. 2nd ed. John Wiley & Sons Ltd, 2010],

Cultura Celular 3D (e 4D = 3D + tempo) - Esferoides de queratinócitos de pele humana (HaCat) por Sistema magnético NanoShuttle™ para avaliação da Biocompatibilidade do PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico

[063] Os esferoides fornecem um ambiente de organização 3D com intensas interações célula-célula. Como resultado de suas excelentes propriedades regenerativas e alto rendimento em sua produção, modelos celulares em esferoides são cada vez mais indicados para testes na medicina regenerativa. Modelos 3D tentam recapitular a complexa organização celular de um tecido (mesmo planar), como a pele. Ambas as adesões célula-célula [16] e interações célula-matriz, juntamente com a síntese de proteínas da matriz extracelular (MEC) [17,18], contribuem para a geração de nutrientes e gradientes de sinais típicos de interações justacrina, intensificando as vias de sinalizações autócrina e parácrina, oferecendo assim um modelo de estudo clinicamente relevante [19], Por essas razões, os esferoides representam uma ferramenta útil para o rastreamento de drogas [19] e mais especificamente na reinvindicação da presente invenção para a pesquisa de ingredientes ativos dermocosméticos e/ou biofarmacêuticos. Os esferoides são úteis para estudos toxicológicos, no que diz respeito à penetração e absorção de drogas, fornecendo informações sobre a difusão de compostos [19] e exibindo melhores habilidades de imunomodulação, proliferação e ativação celular do que as culturas em monocamada 2D [(16) Mingxing Lei, Linus J. Schumacher, Yung-Chih Lai, Wen-Tau Juan, Chao-Yuan Yeh, Ping Wu, Ting-Xin Jiang, Ruth E. Baker, Randall Bruce Widelitz, Li Yang, Cheng-Ming Chuong. Selforganization process in newborn skin organoid formation inspires strategy to restore hair regeneration of adult cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2017, 114 (34) E7101-E7110; DOI: 10.1073/pnas.1700475114. (17) Fuchs, E. Finding one’s niche in the skin. Cell Stem Cell. 2009, 4:499-502. (18) Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature, 2013, 493:318-326. (19) Laschke, M.W.; Menger, M.D. Life is 3D: Boosting Spheroid Function for Tissue Engineering. Trends in Biotechnology, 2016, 35; 2, p.133-144],

[064] Na presente invenção, nos concentramos em ensaios de organização celular em esferoides 3D, e em “time-lapse” (4D) para identificar “ondas” de proliferação e renovação celular promovidas pelo PlateSimilis 1 (funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP*, em seu sistema nanopolimérico bifásico), e como consequência analisar efeitos relacionados a biocompatibilidade e toxicidades desse promissor ingrediente ativo para formulações transdérmica dermocosméticas. Para os ensaios em 3D e 4D, utilizamos queratinócitos de pele humana (HaCat) sob o tratamento do PlateSimilis 1 (1 % p/v)). Para isso seguimos duas (2) condições de tratamento: 1) as células HaCat foram previamente tratadas com o PlateSimilis 1 (1 %) para posterior incubação das células com as nanopartículas de ouro para a indução da formação do esferoide por sistema magnético NanoShuttle™; e 2) os esferoides da linhagem HaCat foram formados pelo sistema magnético NanoShuttle™ para posterior tratamento com o PlateSimilis 1. Durante a formação do esferoide há uma movimentação das células, um processo de auto-organização do esferoide formado, um ponto crítico a ser avaliado sobre o tratamento com o PlateSimilis 1. As imagens de microscopia optica em campo claro (Figuras. 9A e 10A) mostram uma evolução no tamanho e densidade óptica dos esferoides no pre- e pós-tratamento com o PlateSimilis 1. Esses resultados indicam um crescimento progressivo e compactação célula-célula (HaCat) dos esferoides principalmente com o pós-tratamento com o PlateSimilis 1 (Figuras 9 e 10). Observamos na Figura 9A e B, em 48 h da formação do esferoide de queratinócitos, que as células previamente tratadas com PlateSimilis 1 para posterior indução da formação do esferoide, demonstraram um processo de proliferação celular mais ativo, desencadeando uma auto-montagem regulada dos queratinócitos de pele com aumento nítido da massa do esferoide (260 ± 10 pm) e sua agregação e compactação em 112 h (5 ^o dia) para a organização morfológica, indicando viabilidade metabólica e taxa de crescimento das células de 10 ± 3%, em relação ao controle sob suplementação do SFB. Na Figura 10A e B, observamos que os esferoides recém formados e então tratados com PlateSimilis 1 (1%), apresentaram proliferação celular ativa com aumento da massa do esferoide (300 ± 20 pm), quando comparados aos esferoides controle (mantidos apenas com suplementação, sem tratamento) (210 ± 5 pm). Em 32 h e 48 h observamos uma modelagem/organização de sua estrutura esférica. Indicando que até às 112 h (5 ^o dia) de manutenção e cultivo dos esferoides, as células tratadas com PlateSimilis 1 estavam metabolicamente ativas com tendência a estabilização. Resultados centrais nos benefícios promovidos pelo PlateSimilis 1 estão destacados na Figura 11 , onde podemos observar a cultura em esferoides na presença de proteínas da membrana basal, laminina e colágeno tipo I. A membrana basal é uma MEC especializada na aderência de (novas) células (processo de renovação celular), sendo produzida por células epiteliais normais, como os queratinócitos de pele humana. Ela é formada em um processo de várias etapas iniciado pelas células ligando-se à laminina na superfície celular e levando ao acúmulo de colágeno fibrilar I na estrutura da laminina nascente [20], (20) Rowe, R.G.; Weiss, S.J. Breaching the basement membrane: who, when and how? Trends Cell Biol. 2008 Nov; 18(11):560-74. doi: 10.1016/j.tcb.2008.08.007. Bourland, J., Fradette, J. & Auger, F.A. Tissue-engineered 3D melanoma model with blood and lymphatic capillaries for drug development. Sci Rep 8, 13191 (2018). https://doi.Org/10.1038/s41598-018-31502-6] .

[065] Neste contexto, o PlateSimilis 1 atuou como seu fator plaquetário espelho, o TB4 e funcionalizado com 5-HT e/ou seu precursor 5-HTP, fornecendo organização da membrana basal e induzindo a produção de laminina, com consequente aumento de colágeno tipo I [4,18], Vale destacar que a funcionalização do PlateSimilis 1 através de um cross-link não covalente com 5-HT e/ou seu precursor 5-HTP, é estratégico por ter a atuação do peptídeo mimético ao TB-4 e a 5-HT e/ou 5-HTP, ambos atuantes nos processos de cicatrização e regeneração de tecidos. Observamos na Figura 11A queratinócitos de pele humana (HaCat) na presença de laminina (10 pg) e tratadas com Platesimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico. Notamos que a organização de esferoides induzidos por sistema magnético NanoShuttle™ não foi capaz de manter os queratinócitos (+ laminina) agregados/organizados em uma só estrutura de esferoide. Em 16 h observamos 3 pequenos esferoides, onde após o tratamento com PlateSimilis 1 houve indução na organização celular gradual com amplo movimento celular (observado em 32 h e 48 h) até a unificação da massa esferoidal, onde observamos uma única estrutura em 112 h (5 ^o dia). A quantificação de laminina total mostrou que em 112 h (5 ^o dia) houve aumento de 2,5 vezes de laminina em relação ao tempo de análise de 32 h. Em contrapartida, no controle sem o tratamento com PlateSimilis 1 , observamos que os esferoides adquiriram formato de foice na presença de laminina, não levando a mesma organização celular promovida pelo tratamento com PlateSimilis 1 , uma organização esperada num processo de regeneração tecidual. Na Figura 11 B, mostramos imagens microscópicas representativas para ilustrar mudanças morfológicas de agregados de células 3D/esferoides na presença de colágeno tipo I (0,5 pg) e PlateSimilis 1 , durante um período de observação de 112 h (5 ^o dia). Observamos esferoides "revestidos" com fibras de colágeno tipo I sobre o tratamento com PlateSimilis 1 , tais fibras tiveram um aumento gradual observados mais intensamente em 48 h e 112 h. No gráfico da Figura 11C, observamos aumento na produção de colágeno 2,0 vezes maior em 112 h (5 ^o dia), quando comparado ao tempo de análise de 32 h. Essas fibras de colágeno tipo I podem ser associadas a melhora nas propriedades biomecânicas e arquitetura da matriz frente a proteínas da membrana basal, importante etapa no processo de regeneração tecidual [21], (21) Sosne G, Qiu P, Kurpakus-Wheater M. Thymosin beta 4: A novel corneal wound healing and anti-inflammatory agent. Clin Ophthalmol. 2007; 1 (3):201 -207] Tais resultados mostram que o PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico é um peptídeo biomimético promissor, demonstrando biocompatibilidade frente a exposição celular, induzindo o aumento da massa de esferoides de queratinócitos de pele humana, com metabolismo e proliferação ativos e regulados, induzindo uma coordenada organização celular na presença de laminina e aumento nas fibras de colágeno tipo I todos resultados relacionados aos processos de renovação celular e regeneração tecidual.

[066] Destacando o potencial da invenção descrita, os efeitos dos peptídeos derivados de TB-4 funcionalizados com 5-HT e/ou 5-HTP (PlateSimilis 1 ) na renovação celular, em cultura 3D, foram comparados aos peptídeos biomiméticos derivados de TB-4 sem funcional ização (PlateSimilis 2). E os resultados da Figura 12 mostram o melhor desempenho do PlateSimilis 1.

Detecção de p53 e ki-67 por Western blotting

[067] Utilizamos a imunodetecção de p53 e ki-67 por western blotting para garantir o controle da proliferação celular da linhagem HaCat sob tratamento com os peptídeos derivados de TB4, PlateSimilis 1 e 2 (1%). Para os experimentos de western blotting as células submetidas ao tratamento com os peptídeos, foram lisadas e submetidas a adição de inibidores de proteases e fosfatases (1 mM EGTA, 1 pg/ml aprotinina, 1 pg/ml leupeptina, 1 mM PMSF e inibidores de fosfatase (2 mM ortovanadato de sódio 50 mM NaF, 10 mM pirofosfato de sódio)). O lisado total proteico foi submetido a dosagem de proteína por kit BCA (Merck-Sigma-Aldrich) e 60 pg de proteínas totais foram adicionados a cada poço do gel de poliacrilaminda (SDS) 10%. Os géis foram transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF, e as membranas foram então incubadas com os anticorpos monoclonais específicos contra as proteínas alvo (anticorpos Cell Signaling). Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas são conjugadas com o anticorpo secundário marcado com peroxidase (HRP). Para o processo de revelação das proteínas usaremos o sistema ECLTM ou Super SignaITM.

[068] Os resultados em cultura 3D que demonstram a efetividade do PlateSimilis 1 em ativar o processo de renovação e proliferação celular, podem levantar questões em relação ao comportamento proliferativo dos queratinócitos frente ao tratamento com PlateSimilis 1. Desta forma, utilizamos os marcadores clássicos de índice de proliferação celular o Ki-67 e p53 (gene supressor tumoral). A baixa positividade para ki67 e a expressão normal de p53 garantem a segurança no tratamento das células HaCat pelo PlateSimilis 1. E os resultados por western blot mostraram que as células HaCat tratadas com PlateSimilis 1 (1% p/v) apresentaram baixíssima expressão de ki67, e mostram uma expressão normal de p53 (Figura 13). Reforçando a segurança do peptídeo derivado do fator TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP, PlateSimilis 1 .

Ensaio de formação de túbulos - Co-cultura fibroblastos de pele humana (HFF-1) e células endoteliais (HUVEC) Modelo 2D e Cultura heterotípica com matriz biomimética Modelo 3D - sob tratamento com PlateSimilis 1 (1%)

[069] Fibroblastos de pele humana (HFF-1 ) foram cultivados em placa de 96 poços, até atingirem confluência de ~80%, para atuarem como feeder/alimentador na co-cultura com células endoteliais. Subsequente a confluência dos fibroblastos de pele adicionamos sob essa monocamada células endoteliais (HUVEC) na densidade de 3 x 10 ⁴ céls/poço, em meio RPMI, 10% de SFB, 1% de 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina, por 24h. Após as células endoteliais atingirem confluência de ~60%, tratamos as células com os peptídeos derivados de TB-4 funcionalizados ou não com 5-HT e/ou 5-HTP (ver tabela 1), que apresentaram os melhores resultados nos ensaios de migração celular e em culturas 2D e 3D (esferoides de queratinócitos de pele humana). Após o tratamento com oPIateSimilis 1 , a placa foi mantida na estufa a 37 °C e retirada apenas para a captura das imagens a cada 2 h, sendo a mais representativa a de 16 h. Para isso, as fotografias foram tiradas em microscópio de luz invertida utilizando as objetivas de 10x ou 4x. Todos os experimentos foram feitos com as células entre passagens 6 a 9. As imagens foram capturadas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlbad, CA, USA), aumento de 10x (escala de 100 pm) depois de 16 horas de cultivo. Na Figura 14 observamos os resultados com o PlateSimilis 1 que foi capaz de induzir remodelamento (rearranjo conformacional e organização do citoesqueleto) das células endoteliais, células que antes se encontravam em estado de quiescência, passando a responder a organização celular. Observamos o comportamento das células endoteliais sob o feeder (fibroblastos de pele), onde claramente notamos pontos de ligação entre as células endoteliais (indicadas por setas vermelhas) e formação de estruturas tubulares (representada por círculos amarelos).

[070] Para o ensaio da cultura 3D para visualização por microscopia de fluorescência, a linhagem HUVEC foi mantida em cultivo na densidade de 3 x 10 ⁴ céls/poço, em meio RPMI, 10% de SFB, 1% de 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina, por 24h. Após esse período, a matriz biomimética CHEMICON Fibrin Gel (Merck, Darmstadt, Alemanha) foi adicionada à cada poço e incubados com as células por 24 h. Posteriormente, foi adicionado como tratamento, o PlateSimilis 1 (1%) e incubado por mais 24 h. Na próxima etapa o meio de cultivo foi removido, e as células HUVECs foram fixadas com PFA (4% PBS) por 10 min, e lavadas com PBS (1x), e permeabilizadas com Triton X-100 (0,1% de PBS) e bloqueado com BSA (albumina bovina, 3% em PBS 1x) por 1 hora. Subsequentemente, as células foram lavadas 3 vezes com PBS (1x) e incubadas por 16 h a 4°C em uma câmara húmida com os devidos anticorpos, ActinGreen 488, ReadyProbes Reagent (AlexaFluor 488 phalloidin) e marcador de núcleo DAPI-Invitrogen, ambos da Thermo Fisher Scientific (MA, USA) numa diluição e 1 :1000. As imagens foram capturadas pelo microscópio Luma Scope (Etaluma Inc, Carlbad, CA, USA), aumento de 10x (escala de 100 pm) depois de 72 horas de cultivo.

[071] Seguindo o mesmo contexto “Biotech-educated platelets” (tradução literal: plaquetas educadas por biotecnologia), investimos na execução de um modelo 3D para ensaios de angiogênese ex vivo, onde utilizamos uma matriz biomimética (Merck) rica em fibrinogênio, fibronectina e vitronectina, para analisar por microscopia de fluorescência a organização celular das células endoteliais e a reorganização do citoesqueleto (feixes de F-actina, em verde ActinGreen 488) após o tratamento com PlateSimilis 1. Essa solução atua na formação de microestruturas tubulares ex vivo, o que pode melhorar a microvascularização na região estimulada pelo PlateSimilis 1. Atuando sobre o suporte/" scalffold” biomimético o PlateSimilis 1 foi capaz de garantir a proliferação de HUVECs em culturas 3D e a formação de uma rede microvascular (estruturas) ex vivo sem exigir a adição de fatores de crescimento recombinantes adicionais (Figura 15).

[072] Ainda nas Figuras 15 e 16 que o PlateSimilis 1 foi capaz de induzir remodelamento (rearranjo conformacional e organização do citoesqueleto) das células endoteliais, células que antes se encontravam em estado de quiescência, passando a responder a organização celular. Observamos o comportamento das células endoteliais sob o feeder (fibroblastos de pele), onde claramente notamos pontos de ligação entre as células endoteliais (indicadas por setas vermelhas) e formação de estruturas tubulares (representada por círculos amarelos). A Figura 15 mostra o conjunto de imagens da organização do citoesqueleto das células endoteliais ativadas por PlateSimilis 1 , sob a perspectiva do gel/matriz (Fibrin Merck) por microscopia confocal através da detecção de F-actina (feixes no citoesqueleto celular) por marcação da faloidina (Alexa-green), núcleo celular marcado em azul (DAPI). Cytation - “time lapse” - Sistema de Imageamento multi-modal para monitoramento da Adesão e Proliferação de queratinócitos de pele humana (HaCat) tratadas com PlateSimilis 1 (peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP) e PlateSimilis 2 (peptídeo derivado de TB-4 não funcionalizado)

[073] A linhagem de queratinócitos de pele humana, HaCat, foi descongelada e em seguida colocada em cultivo em uma contagem e meio de cultivo apropriados para a monitoramento em “time-lapse” em microscópio Cytation 5 (Biotek), a fim de acompanhar a sua sedimentação, aderência e proliferação iniciada pelo contato, por via de sinalização justacrina. O tratamento foi seguido da seguinte forma: i) controle da HaCat com meio suplementado com 10% SFB; ii) células HaCat foram tratadas com 1 % de PlateSimilis 1 e PlateSimilis 2; iii) células HaCat foram tratadas com 1 % de PlateSimilis 1 + ácido ascórbico 5% (Nano Vit C, BioVital) o mesmo para o PlateSimilis 2 e iv) os queratinócitos de pele foram tratados com 1 % de PlateSimilis 1 + Niacinamida PC (DMS) 4%, o mesmo para o PlateSimilis 2. As imagens foram adquiridas a cada 10 minutos por 24 h.

[074] Na Figura 16 podemos observar queratinócitos de pele humana (HaCat) recém descongelados iniciando processos/eventos celulares, como a dinâmica de adesão e proliferação das células, com duas regiões bem definidas neste processo; i) filopodia ou "microspikes" (processo que as células usam para reconhecer seu ambiente, e envolve protrusões da membrana plasmática ricas em actina que funcionam como sensores de ambiente) e ii) o processo de lamellipodia (motilidade) bem identificado em queratinócitos. Com o tratamento estabelecido com PlateSimilis 1 , identificamos nos vídeos a intensificação de formações nascentes de aderências, com decorrente formação de protrusões aceleradas na proliferação celular sob o tratamento com PlateSimilis 1 , e potencializadas na presença de ácido ascórbico (5%) e niacinamida (4%), comparadas com o tratamento dos ativos individualmente introduzidos no sistema de cultura (Figura 16 A-F). Podemos concluir com esses resultados que o PlateSimilis 1 é um ingrediente ativo num sistema nanopolimérico bifásico, indutor do processo de renovação celular, da síntese de laminina e colágeno tipo I, tendo efeito sinérgico com os ingredientes ácido ascórbico e niacinamida.

Desenvolvimento de Formulações dermocosméticas para a incorporação do PlateSimilis 1 (peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP)

[075] Descrevemos a seguir os componentes das formulações spray, creme (oil-free) e gel, que foram selecionados de acordo com a estabilidade e compatibilidade com o PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico (Tabelas 2, 3, e 4). PlateSimilis 1 confere um cenário anti-oxidante por ação sinérgica com ativos antioxidantes como a vitamina C (Nano vit C), niacinamida PC e glutationa. O objetivo nesta etapa, foi desenvolver preparações minimalistas e estáveis para a incorporação do PlateSimilis 1.

Tabela 2. Formulação em spray com o PlateSimilis 1 em seu sistema Tabela 3. Formulação em creme (oil-free) com o PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico.

*F0 = Fase oleosa; **FA = Fase aquosa.

Tabela 4. Gel

PlateSimilis 1 ([Palmitoyl]-Octapeptídeo-5- 2%

Testes de Estabilidade das formulações com a incorporação do PlateSimilis 1 (peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5- HTP) - características organolépticas, valor de pH e de viscosidade em relação ao tempo e temperatura

[076] Para os testes foram levados em consideração fatores que afetam a estabilidade como alterações físicas e físico-químicas, como: aspecto, odor, cor, alterações de pH e viscosidade aparente.

[077] Adotamos os seguintes critérios para avaliar possíveis alterações após a incorporação do PlateSimilis 1 (PlateSimilis Éris) (peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP) nas formulações:

[078] Aspecto: a aparência e integridade das formulações mantendo o aspecto inicial em condições de armazenamento, com exceção em altas temperaturas, onde a percepção de pequena modificação foi aceita;

[079] Odor e cor: tais características foram monitoradas durante o armazenamento à luz solar indireta, onde espera-se normalidade. No entanto, em altas temperaturas espera-se leves modificações;

[080] Alterações de pH: variações superiores a ± 10% não foram aceitas, comparadas ao valor inicial de cada formulação, sob todas as condições de armazenamento;

[081] Viscosidade aparente: foram admitidas modificações, desde que não alterassem a percepção visual das amostras (ANVISA, 2004). [082] Tais análises de estabilidade normal foram monitoradas por 90 dias, e as formulações foram mantidas em várias condições de temperatura: temperatura ambiente e luz solar indireta (25 °C ± 0,5); geladeira (5,0 °C ± 0,5); e estufa em duas temperaturas (37,0 °C ± 0,5 e 45 °C ± 0,5). Os resultados obtidos podem determinar o tempo de vida útil, shelf life do produto/formulação e avaliar a incorporação e compatibilidade da formulação em relação ao PlateSimilis 1 (peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP). A periodicidade das leituras e observações nas condições de armazenamento das formulações com o PlateSimilis 1 foram, o tempo 0 (zero = t0) após 48 h de repouso de preparo, 1 ^o , 7 ^o , 15°, 30° e 90° dias (ANVISA, 2012). Empregamos a seguinte classificação para avaliar as formulações com o PlateSimilis 1 incorporado quanto ao aspecto, cor e odor: Normal - N; LM/A - levemente modificado/alterado; modificado - M e intensamente modificado - IM. As medidas de pH foram realizadas em pHmetro (Fisherbrand, USA). A viscosidade aparente foi avaliada em um viscosímetro spindle 10 (Fungilab). As análises foram realizadas a temperatura ambiente, 30 minutos após serem retiradas de suas condições de armazenamento. Seguimos os critérios de especificações organolépticas e físico-químicas das matérias-primas, segundo Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos, ANVISA, 2004.

[083] Os resultados da incorporação do PlateSimilis 1 refletem a estabilidade das preparações com uniformidade e ausência de formação de agregados. Observamos também a ação do PlateSimilis 1 como modificador de propriedades sensoriais na formulação creme (emulsão oil-free) tendo como a fórmula base, a cera Polawax. O PlateSimilis 1 em seu sistema de delivery nanopolimérico bifásico pode conferir alterações sensoriais como intensificação de brilho e cremosidade. Na sequência detalhamos os testes de estabilidade das formulações spray, creme e gel (Figura 17).

[084] A avaliação preliminar da estabilidade demonstrou que, as formulações spray (por exemplo: para água micelar), creme (emulsão oil-free) e gel mantiveram aspetos normais nas condições impostas. Mudanças nas propriedades reológicas (propriedades físico-químicas) representam um fator crítico que indicam predisposição para a ocorrência de problemas, principalmente no caso de emulsões, que são sistemas termodinamicamente instáveis. Tais alterações podem interferir na homogeneidade do creme e na coalescência das gotículas oleosas. Desta forma, testes de estabilidade devem ser prioridade no desenvolvimento de formulações, bem como no desenvolvimento de novos ativos (nanoestruturados) para sua eficiente incorporação. Na Figura 17 e Tabela 5 observamos as formulações creme e gel durante o teste de estabilidade por oscilações do pH (sem modificações aparentes e significativas na homogeneidade das formulações, sem separação de fases). Ainda na Tabela 5 temos os resultados mais finos das análises, indicando a avaliação das características organolépticas, viscosidade e oscilações no pH. Ao final de 60 e 90 dias, as formulações gel e creme apresentaram o aspecto levemente modificado/alterado quando submetidas a altas temperaturas em estufa (37 °C à 45 °C), e ao final de 90 dias apresentaram o aspecto levemente modificado/alterado à luz solar. Na análise da viscosidade aparente (cP), não foram detectadas alterações (perceptíveis ou sob leitura no viscosímetro) nas quatro (4) condições de armazenamento, desde o início das análises em TO até o final do tempo de estudo (90 dias). Concluímos assim, que a incorporação do PlateSimilis 1 (em sistema nanoestruturado bifásico) nas formulações foi eficaz, sem alteração da estabilidade primária das formulações (gel, creme/emulsão e spray) nas condições avaliadas.

Tabela 5. Avaliação das Características Organolépticas, Viscosidade e pH das Formulações com PlateSimilis Éris (Spray, emulsão creme oil-free e gel) sob Diferentes Condições de Armazenamento.

Testes in vitro e testes clínicos do PlateSimilis 1 (PlateSimilis Éris - peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP) seguindo a OECD e o Guia de Segurança em cosméticos da ANVISA

[085] Foram realizados testes de toxicidade e segurança para enquadrar o PlateSimilis 1 (PlateSimilis Éris, peptídeo derivado de TB-4 funcionalizado com 5-HT e/ou 5-HTP) como um ingrediente dermocosmético seguro e eficaz, conforme previsto pela RDC n° 48/2013 e Guia para Avaliação de Segurança de Produtos Cosméticos, 2 ^o edição, ANVISA (2012). Os testes realizados foram os seguintes: permeabilidade e opacidade em córnea bovina (BCOP) - teste realizado em empresa especializada (InvitroCell -método específico da empresa) de acordo com a OECD - 437; fototoxicidade (OECD 432) in vitro Epiderme humana reconstituída in vitro (SkinEthic RHE) EpiSkin de acordo com OCDE n° 439. Somados a estes testes de segurança e toxicidade, foi realizado o teste de eficácia percebida em voluntários para comprovação de sua ação na renovação e migração celular, e sustentação do “claim’Vatributos anti-aging, anti-rugas e anti-idade. Este item representa uma sucessão de resultados positivos, uma evolução promissora no desenvolvimento do PlateSimilis 1 , desde os testes iniciais in vitro, como: i) análise em BigData dos testes de ômicas do conteúdo plaquetário; ii) com a seleção da sequência dos primeiros PlateSimilis (in sílico) através de molecular docking e dinâmica molecular, até sua síntese; iii) os testes iniciais de viabilidade celular, primeiros testes de segurança; iv) a escolha de um sistema de drug delivery para aumentar a performance como ingrediente ativo de uso tópico, um sistema nanopolimérico bifásico, dando uma assinatura plaquetária; v) os testes in vitro em cultura 3D e 4D, em esferoides de queratinócitos de pele humana indicando os efeitos do PlateSimilis 1 e seu sistema de delivery (nanopolimérico bifásico) nos processos de renovação e regeneração celular, incluindo os benefícios no aumento da produção de laminina e colágeno tipo I; vi) os testes de incorporação do PlateSimilis 1 em formulações cosméticas (gel, creme (emulsão oil-free) e spray); vii) testes de estabilidade das formulações contendo o PlateSimilis 1 ; viii) para a então avaliação de segurança e toxicidade in vitro de acordo com a OECD e ANVISA. Os resultados obtidos nessas 8 etapas de avaliações serviram como base para reinvindicação da presente invenção com PlateSimilis 1 - PlateSimilis Éris (com peptídeos biomiméticos ao polipeptídeo Timosina-B4 funcionalizado com 5-HT e/ou seu precursor biológico 5-HTP), para o mercado industrial de dermocosméticos.

[086] Para os testes in vitro para a avaliação de segurança e toxicidade do PlateSimilis 1 , seguimos os testes primordiais indicados no Guia para avaliação de segurança de produtos cosméticos e matérias-primas da ANVISA e OECD, que são: i) avaliação do potencial de irritação ocular pelo método de BCOP (bovine corneal opacity and permeability test); ii) ensaio de fototoxicidade in vitro pelo método descrito pela OECD 432; e iii) avaliação da irritação dérmica in vitro em modelo SKINETHIC™ RHE (Epiderme humana reconstruída, EpiSkin Brasil) de acordo com método OECD 439 (2020). Todos esses testes foram realizados na empresa InVitroCell do Grupo Investiga, localizada em Campinas, SP. Os métodos utilizados são de propriedade da empresa contratada, como mencionamos em métodos. Enviamos para as análises na empresa InVitroCell, uma solução de 1 % do PlateSimilis 1 em seu sistema nanopolimérico bifásico. Os resultados das análises dos três testes indicaram a segurança do PlateSimilis 1 , a Figura 18 mostra os resultados dos laudos de segurança emitidos pela empresa contratada.

[087] Após os testes de segurança in vitro, seguimos para os testes clínicos de segurança em voluntários, também utilizando os serviços de empresa especializada, Allergisa do Grupo Investiga. Foram realizados os seguintes testes: i) avaliação do potencial de irritabilidade primária, acumulada e sensibilização cutânea de um produto em condições controladas e maximizadas (RIPT) com 69 voluntários/participantes e o teste ii) avaliação do potencial de fotoalergia e fototoxicidade cutânea de um produto em condições controladas e maximizadas (FOTO) com 35 voluntários/participantes. Os resultados dos testes indicaram a segurança do PlateSimilis 1 , não houve nenhum relato de reações ou incômodo pelos participantes, sustentando os “claims’/atributos de dermatologicamente testado e hipoalergênico (Figura 19).

Testes clínicos de Eficácia do PlateSimilis 1 (PlateSimilis Éris) por empresa especializada - Análise dos efeitos Anti-aging por voluntários (25 participantes)

[088] Na sequência dos testes clínicos de segurança, realizamos os testes clínicos de eficácia do PlateSimilis 1 , testes estes realizados na empresa Allergisa do Grupo Investiga. O teste escolhido para atestar o efeito do PlateSimilis 1 como um indutor de renovação celular foi “avaliação da eficácia percebida pelo participante da pesquisa de um produto em condições normais de uso”, onde foram selecionados os seguintes benefícios/efeitos que o PlateSimilis 1 (em sistema nanopolimérico bifásico) pode proporcionar de acordo com os testes de laboratório em cultura 3D e 4D: 1) hidratação; 2) brilho e luminosidade; 3) vitalidade; 4) sinais de envelhecimento e 5) aparência geral da pele. E para sustentar os efeitos do PlateSimilis 1 nos ensaios in vitro em modelos celulares em 3D e 4D, correlacionamos com os efeitos constatados pelos participantes dos testes clínicos para os atributos/”claims” anti-rugas, anti-aging e anti-idade, onde 87% dos (25) participantes do teste clínico indicaram o aumento da hidratação o que corrobora os efeitos do PlateSimilis 1 em estimular a produção de proteínas da matriz extracelular e filamentos de actina (um efeito de barreira para evitar perda de água, com maior adsorção da água na matriz extracelular); 87% dos participantes também indicaram o aumento do brilho/luminosidade efeitos conectados ao sistema nanopolimérico bifásico do PlateSimilis 1 ; 82% do indivíduos participantes do teste indicaram um aumento na vitalidade da pele. Interessante ressaltar que esse efeito percebido pelos voluntários, nos levou a validá-lo sob o ponto de vista molecular, e realmente aponta que pode ser correlacionado ao processo de renovação celular e aumento de estruturas de sustentação como laminina, colágeno tipo I e f-actina; o aumento das proteínas de matriz extracelular, o aumento de filamentos de actina, bem como o aumento na proliferação e renovação celular justificam que 70% dos participantes notaram a diminuição nos sinais de envelhecimento, e 92% dos participantes confirmaram melhora na aparência geral da pele. Resultados que sustentam os “claims7atributos de anti-rugas, anti-idade e anti-aging para o PlateSimilis 1 (Figura 20).

Análise estatística

[089] Os resultados obtidos foram analisados com auxílio do software GraphPad Prism 8.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA). A análise estatística foi realizada usando Anova seguida de test-t, quando comparamos apenas 2 grupos distintos, e de teste de Turkey para comparações múltiplas. Todos os experimentos foram repetidos ao menos três vezes e expressos como média ± desvio padrão. Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância estabelecido foi de 5% (p<0,05).