Biokompatible Klebstoffe oder Klebemittel werden in vielen Bereichen der Medizin verwen- det. Dabei kommt es nicht nur darauf an, dass das Klebemittel eine hohe Klebewirkung aufweist, sondern es ist ebenfalls wichtig, dass das Klebemittel gut verträglich und damit biokompatibel ist. Aus diesem Grund ist man bemüht, Klebemittel bereitzustellen, die bevorzugt aus gut verträglichen Komponenten bestehen. So sind beispielsweise aus US 5,209,776, US 2005/02081 14A1 oder US 4,280,954 Klebemittel bekannt, die die Komponenten Kollagen und Hyaluronsäure enthalten können.

Ein Problem dieser Klebemittel besteht z.B. darin, dass diese Klebemittel entweder denaturiertes Kollagen enthalten, eine kovalente Bindung zwischen Kollagen und Hyaluronsäure erzeugt wird und/oder Katalysatoren oder andere Bestandteile eingesetzt werden, die ein erhöhtes Allergiepotential mit sich bringen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, verbesserte Klebemittel sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfin- dung, Klebemittel sowie Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen, die eine ausreichende Klebewirkung mit einer hohen Biokompatibilität und einem geringen Allergiepotenzial verbinden.

Gelöst wird die Aufgabe durch die Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung eines Kle- bemittels, dadurch gekennzeichnet, dass eine wässrige Kollagenlösung mit einer Konzentration an gelöstem Kollagen von 0,01 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 2 bis 5 mit einer wässrigen Hyaluronatlösung mit einer Hyaluronat- oder Hyaluronsäurekonzentration von 0,02 bis 5% (w/v) und einem pH-Wert von 5 bis 7, bevorzugt von 6 bis 7, gemischt wird und das erhaltene Präzipitat von der flüssigen Phase getrennt wird. Bevorzugt wird die Mischung der wässrigen Kollagenlösung und der wässrigen Hyaluronatlösung gerührt bis sich das Präzipitat gebildet hat.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass die Herstellung des Klebemittels ohne Zugabe eines Katalysators auskommt.

Das erhaltene Präzipitat ist ein biokompatibles Klebemittel mit guter Klebewirkung, einer hohen Biokompatibilität und einem geringen Allergiepotential. Das erfindungsgemäße Klebemittel enthält oder besteht aus 1 bis 20 Gew.-% Kollagen, 0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und 65 bis 98,5 Gew.-% Wasser; wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

Nach Durchmischung der beiden Komponenten, wässrige Kollagenlösung und wässrige Hyaluronatlösung, strukturieren sich die Ausgangspolymere als Polyionenkomplex (PIK) aus positiv geladenem Kollagen und negativ geladener Hyaluronsäure. Zwischen den Polymeren entstehen ionische Wechselwirkungen und keine kovalenten Bindungen. Mittels eines Polyionenkomplexes wird über den Wechselwirkungsmechanismus eine verbesserte Nachhaltigkeit der Klebeeigenschaften erreicht. Die funktionellen Gruppen der Polymeren sind über ionische Wechselwirkungen reversibel miteinander assoziiert und sind somit nach einer vorübergehenden Trennung gleich wieder voll reaktionsfähig. Durch die Wechselwirkung der beiden Polymeren ergeben sich eine flüssige Phase und eine gelartige, klebrige feste Phase als Präzipitat (im Weiteren auch als Copräzipitat oder Klebemittel bezeichnet). Das biokompatible Klebemittel, also die feste, klebrige Phase, das Präzipitat oder das Copräzipitat, wird durch Trennung von der flüssigen Phase gewonnen. Zur Trennung der beiden Phasen können verschiedene Verfahren wie beispielsweise Zentrifugation, Filtration oder einfaches Dekantieren eingesetzt werden. Die gebildeten PIK's des Präzipitats besitzen im Weiteren funktionelle, insbesondere nukleophile Gruppen, die eine fortwährende Wechselwirkung mit umgebenden zellulären Systemen bzw. Geweben gewährleisten können. Die freien funktionellen Gruppen der Polymere im Präzipitat (Klebemittel) können somit Bindungen mit der Umgebung, z. B. in Form von Geweben oder Gerüstmaterialien, eingehen. Das Klebemittel ist insbesondere geeignet für eine Anwendung im medizinischen Bereich.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wässrige Kollagenlösung eingesetzt, die eine Konzentration an gelöstem Kollagen aufweist von 0,01 % bis 5% (w/v), bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Kollagenlösung. Bevorzugt weist die wässrige Kollagenlösung eine Konzentration an gelöstem Kollagen auf von 0,1 % bis 1 % (w/v), jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Kollagenlösung.

Die wässrige Kollagenlösung weist einen pH-Wert im sauren Bereich auf von pH 2 bis pH 5, bevorzugt einen pH-Wert von pH 2,3 bis pH 4,5. Unter gelöstem Kollagen wird für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Kollagen verstanden, welches in der wässrigen Kollagenlösung gelöst vorliegt und im Wesentlichen nicht- hydrolysiert und/oder nicht-denaturiert ist. Dabei kann das Kollagen beispielsweise als nati- ves Kollagen vorliegen oder renaturiert worden sein. Bevorzugt liegt das gelöste Kollagen in der wässrigen Kollagenlösung in nativer tripelhelikaler Struktur vor. Die Gewinnung von solchem Kollagen ist dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Bevorzugt kann das Kollagen aus der Haut, insbesondere aus der Haut von Tieren, wie beispielsweise Schweinen gewonnen werden.

Das erfindungsgemäß verwendete Kollagen enthält oder besteht bevorzugt aus Kollagen Typ I oder einer Mischung verschiedener Kollagen Typen, wobei bevorzugt Kollagen vom Typ I in der Mischung im Vergleich zu jedem einzelnen anderen Kollagen Typ den größten Massenanteil ausmacht. Andere Kollagen-Typen können beispielsweise Kollagen vom Typ II, III, V sein. Es können aber auch andere Kollagen-Typen in der Mischung vorhanden sein. Bevorzugt handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Kollagen um Kollagen Typ I in im Wesentlichen reiner Form oder um eine Mischung verschiedener Kollagen Typen, wobei Kollagen vom Typ I mindestens 30%, besonders bevorzugt mindestens 50% der gesamten Kollagenmasse ausmacht. Das Kollagen kann Atelokollagen und/oder Tropokollagen enthalten oder daraus bestehen. Atelokollagen zeichnet sich dadurch aus, dass es sich dabei um gelöstes Kollagen ohne Telopeptiden handelt.

Die wässrige Kollagenlösung wird im erfindungsgemäßen Verfahren gemischt mit einer wässrigen Hyaluronatlösung. Bevorzugt wird dabei Hyaluronsäure oder Hyaluronat eingesetzt, welches ein mittleres Molekulargewicht aufweist von 1 .400 bis 2.400 kDa. Die wässrige Hyaluronatlösung weist eine Hyaluronsäurekonzentration oder eine Hyaluronatkonzen- tration auf von 0,02% bis 5% (w/v), bevorzugt von 0,2% bis 1 % (w/v), jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Hyaluronatlösung. Bei dem verwendeten Hyaluronat handelt es sich um ein Salz der Hyaluronsäure mit verschiedenen Kationen, bevorzugt um das Natriumsalz der Hyaluronsäure.

Die wässrige Hyaluronatlösung weist vor der Mischung mit der wässrigen Kollagenlösung einen pH-Wert auf von pH 5 bis 7 oder pH 6 bis pH 7, bevorzugt von pH 5,5 bis 6,5, beson- ders bevorzugt von pH 6,3 bis pH 6,5.

Die Konzentrationsangaben für Kollagen und Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat sowie die pH- Wertbereiche für die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung vor der Mischung der beiden wässrigen Lösungen sind wesentliche Komponenten dafür, dass sich das Präzipitat und damit das gewünschte Klebemittel ohne Verwendung eines Katalysators bilden kann. Somit wird sichergestellt, dass das Klebemittel einerseits Kollagen in nativer oder renaturierter Form enthält und damit die Bildung eines Polyionenkomplexes mit der Hyaluronsäure erlaubt sowie andererseits der Einsatz von Katalysatoren, die möglicherweise allergenes Potential aufweisen oder nur wenig biokompatibel sind, vermieden werden kann.

Das Allergiepotential des erhaltenen Klebemittels kann weiter gesenkt werden, wenn bei- spielsweise Hyaluronat oder Hyaluronsäure nicht-tierischen Ursprungs, bevorzugt bakteriellen Ursprungs eingesetzt wird. Dieses kann beispielsweise biotechnologisch gewonnen worden sein. Besonders günstig hat es sich erwiesen, wenn das Hyaluronat bzw. die Hyaluronsäure peptidfrei ist. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung miteinander gemischt, um ein Präzipitat zu erzeugen, welches, von der wässrigen Phase getrennt, ein erfindungsgemäßes Klebemittel darstellt. Besonders günstige Ergebnisse werden erzielt, wenn die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung in einem festgelegten Massenverhältnis zueinander miteinander gemischt werden. Bevorzugt werden die wässrige Kollagenlösung und die wässrige Hyaluronatlösung in einem Massenverhältnis von 1 :0,5 bis 1 :1 ,5 miteinander gemischt, besonders bevorzugt in einem Massenverhältnis von 1 :0,7 bis 1 :1 ,2.

Die Effizienz der Herstellung des Klebemittels mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann noch dadurch gesteigert werden, dass die Mischung bis zur Bildung eines Präzipitats gerührt wird.

Nach Bildung des Präzipitats wird das Präzipitat von der wässrigen Phase getrennt und kann als erfindungsgemäßes Klebemittel verwendet werden. Dabei kann die Trennung des Präzi- pitats von der wässrigen Phase des Gemisches mittels herkömmlicher Verfahren erreicht werden, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration und/oder Dekantieren.

Aufgrund der Wahl von Kollagen in nativem oder renaturiertem Zustand und Hyaluronsäure bzw. Hyaluronat als Komponenten des Klebemittels, zeichnet sich das erhaltene Klebemittel durch eine hohe Biokompatibilität aus. Grundsätzlich können wässrige Kollagenlösung und/oder wässrige Hyaluronatlösung und somit ggf. auch das erhaltene Klebemittel daneben weitere Bestandteile aufweisen, wobei hier bevorzugt biokompatible Bestandteile zum Einsatz kommen. Beispielsweise können biokompatible Ionen, Salze, organische oder anorganische Säuren und/oder Basen, Zucker, Proteine, Aminosäuren, Oligopeptide, Telopeptide und/oder Gelatine sowie Gemische davon verwendet werden. Um ein besonders homogenes und in seiner Klebewirkung einheitliches Klebemittel bereit zu stellen, kann es im erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, das erhaltene Präzipitat zu homogenisieren. Diese Homogenisierung kann beispielsweise durch Behandlung des Präzipitats mit Scherkräften erfolgen. Der optimale Bereich für die Umfangsgeschwindigkeit einer Rotor-Stator-Anordnung zur Erzeugung der Scherkräfte liegt dabei im Bereich von 2 bis 25 m/s. Das erhaltene Präzipitat kann vor, während oder nach der Abtrennung von der flüssigen Phase homogenisiert werden. Bevorzugt erfolgt die Homogenisierung nach Abtrennung des Präzipitats von der flüssigen Phase. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Klebemittel hergestellt werden, welches sich durch eine besonders günstige Stabilität in höheren pH-Bereichen auszeichnet. Insbesondere hat sich gezeigt, dass in einem pH-Bereich von 5,0 bis 7,5 eine besonders günstige Stabilität erreicht wird. Dies wird beispielsweise erreicht, in dem im Verfahren Arginin und Calciumhydroxid zugesetzt werden, so dass das erhaltene Präzipitat 1 bis 6 Gew.-% Arginin und 1 bis 6 Gew.-% Calciumhydroxid enthält, wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Präzipitats beziehen. Dabei kann das Arginin und/oder Calciumhydroxid der wässrigen Kollagenlösung und/oder der wässrigen Hyaluronatlösungen vor ihrer Mischung und/oder dem abgetrennten Präzipitat zugesetzt werden. Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren der wässrigen Kollagenlösung Arginin und der wässrigen

Hyaluronatlösung Calciumhydroxid vor der Mischung der wässrigen Kollagenlösung und der wässrigen Hyaluronatlösung zugesetzt.

Bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren das Arginin derart zugesetzt, dass im Klebemittel eine Konzentration von 1 bis 6 Gew.-% Arginin erreicht wird, wobei sich die Anga- ben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

Das Calciumhydroxid kann derart zugesetzt werden, dass im Klebemittel eine Konzentration von 1 bis 6 Gew.-% Calciumhydroxid erreicht wird, wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

Bevorzugt wird das Calciumhydroxid als wässrige Lösung zudosiert.

In einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Zugabe des Arginins und/oder des Calciumhydroxids während der Homogenisierung des Präzipitats.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Klebemittel, enthaltend oder bestehend aus: 1 bis 20 Gew.-% Kollagen,

0,5 bis 15 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und

65 bis 98,5 Gew.-% Wasser;

wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält oder besteht das erfindungsgemäße Klebemittel aus:

5 bis 15 Gew.-% Kollagen,

3 bis 10 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat und

75 bis 92 Gew.-% Wasser;

wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Klebemittels, die bei höheren pH- Bereichen eine verbesserte Stabilität aufweist, enthält Arginin und Caiciumhydroxid. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält oder besteht das erfindungsgemäße Klebemittel aus: 1 bis 15 Gew.-% Kollagen,

0,5 bis 10 Gew.-% Hyaluronsäure oder Hyaluronat

1 bis 6 Gew.-% Arginin

1 bis 5 Gew.-% Caiciumhydroxid und

75 bis 95 Gew.-% Wasser;

wobei sich die Angaben in Gew.-% auf das Gesamtgewicht des Klebemittels beziehen.

Das erfindungsgemäße Klebemittel kann sich insbesondere dadurch auszeichnen, dass es keine weiteren klebrigen oder Haftungsvermittelnden Substanzen (engl,„tackifying agent") enthält. Unter solchen weiteren klebrigen oder Haftungsvermittelnden Substanzen können beispielsweise verstanden werden Dextran, Polyglucoside, Polyvinylpyrrolidon, bioresorbier- bare Stärke oder Derivate davon und/oder bioresorbierbare Zellulose bzw. Derivate davon, wie z.B. Celluloseether und deren Salze. Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Klebemittels können das Arginin und/oder das Caiciumhydroxid den entsprechenden wässrigen Kollagen- bzw Hyaluronsäure- oder Hyaluronatlösungen vor ihrer Mischung und/oder direkt dem abgetrennten Präzipitat zugesetzt werden. Vorzugsweise wird das Caiciumhydroxid als wässrige Lösung zudosiert. Zur Erzielung eines homogenen Produkts sowie zur weiteren Verbesserung der adhäsiven Eigenschaften des Präzipitats (Polyionenkomplexes) wird das Präzipitat homogenisiert, beispielsweise durch Einsatz von vorgewählten Scherkräften. Die Homogenisierung kann bereits während der Zugabe des Arginins und/oder des Calciumhydroxids erfolgen. Das erfindungsgemäße Klebemittel zeichnet sich durch eine besonders günstige Klebewirkung aus, wenn im Klebemittel Kollagen und Hyaluronsäure oder Hyaluronat im Gewichtsverhältnis von 0,5:1 bis 5:1 vorliegen.

Das erfindungsgemäße Klebemittel kann nach dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Klebemittels hergestellt sein.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Klebemittels im medizinischen Bereich. Insbesondere kann das erfindungsgemäße Klebemittel verwendet werden als chirurgischer Kleber, zur lokalen Einbringung von Zellen mit oder ohne Zellträgern, zur lokalen Einbringung von Wirkstoffen und/oder Wirkstoffträgern, zur Behandlung von Wunden (äu ßerlich und/oder im Körper) sowie bei der Implantation von Medizinprodukten.

Die Erfindung wird an Hand nachfolgender Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Figuren:

Figur 1 : zeigt Ergebnisse aus der SDS-PAGE-Untersuchung von mit Säurelösungen extrahierten nativen Kollagenen, wobei in Spur 1 ein Molmassenstandard (Bande bei 64, 98, 148 und 250 kDa), in Spur 2 ein Kollagenstandard

(Mischung aus Kollagen Typ I und Kollagen Typ II) und in Spuren 3 bis 7 mit Säurelösungen extrahierte native Kollagene gezeigt sind. Es bedeuten: Col I = Kollagen Typ I (mit a1/a2-Ketten bei ca. 100 kDa, ß1 1 /ß 12- Ketten bei ca. 200 kDa und γ-Ketten bei ca. 300 kDa); Col III = Kollagen Typ III; Col V = Kollagen Typ V. Figur 2: zeigt das IR-Spektrum eines Copräzipitats aus Atelokollagen

Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs.

Figur 3: zeigt die Ergebnisse einer Adhäsivitätsbestimmung in vitalem Knorpel- (A) und

Knochengewebe (B). Dargestellt sind die Durchschnittswerte aus 5 Messungen mit der Standardabweichung als Fehlerbalken. Beispiele:

Zunächst wird die Aufbereitung der Schweinehaut für die Kollagenproduktion näher beschrieben: Rohe, enthaarte und maschinell weitgehend entfettete Schweinehaut (1 ,5 bis 2,5 mm dick), die gegebenenfalls in einer NaCI-Lösung zur Konservierung gelagert war, wird in Stücke (etwa 2 bis 4 mm ² Oberfläche) geschnitten. Danach wird in folgenden Schritten vorgegangen.

- Vorreinigung: Abtrennung von Schmutz- und Blutresten sowie gegebenenfalls zur NaCI- Entfernung; zur Hydratisierung und Auflockerung des Gewebes wird die geschnittene Haut mit der 5-fachen Wassermenge dreimal unter Rühren gewaschen (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit).

- Hautentfettung: die gewaschene Haut wird dreimal mit reinem Aceton (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Aceton-Verhältnis 1 :5 w/v) unter Rühren extrahiert.

- Aufquellen der Haut: zur nochmaligen Hydratisierung der Haut wird diese nach der Aceton- extraktion erneut dreimal mit reinem Wasser (jeweils 2 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Wasser- Verhältnis 1 :5 w/v) unter Rühren extrahiert.

- Eiweißabtrennung: nicht kollagene Eiweiße sind aus der Haut abzutrennen. Zu diesem Zweck wird eine Lösung, die 6% NaCI (w/v) und 1 % Ameisensäure (w/v) enthält, bereitet. Die aufgequollene Haut wird mit dieser Lösung zweimal unter Rühren extrahiert (jeweils 24 Stdn. Behandlungszeit, Haut-Lösung-Verhältnis 1 :5 w/v).

- nochmaliges Aufquellen der Haut - dieser Schritt erfolgt analog. Wie bei allen o. g.

Behandlungen wird nach Ablauf der Zeit die Haut von dem Extraktionsmittel abgetrennt. Nach der Vorbehandlung kann die Kollagenextraktion aus der Schweinehaut auf unterschiedlichen Wegen erfolgen.

Beispiel 1 : Gewinnung von Tropokollagen

Bei der Extraktion mittels Essigsäure werden 20 g der aufbereiteten Haut mit 125 ml Essig- säure (0,1 M bis 1 ,0 M, bevorzugt 0,5 M) versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 25 °C extrahiert. Anschließend wird die flüssige Phase (Kollagenlösung) von der festen Phase (Hautrückstand) abgetrennt. Die Kollagenlösung wird dann mittels Ultrafiltration (Cross-Flow- Filtration an einer UF-Membrane aus Polyethersulfon, MWCO 50 kDa) gereinigt und aufkonzentriert. Die Kollagenmenge kann über eine Aminosäureanalyse oder eine Hydroxyprolin- bestimmung nach der Methode von Stegemann und Stalder ermittelt werden. Die Bestimmung des Anteils an nativem Kollagen kann mittels CD-Spektroskopie und SDS-PAGE- Elektrophorese erfolgen. Das auf diesem Wege extrahierte Kollagen liegt als Tropokollagen vor (siehe Tabelle 1 und Abbildung 1 ).

Bei der Extraktion mittels Harnstoff werden 20 g der aufbereiteten Haut mit 125 ml Harn- Stofflösung (4 M bis 8 M, bevorzugt 6 M) versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 25 °C extrahiert. Anschließend wird die Kollagenlösung vom Hautrückstand abgetrennt und mittels Dialyse (Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose, Porengröße 8 - 15 kDa) gegen 0,1 M Essigsäure gereinigt. Das Kollagen liegt ebenfalls als Tropokollagen, hier renaturiert, vor (siehe Tabelle 1 ).

Beispiel 2: Herstellung von Atelokollagen aus Schweinehaut

20 g der aufbereiteten Haut werden mit 125 ml einer 0,5 M Essigsäurelösung, die 5 % Pep- sin (w/v) enthält, versetzt und unter Rühren 48 Stdn. bei 5 'C extrahiert. Anschließend wird 1 I einer 0,1 M Essigsäurelösung zugesetzt und die Mischung zur weiteren Enzymeinwirkung drei Wochen bei 25 °C stehen gelassen. Nach Zugabe von 0,1 M Essigsäure bis zu einem Gesamtvolumen von 3 I und Einstellung des pH-Wertes auf 8 bis 9 mittels 10 M NaOH wird das Pepsin gefällt und durch Zentrifugation vom Überstand (Kollagenlösung) abgetrennt. Zur Reinigung der gewonnenen Kollagenlösung wird der pH-Wert auf 3 bis 4 mit Essigsäure eingestellt und das Kollagen mit NaCI (2,5 M NaCI in der Gesamtmischung) ausgefällt und dann abzentrifugiert. Es folgen zwei weitere Reinigungsschritte. In jedem dieser Schritte wird das Kollagen erneut in 0,1 M Essigsäure aufgelöst, mit NaCI (1 ,8 M NaCI in der Gesamtmischung) wieder ausgefällt und anschließend abzentrifugiert. Um enthaltenes NaCI zu entfer- nen, wird das gereinigte Kollagen zum Schluss gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert (Dialyseschlauch aus regenerierter Cellulose, Porengröße 8 - 15 kDa). Das Kollagen liegt als Atelokollagen vor (siehe Tabelle 1 ).

Tabelle 1 : Aminosäurezusammensetzung von Tropokollagen (Beispiel 1 ) und Atelokollagen

(Beispiel 2)

Pro [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 134,90 135,32 130,94

Gly [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 331 ,87 336,85 337,22

Ala [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 1 1 1 ,29 109,37 108,23

Val [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 25,89 22,97 23,55

Met [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 4,23 3,03 4,86

lle [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 10,30 9,69 10,34

Leu [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 25,47 24,52 22,32

Tyr [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 1 ,69 3, 12 1 ,45

Phe [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 13,54 13,67 12,44

His [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 5,92 5,46 7,57

Hyl [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 5,77 6,30 6,1 1

Lys [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 28,74 25,99 27,33

Arg [Anzahl pro 1000 Aminosäuren] 52,04 50,76 46,08

Hyp/Pro 0,59 0,62 0,68

Hyp/(Hyp+Pro) 0,37 0,38 0,40

Hyl/Lys 0,20 0,24 0,22

Hyl/(Hyl+Lys) 0, 17 0,20 0,18

Hyl/Hyp 0,07 0,07 0,07

μg Protein inj 3, 17 10, 18 2,78

μg Protein/Probe 3959,32 2544,37 2782,96

μg Collagen 3251 ,17 2216,06 2550,18

% Collagen 82, 10 87, 10 91 ,60

Beispiel 3: Herstellung eines Klebemittels aus Kollagen auf der Basis von Tropokollagen

Eine wie in dem Beispiel 1 gewonnene Kollagenlösung, die hauptsächlich Tropokollagen- moleküle enthält (Kollagenkonzentration 0,1 bis 1 ,0 % w/v) und einen pH-Wert von 2,3 bis 4,5 aufweist, wird mit einer bereits hergestellten Lösung aus Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs (pH 6,3 bis 6,5, Konzentration 0,2 bis 1 ,0 % w/v, MG des Hyaluronats 1 .400 bis 2.400 kDa) im Massenverhältnis 1 :1 (Kollagenlösung zu Hyaluronatlösung) gemischt. Die Mischung ist dann bis zur Bildung eines Copräzipitats zu rühren. Dieses wird von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren oder Dekantieren abgetrennt. Das Copräzipitat ist hochadhäsiv und stellt das Klebemittel dar. Das Copräzipitat enthält 5,0 bis 15,0 % (w/w) Kollagen, 3,0 bis 10,0 % (w/w) Hyaluronsäure und 75,0 bis 92,0% Wasser.

Beispiel 4: Herstellung eines Klebemittels aus Kollagen und Hyaluronsäure unter Anwendung von Atelokollagen In Beispiel 4 wird die Herstellung eines Klebemittels auf der Basis von Atelokollagen beschrieben. Eine wie im Beispiel 2 gewonnene Kollagenlösung, die hauptsächlich

Atelokollagenmoleküle enthält (Kollagenkonzentration 0,1 bis 1 ,0 % w/v) und einen pH-Wert von 2,3 bis 4,5 aufweist, wird mit einer bereits hergestellten Lösung aus Na-Hyaluronat bio- technologischen Ursprungs (pH 6,3 bis 6,5, Konzentration 0,2 bis 1 ,0 % w/v, MG des

Hyaluronats 1 .400 bis 2.400 kDa) in Massenverhältnis 1 :1 (Kollagenlösung zu Hyaluronatlö- sung) gemischt. Die Mischung ist dann bis zur Bildung eines Copräzipitats zu rühren. Dieses wird von der flüssigen Phase durch Zentrifugieren oder Dekantieren abgetrennt. Das

Copräzipitat ist hochadhäsiv und stellt das Klebemittel dar. Das Copräzipitat enthält 5,0 bis 15,0 % (w/w) Kollagen, 3,0 bis 10,0 % (w/w) Hyaluronsäure und 75,0 bis 92,0% Wasser. Die Abbildung 2 zeigt das IR-Spektrum eines Copräzipitats aus Atelokollagen und Na-Hyaluronat biotechnologischen Ursprungs.

Beispiel 5: Herstellung eines Klebemittels aus Kollagen und Hyaluronsäure unter Anwendung von Arginin, Calciumhydroxid und Scherkräften

Zur Optimierung der Polyionenkomplex-Stabilität mittels Arginin und Calciumhydroxid wurde das Arginin in der Kollagenlösung gelöst (0,9 g Arginin pro 100 g einer 0,8%igen

Atelokollagenlösung). Bezogen auf die Kollagenlösung wurde dann die zweifache Menge einer 0,2%igen Na-Hyaluronatlösung unter Rühren zugesetzt. Der gebildete Polyionen- komplex wurde anschließend mittels Zentrifugieren abgetrennt und unter Einwirkung von Scherkräften (Homogenisieren) mit einer 1 ,6 M Calciumhydroxidlösung bis zum erwünschten pH-Wert tropfenweise versetzt. Der optimale Bereich für die Umfangsgeschwindigkeit der Rotor-Stator-Anordnung zur Erzeugung der Scherkräfte liegt bei 2 bis 25 m/s.

Für die Messung der Adhäsivität der gemäß den Beispielen 3 bis 5 hergestellten Klebemittel im biologischen Gewebe wurde vitales Knochen- und Knorpelgewebe aus dem Schwein verwendet. Als Referenz-Klebemittel diente Fibrinkleber der Firma Baxter (TISSUCOL Duo S).

In Vorbereitung der Messung wurden mit Hilfe einer Rundstanze Zylinder von 10 mm

Durchmesser und 20 mm Länge aus der medialen und lateralen Kondyle eines

Femurknochens des Schweins gefertigt. Diese Rohstanze enthält sowohl Knochen- als auch Knorpelgewebe. Zur Anfertigung einer für die Messung verwendeten Knorpelstanze wurde die Oberfläche mit Hilfe eines Mikrotoms plan geschnitten. Für eine in den Messungen verwendete Knochenstanze wurde die Knorpelschicht komplett abgetragen. Für die Messung der Adhäsivität wurden jeweils zwei Zylinder (Knorpel oder Knochen) mittels eines Rundprobenhalters vertikal gegenüberliegend, zentriert und in einem Abstand von 5 mm in einem Kraftmessstand der Firma Zwick (Z005) angebracht. Der Ablauf der Messung stellte sich wie folgt dar.

40 μΙ des zu prüfenden Adhäsivs wurden zunächst auf der Oberfläche des unteren Gewebezylinders verteilt. Mit einer Geschwindigkeit von 10 mm pro Minute wurden dann die gegenüberliegenden Gewebeflächen gegeneinander verfahren, bis eine Kraft von 1 Newton [N] auf die Messfläche (A=0,875 cm2) wirkte. Diese Position wurde für 30 Sekunden

gehalten, bevor die beiden Messflächen mit einer Geschwindigkeit von 10 mm pro Minute wieder auseinander gezogen wurden. Der Verlauf der auftretenden Kraft über die Zeit wurde aufgezeichnet, die der vertikalen Bewegung entgegenwirkt. Der Maximalwert wurde um die Kraft korrigiert, die bei gleicher Verfahrensweise ohne Verwendung eine Adhäsivs auftritt. Die so ermittelte Kraft ist ein Maß für die Adhäsivität.

In der beschriebenen Messanordnung konnte für das erfindungsgemäß hergestellte Klebemittel gegenüber Knorpelgewebe eine Adhäsivität von durchschnittlich 15,2 kN/m ² mit einer Standardabweichung von 1 ,0 kN/m ² gemessen werden. Für Fibrinkleber lag dieser Wert im gleichen Gewebe nur bei 5,2 kN/m ² , mit einer Standardabweichung von 2,5 kN/m ² (Abb. 3A). Im Knochengewebe wurde für das Kollagen-Hyaluronsäure-Klebemittel eine Adhäsivität von 1 1 ,8 kN/m ² , mit einer Standardabweichung von 1 ,9 kN/m ² bestimmt. Für Fibrinkleber war diese mit 2,6 kN/m ² deutlich geringer, die Standardabweichung lag bei 1 ,9 kN/m ² (Abb. 3B). Die Klebewirkung der gemäß der Beispiele 3 und 4 hergestellten Klebemittel unterscheidet sich nicht, jedoch besitzt das auf Basis Atelokollagen hergestellte Klebemittel ein verringertes Allergiepotential.